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农杆菌介导的烟草转化.pptx

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农杆菌介导的烟草高效遗传转化体系研究

农杆菌介导的烟草高效遗传转化体系研究
经过 4 种侵染时间处理的实验结果表明, 侵染 3 min 时产生的抗性植株数量较少, 每块叶盘上只有 56 个再生芽; 而 6 min 和 9 min 处理的效果未见明显 不同, 每块叶盘的再生芽约为 1620 株。12 min 侵染 使得农杆菌浓度太高, 即使在 Carb 600 mg/ L 的作用 下, 外植体上会有肉眼可见的菌体污染, 甚至最后被 繁殖的农杆菌包裹, 使外植体褐化死亡。鉴于此, 建 议侵染时间选用 69 min。 2. 4 卡那霉素选择压的确定
转化技术体系, 为分子生物学和植物基因工程的研 究提供较好的技术基础。
1 材料与方法 1. 1 实验材料 1. 1. 1 植物 材料 四 倍 体烟 草 ( Nicotiana tabacum ) 品系 NT12 的无 菌 试 管 苗, 以 MS 为 基 本 培 养 基[ 3] , 附加 3% 蔗糖, pH 5. 8, 于 24 e 、自然光下培
平均阳性 植株数 ( 株/ 块)
阳性植株 频率 ( %)
1. 5 cm @ 1. 5 cm
23
7
30. 4
1. 0 cm @ 1. 0 cm
20
11
55. 0
0. 5 cm @ 0. 5 cm
4
2
50. 0
2. 2 预培养对转化率的影响 实验结果表明, 无论是经过 3 d 预培养的烟草
叶盘, 还是 未经预培养而直接 侵染的叶盘, 都约在 1421 d 后从表面创伤处及边缘出现芽点, 并逐渐长 大成为有几片幼叶的小芽。二者的分化时间、再生 芽的频率没有明显差异。所以, 为了缩短转化时间, 烟草叶盘转化可省去预培养。 2. 3 侵染时间对转化率的影响
图 2 部分转基因植株 PCR 检测结果 M: DNAmarker,K- EcoT 14I digest( TakaRa) ;

农杆菌转化法基本操作与理论课件

农杆菌转化法基本操作与理论课件

二、原理
农杆菌主要有两种：根癌农杆菌和发根农杆菌。
根癌农杆菌能在自然条件下趋化性地感染140多种双子叶 植物或裸子植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤。引发冠瘿瘤 的原因是，Ti质粒上的T-DNA上有8个左右的基因在植物细胞内 表达，指导合成一种非常寻常的化合物冠瘿碱，进而引起转化 细胞癌变。而发根农杆菌则诱导产生发状根，其特征是大量增 生高度分支的根系。根癌农杆菌的Ti质粒和发根农杆菌的Ri质 粒上有一段T-DNA，农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可 将T-DNA插入到植物基因组中。因此，农杆菌是一种天然的植 物遗传转化体系，被誉为“自然界最小的遗传工程师”。可以 通过将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感 染实现外源基因向植物细胞的转移和整合，然后通过细胞和组 织培养技术，得到转基因植物。
谢谢观看！
农杆菌介导转化法
08-1
一、简介
农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌， 它能在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤 部位，并诱导产生冠痪瘤或发状根。根想农杆菌和发根农 杆菌细胞中分别含有Ti质粒和Ri质粒，其上有一段T—DNA， 农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将T—DNA插入 到植物基因组中。因此，农杆菌是一种天然的植物遗传转 化体系。人们将目的基因插入到经过改造的T—DNA区， 借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合， 然后通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。农杆 菌介导法起初只被用于双子叶植物中，近年来，农杆菌介 导转化在一些单子叶植物(尤其是水稻)中也得到了广泛应 用。
三、操作方法
1、获取目的基因。用限制酶切割下目的基因。 2、基因表达载体的构建。将目的基因与载体（大多 数选用质粒）用DNA连接酶连接起来。 3、将目的基因导入受体细胞。将含目的基因的重组 质粒导入农杆菌（农杆菌为受体细胞）。 4、 子杂交技术/抗原-抗体杂交/个体生物学 几种方法 进行检验（根据要求选取不同方法）。 5、最后将成功表达的细胞导入植物体内，对植物体 进行个体生物学水平鉴定。

20 【终版】农杆菌介导的烟草转gfp基因(叶盘法)

20 【终版】农杆菌介导的烟草转gfp基因(叶盘法)

1 实验背景什么是“植物转基因技术”“转基因植物”？植物转基因技术：把从动物、植物或微生物中分离获得的目的基因，或者经过修饰的目的基因，通过各种方法转移重组到植物基因组内，使之稳定遗传并赋予植物新的遗传性状的方法。

转基因植物：通过植物转基因技术获得的、整合有外源基因的植物个体。

1 实验背景为什么要进行植物转基因？优势：◆农业：生产抗逆、高产、优质、抗病虫、除草剂、营养品质改良等优良性状的作物；遗传育种等。

◆制药、化工等：可作为生物反应器，生产药用蛋白和有用次生代谢物，或生产某些有机化合物等。

◆园艺：美化生活等，如蓝玫瑰等。

◆科学研究：生物学、遗传学等多领域基础研究等。

1 实验背景怎样将外源基因转入植物？间接转化法(载体介导)病毒介导法农杆菌介导法（双子叶/单子叶）种质系统介导法胚囊和子房注射法生殖细胞侵染法花粉管通道法直接转化法物理法化学法基因枪法(单子叶植物)显微注射法电击法超声波法PEG 法脂质体法1 实验背景各种转基因方法的区别是什么？（引自崔广荣，2003）1 实验背景针对不同植物，怎样选择转基因方法？目前转基因植株中，约80%以上通过“农杆菌介导转化法”获得。

植株特点首选方法备注对农杆菌敏感农杆菌介导法效率高，方法成熟，转基因植株遗传稳定。

原生质体培养容易直接转化法（如PEG 法）转化率高，可克服转基因植株嵌合体的难题。

多胚珠花粉管通道法提高转化率子房中有较大单胚珠植物(如核果类)显微注射法提高转化率转化难度大的植物基因枪法其它方法不可行时的备选放射性农杆菌发根农杆菌Agrobacterium rhizogenes根瘤农杆菌Agrobacterium tumefaciens旋钩子农杆菌1 实验背景农杆菌为什么能够介导基因转入植物？土壤农杆菌革兰氏阴性菌RiTi 质粒(tumor inducing plasmid ）约150~200 kb向植物细胞传递外源基因Ti1 实验背景农杆菌为什么能够介导基因转入植物？Vir 区:毒性区，包含多个致病基因，能激活T-DNA 的加工、剪切、复制及转入植物细胞，并使农杆菌表现出毒性。

实验四、农杆菌转化烟草和拟南芥课件

实验四、农杆菌转化烟草和拟南芥课件
遗传稳定性分析对于转基因植物的商 业化生产和应用具有重要意义。
05
CATALOGUE
实验总结
实验收获与体会
掌握了农杆菌转化法的基本 原理和操作流程。
了解了烟草和拟南芥作为实 验材料的优缺点。
02
01
03
学会了如何进行抗性筛选和 分子检测验证转基因植株。
培养了实验操作技能和团队 合作精神。
04
05
等方法进行评估。
表型分析对于筛选具有优良性状的转基 因植株具有重要意义。
转化细胞的遗传稳定性分析
转化细胞的遗传稳定性分析是评估转 基因植物遗传物质稳定性的重要步骤 。
一般情况下，经过多次繁殖后，转化 细胞或转基因植株仍能保持稳定的遗 传特性，则认为遗传稳定性较好。
通过连续繁殖转化细胞或转基因植株 ，并定期进行PCR检测和表型分析， 可以观察遗传物质的变化情况。
其他试剂
如抗生素、质粒 DNA等。
农杆菌转化烟草和拟南芥
01
02
03
04
将外源基因克隆到农杆菌的质 粒载体上。
将重组质粒转化到农杆菌中。
将农杆菌接种到植物受体材料 上。
在培养条件下培养植物受体材 料，使农杆菌与植物细胞相互
作用并导入外源基因。
基因枪法转化植物细胞
胞，促 进其再生和表达外源 基因。
实验原理
植物基因工程简介
植物基因工程是通过改变植物 的遗传物质来改良植物性状的 一门科学。
它利用基因工程技术将外源基 因导入植物细胞，并在植物细 胞内表达，从而获得具有优良 性状的转基因植物。
植物基因工程的应用范围广泛 ，包括抗虫、抗病、抗除草剂 、提高产量、改良品质等。
农杆菌的特性
农杆菌是一种土壤细菌，属于根瘤菌科。

实验四、农杆菌转化烟草和拟南芥17页

实验四、农杆菌转化烟草和拟南芥17页
选择标记基因与报告基因
必备条件： 编码一种不存在于正常植物细胞中的酶 基因较小 能在转化体中得到充分表达 检测容易，并且能定量分析 选择标记基因与筛选标记基因： npt-II 新霉素磷酸转移酶基因（卡那，新霉素，G418），aat（链霉素，壮观霉 素），spe（壮观霉素），strl（链霉素），cat（氯霉素），bar（草苷膦） 报告基因：report gene（筛选标记之一） 在转化系统中通过瞬时及稳定表达检测来确定转化的DNA顺序（基因）是否能 在转化细胞中得到表达，起到报告的作用。 gus基因（β-葡萄糖苷酸酶基因），gfp（绿色荧光蛋白基因） 转化目的基因可以省略附加的报告基因，但选择标记基因是不可缺少的。
总之，T-DNA的整合是通过植物靶DNA和T-DNA间短的同源区段 发生重组而完成的，在接口附近伴有DNA顺序的转换和重复。
真空浸透法转化拟南芥
• 拟南芥种子消毒与萌发，播种后生长出现花蕾后打顶，待侧枝长出花蕾后，侵染前 受体材料 一天去除已开花蕾和果荚
• 接种含有表达载体的农杆菌GV3101克隆于5 mL YEP液体培养基(Rif 100 μg/mL， 接种 Kan 50 μg/mL)中，28 °C，200 rpm振荡培养过夜
T-DNA整合植物基因组的分子机理
T-DNA在植物染色体中的插入是随机的，可插入任何一条染色体。 插入位点特点： T-DNA优先整合到转录活跃的植物基因位点 T-DNA与植物DNA连接处富含A-T碱基对 植物DNA上的插入靶位点与T-DNA边界序列有一定程度的同源性。 但在T-DNA的整合过程中常有植物基因组靶序列的缺失、倒位和重复 等现象，T-DNA的整合一定程度上依赖于植物内源重组系统。
• 将拟南芥花蕾倒置于装有花浸染缓冲液的烧杯中，烧杯放置在真空罐中，0.5Mbar抽 转化 真空10 min

烟草转化方案

烟草转化方案

利用农杆菌侵染烟草进行体内瞬时表达的方法[精华提要]通常，我们可以利用烟草的瞬时表达系统来观察感兴趣蛋白的亚细胞定位（通过与绿色荧光蛋白构成融合蛋白）。

同时，还可以检测蛋白的表达量。

这一个过程是通过农杆菌作为一个工具将目的基因整合到到烟草的细胞内的。

材料与试剂1. 携带表达载体的农杆菌菌株（通常表达载体由35S启动子驱动）2. 2-4周的烟草植株3. LB培养基4. 乙酰丁香酮5. 2-(N-吗啉代) 乙磺酸6. 抗生素7. 注射器工具1. 50ml离心管2. 光谱仪3. 紫外灯4. 荧光显微镜步骤：1. 挑取单克隆于5mlLB液体培养中，28-30°C震荡培养。

通常，LB中加入100ug/ml 庆大霉素（农杆菌株GV3101携带抗性），50ug/ml大观霉素（载体携带）。

2. 将1ml过夜培养的农杆菌转接到25mlLB液体培养基中（加有与1相同的抗生素，另外加入高压灭菌的乙酰丁香酮）。

3. 检测过夜培养的菌液OD600的值。

4. 5000g，15分钟集菌，用重悬液重悬菌体，最终OD600为0.4。

5. 室温放置2-3h后注射烟草。

6. 将侵染液装入5ml注射器内，用拇指按压注射器反板将液体从叶片下表皮注射到烟草叶片内（勿使用子叶）。

注射后，烟草叶片会出现湿润的现象。

7. 注射后2-5天，在便携式长波长紫外灯下检测GFP荧光信号（只适用于荧光很强的叶片）。

8. 通过荧光显微镜或者激光共聚交荧光显微镜检测GFP信号。

同时，可以提取蛋白，检测蛋白的含量。

配方1. 加有相应抗生素的LB液体培养基（一种抗生素是菌株携带，一种为载体携带）。

2. 乙酰丁香酮（100mM 溶于乙醇，-20°C储存）。

3. 1M MgCl24. 重悬液(10mM MgCl2,10mM 2-(N-吗啉代) 乙磺酸(pH5.6)高温高压灭菌15分钟，100uM 乙酰丁香酮，高温高压灭菌)。

5. 乙酰丁香酮（来自Aldrich）：又名3’,5’-二甲基-4’-羟基苯乙酮，或4’-羟基-3’,5’-二甲基苯乙酮。

农杆菌介导的烟草高效遗传转化体系的建立

农杆菌介导的烟草高效遗传转化体系的建立

１ 材 料 与 方 法
１ １ 试 验 材 料 ．
再转入 ＭＳ 培养基 中进行筛选培养。 １２ ５ 农杆菌和外植 体共培养 时问的确定 ．．
以烟草 品种 中烟 １０为试验材料 ， ０ 种子浸
将侵入 后的化培养基中 ， 分别 暗培养 １２ ３ ４ｄ 然后 、 、 、 ，
证 。 由 图 ４可 知 ， 被 检 测 的 Ｐ Ｒ 阳性 苗 中 ， Ｒ 在 Ｃ 经 Ｔ—Ｐ Ｒ Ｃ
３ ０日龄的烟草刚长出 ４～ ５片小叶片 ， 由于叶盘 太幼嫩 ， 在农杆菌溶 液中浸染容易染菌死亡 ；０日龄 、２ ８ １０日龄 的烟草
叶片已经变成深 绿色 ， 叶片 比较大 ， 虽然在后期浸染过程中抗 菌能力较强 ， 但是浸染效果 差 ， 响转化效率 ； 影 对照组 中 ４个
中图分类 号 ： ５ ２０ ２ ￥７ ．３ 文献标志码 ： Ａ 文章编号 ：０ ２—１０ （０ １ ０ ０６ ０ １０ ３ ２ ２ １ ）３— ０ ７— ２
１２ ． 试 验 方 法
由于烟草 的组织培养简单 、 因转化效率较高等优点 ， 基 烟
草成 为 植 物基 因 工程 和 分子 生 物 学研 究 中重 要 的模 式 植 物 。 。自从 Ｈ ｒ ｏｓ ｈ等首次获 得烟草转 基 因植 株 以来 ， 以 烟 草为材料 的转基因技术 为基 因功能分 析提供 了有 效途径 ， 同时使植物遗传转化的研究 和应用得到飞速发展。在植 物基 因工程 中， 目前研究最清楚 、 应用最广泛的外源基因转化 方法
２ 结果 与分 析
作者简介 ： 莉 （９ ５ ） 女， 赵 １ ８一 ， 河南鹤壁 人 ， 士研 究生 ， 要从事 硕 主
细胞 分子生 物学方 面的研究 。Ｅ—ｍ ｉ： ａｚａ３ ６ ６ ．ｏ ａｌｚ ｏｈｏ３ ＠１３ ｃｍ。 ｈ

农杆菌介导的烟草转化

农杆菌介导的烟草转化

农杆菌介导的烟草转化农杆菌介导的烟草转基因技术一、实验目的了解转基因的基本原理及操作方法。

二、基本原理根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）是一种能诱发植物产生肿瘤的细菌，根癌农杆菌中含有诱导植物产生肿瘤的质粒（Tumor inducing plasmid），简称为Ti质粒。

野生型农杆菌的Ti 质粒，含有两个与致瘤有关的区域：一个是T-DNA区（transferred DNA region），含致瘤基因；另一个是毒性区（Virulence region），在T-DNA的切割、转移与整合过程中起作用。

农杆菌可将T-DNA插入到植物基因组中，并且可以通过减数分裂稳定地遗传给后代。

我们将目的基因插入到经过改在的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然后通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。

三、材料1、植物材料：烟草无菌苗2、农杆菌与载体：EHA105；PBI121四、方法步骤1、试剂的配制（1）LB固体培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，琼脂8g/L。

（2）液体MS/MT培养基PH：5.8-6.0 （3）烟草共培养培养基：固体MS培养基（4）烟草筛选培养基：MS +（2.0mg/L）6-BA + （0.3mg/L）NAA + （30g/L）蔗糖+ （400mg/L）头孢霉素+ （50mg/L）卡那霉素+ （7.5g/L）琼脂PH：5.8-6.0（5）烟草生根培养基：固体MS培养基2、农杆菌侵染菌液的制备方法：（1）超净工作台紫外灯灭菌15min，接种环酒精灯灼烧灭菌备用（2）铺皿：LB（50mg/L卡那霉素+25mg/L利福平）（3）划线：用接种环沾取预转化的农杆菌菌液于铺好的培养基划“之”字或者“#”字（4）封皿，做标记（5）28℃恒温培养1d-2d（6）用无菌刀刮取适量菌体于50mL液体MS培养基中，28℃，180r/min震荡培养1-2h至均匀悬浮液，紫外分光光度计测量菌液的OD600值，用液体MS调整浓度至OD600值约为0.8-1.0为宜，备用。

农杆菌介导的Thaumatin基因转化烟草的研究

农杆菌介导的Thaumatin基因转化烟草的研究

ｆ ｏ ｒ ｍｅ ｄ ｂ ｙ Ａ ｇ ｒ ｏ ｂ ａ ｃ ｔ ｏ ｒ ｉ ｕ ｍ ｔ ｕ ｍ ｅ ｆ ａ ｃ ｉ ｅ ｎ ｓ ｍ ｅ ｄ ｉ ａ ｔ ｅ ｄ ｇ ｅ ｎ ｅ ｔ ｉ ｃ ｔ ｒ ａ ｎ ｓ ｆ ｏ ｒ ｍａ ｔ ｉ ｏ ｎ ．Ｔ ｈ ｅ ｔ ｒ ａ ｎ ｓ ｆ ｏ ｒ ｍ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｅ ｆ ｉ ｆ ｃ ｉ ｅ ｎ ｃ ｙ ｗ ａ ｓ ａ ｆ ｆ ｅ ｃ ｔ ｅ ｄ ｂ ｙ ｓ ｅ ｖ ｅ ｒ ａ ｌ ｆ ａ ｃ ｔ ｏ ｒ ｓ ，
江西农业学报
２ ０ １ ３ ， ２ ５ （ ７ ） ： ５ ０— ５ ２
Ａｅ ｔ ａ Ａｇ ｒ ｉ ｃ ｕ ｈ ｕ ｒ ａ ｅ Ｊ ｉ ａ ｎ ｇ ｘ ｉ
农杆菌介导的 Ｔ ｈ ａ ｕ ｍａ ｔ ｉ ｎ基 因转 化 烟 草 的研 究
崔波 ， 蒋素华 ， 田云芳 ， 武振江 ， 袁秀云 ， 马杰
Ｃ Ｕ Ｉ Ｂ ｏ ， Ｊ Ｉ Ａ Ｎ Ｇ Ｓ ｕ—ｈ ｕ ａ ， Ｔ Ｉ Ａ Ｎ ＹБайду номын сангаасｕ ｎ— ｆ ａ ｎ ｇ ， ＷＵ Ｚ ｈ ｅ ｎ— ｊ ｉ ａ ｎ ｇ ２ ， Ｙ Ｕ Ａ Ｎ Ｘ ｉ ｕ— ｙ ｕ ｎ 。 ， ＭＡ Ｊ ｉ ｅ （ １ ．Ｂ ｉ ｏ ｅ ｎ ｇ ｉ ｎ ｅ ｅ ｒ ｉ ｎ ｇ Ｒ ｅ ｓ ｅ ａ ｒ ｃ ｈ Ｉ ｎ ｓ ｔ ｉ ｔ ｕ ｔ ｅ ， Ｚ ｈ ｅ ｎ ｇ ｚ ｈ ｏ ｕ Ｎ ｏ ｒ ｍａ ｌ Ｕ ｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ｙ ，Ｚ ｈ ｅ ｎ ｇ ｚ ｈ ｏ ｕ ４ ５ ０ ０ ４ ４ ，Ｃ ｈ ｉ ｎ ａ ； ２ ．Ｃ ｏ ｌ ｌ ｅ ｇ ｅ ｏ ｆ Ｌ ｉ ｆ ｅ Ｓ ｃ ｉ ｅ ｎ ｃ ｅ ， Ｈ ｅ ｎ ａ ｎ Ａ ｇ ｉ ｒ ｃ ｕ ｌ ｔ ｕ ｒ ａ ｌ Ｕ ｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ｙ ， Ｚ ｈ ｅ ｎ ｇ ｚ ｈ ｏ ｕ ４ ５ ０ ０ ０ ２ ， Ｃ ｈ ｉ ｎ ａ ） Ａ ｂ ｓ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ ： Ｔ ｏ ｂ ａ ｃ ｃ ｏ ｌ ｅ ａ ｖ ｅ ｓ ｕ ｎ ｄ ｅ ｒ ｄ ａ ｒ ｋ ｃ ｕ ｌ ｔ ｕ ｒ ｅ ｆ ｏ ｒ ３ ｄ ａ ｙ ｓ ｗ ｅ ｒ ｅ ｕ ｓ ｅ ｄ ａ ｓ ｒ ｅ ｃ ｅ ｐ ｔ ｏ ｒ ，ａ ｎ ｄ ｔ ｈ ｅ ｏ ｂ ｊ ｅ ｃ ｔ ｉ ｖ ｅ ｇ ｅ ｎ ｅ Ｔ ｈ ａ ｕ ｍ ａ ｔ ｉ ｎ ｗ ａ ｓ ｔ ｒ ａ ｎ ｓ —

农杆菌介导的烟草转化

农杆菌介导的烟草转化

准备菌液LB 300ml(加抗生素Kan,Rif)
1L MS, 分装300ml (SIM,无抗生素20个平板)，500ml(SIM,有抗生素，倒培养瓶)，200ml（液体，做悬浮液）
Kan,Rif / Basta,Rif
1.根癌农杆菌的活化
挑取单菌落，接种于含抗生素的LB 液体培养基（Rif 50μ g/ml和Kan 50-100μg/ml）中，28℃-30℃200rpm 振荡培养过夜。

2.农杆菌介导叶盘法转化植物
①农杆菌菌体处理
挑取农杆菌菌株接种于LB培养基中（含rif 50μg/ml和kan50μg/ml），200rpm，28℃培养24h，菌液OD600至1.0 左右，离心10min（3000rpm），沉淀菌体。

再用10ml左右的MS液体培养基悬浮，稀释菌体的OD600值为0.3-0.5。

②叶盘法转化转化植物程序
选取理想状态的外植体，在超净台上剪成小方块或者打成叶圆片（大小不限），在制备好的农杆菌菌液中浸染3-5min，置于无菌吸水纸吸干，平铺于SIM （MS+1mg/L6-BA+0.1mg/LNAA）培养基（无抗生素）上黑暗共培养2 天，2天后将外植体转移至含筛选因子的芽诱导培养基如SIM（MS+1mg/L6-BA+0.1mg/LNAA+Basta 5mg/L+500μg/ml的carb素或500Cef）上进行筛选。

待有芽生成（3~4周）后，继续培养到苗高2~3厘米时，转入生根培养基RIM（MS+ kan50μg/ml+500μg/ml的羧卞青霉素或500Cef）上，进行根诱导生长。

Cb: 羧卞青霉素; Cef:头孢霉素。

农杆菌注射烟草转化

农杆菌注射烟草转化

农杆菌注射烟草转化
农杆菌注射烟草实验步骤
农杆菌转化
1. 取1μl 质粒加入50μl 刚冻解的农杆菌感受态中（提前准备1mlLB 培养液，1.5ml 灭菌管，电击杯，移液枪，枪尖等）。

★感受态易失效，准备工作须充分
2. 吸取菌液打入电击杯，（不要产生气泡），放入电击仪（调manal 至1.6-1.7）。

3. 电击完立即加入1mlLB 培养基，混匀，并吸至新的离心管中。

4. 28℃，摇2h （过程中可以准备抗性板子，或提前准备）。

5. 涂板，（使用kan+rif 双抗板）28℃培养36h 。

6. 可做菌落PCR 检测是否转化成功，同时做菌种保藏（根据实验需要）。

接菌注射
1. 挑菌转接
3ml 双抗培养基，27℃摇菌过夜。

★玻璃试管摇菌效果要好些
2. 取20μl 菌液到20 mlLB 培养基中，（20mlLB + 100ml/L MES + 20μmol/L AS +500μlkana/L ）摇菌过夜至OD 值为1.0-1.5。

●不加Rif ★准备两份，最后调OD 值会用到。

3. 3560r/min ,10min 弃上清。

4. 配缓冲液MMA （H 2O+MES 10ml +MgCl 2 10ml +AS 1ml ）,现配现用。

用等量缓冲液重悬菌液。

一份等量，一份少量
5. 调菌液OD 值至1.0，室温放置1h 。

将需要混合的菌液等体积混合，可注射。

农杆菌介导的转化方法PPT学习教案

农杆菌介导的转化方法PPT学习教案
11共培养法共培养法包括原生质体共培养悬浮细胞共培养和愈伤组织共培养22叶圆盘法叶圆盘法3活体接种法农杆菌转化的方法cointegrationmethod生根2
农杆菌介导的转化方法
会计学
1
① Ti质粒
存在于能引起植物形成冠瘿瘤的农杆菌中，诱导双 子叶冠瘿瘤形成，又称肿瘤诱导质粒（tumor inducing plasmid）。
第9页/共10页
④农杆菌转化的方法
1、共培养法
包括原生质体共培养、悬浮细胞共培养和愈伤组织共培养。
2、叶圆盘法 3、活体接种法
第6页/共10页
1.共培养法
The co-integration method
第7页/共10页
2.叶盘转化法
农杆菌共培养侵染 愈伤组 织 分化生 芽
生根
第8页/共10页
3 . 活 体 接 种 法
第三步 毒性基因（vir）表达 virA、virG、virD、virB…
第四步 T-DNA转移 T-DNA被vir基因产物切下来，并运送到植物细胞 核里，整合到植物基因组中。
第五步 诱导冠瘿瘤
T-DNA上的产物催化产生过量的生长素和 细胞分裂素，形成植物冠瘿瘤。
第六步 土壤农杆菌代谢冠瘿碱。
第5页/共10页
根瘤
第1页/共10页
第2页/共10页改造后的Ti质粒载体模式Fra bibliotekori
第3页/共10页
4
② 农杆菌的感染和生存
第一步:植物受伤
植物受伤后能分泌酚类化合物（如乙酰丁 香酮、羟基乙酰丁香酮），诱导Ti质粒上 的毒性基因表达。
第二步 感染植物
农杆菌吸附于植物的表面伤口部位（常在茎 的基部）。
第4页/共10页

农杆菌转化法ppt课件

农杆菌转化法ppt课件
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农杆菌介导转化法

一、简介
农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌， 它能在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤 部位，并诱导产生冠痪瘤或发状根。根想农杆菌和发根农 杆菌细胞中分别含有Ti质粒和Ri质粒，其上有一段T—DNA， 农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将T—DNA插入 到植物基因组中。因此，农杆菌是一种天然的植物遗传转 化体系。人们将目的基因插入到经过改造的T—DNA区， 借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合， 然后通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。农杆 菌介导法起初只被用于双子叶植物中，近年来，农杆菌介 导转化在一些单子叶植物(尤其是水稻)中也得到了广泛应 用。
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三、操作方法
1、获取目的基因。用限制酶切割下目的基因。 2、基因表达载体的构建。将目的基因与载体（大多 数选用质粒）用DNA连接酶连接起来。 3、将目的基因导入受体细胞。将含目的基因的重组 质粒导入农杆菌（农杆菌为受体细胞）。 4、目的基因的检测与鉴定。用DNA分子杂交技术/分 子杂交技术/抗原-抗体杂交/个体生物学 几种方法 进行检验（根据要求选取不同方法）。 5、最后将成功表达的细胞导入植物体内，对植物体 进行个体生物学水平鉴定。
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二、原理
农杆菌主要有两种：根癌农杆菌和发根农杆菌。
根癌农杆菌能在自然条件下趋化性地感染140多种双子叶 植物或裸子植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤。引发冠瘿瘤 的原因是，Ti质粒上的T-DNA上有8个左右的基因在植物细胞内 表达，指导合成一种非常寻常的化合物冠瘿碱，进而引起转化 细胞癌变。而发根农杆菌则诱导产生发状根，其特征是大量增 生高度分支的根系。根癌农杆菌的Ti质粒和发根农杆菌的Ri质 粒上有一段T-DNA，农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可 将T-DNA插入到植物基因组中。因此，农杆菌是一种天然的植 物遗传转化体系，被誉为“自然界最小的遗传工程师”。可以 通过将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感 染实现外源基因向植物细胞的转移和整合，然后通过细胞和组 织培养技术，得到转基因植物。
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MS +（2.0mg/L）6-BA + （0.3mg/L）NAA + （30g/L）蔗糖 + （400mg/L）头孢霉素 +
（50mg/L）卡那霉素 + （7.5g/L）琼脂
PH：5.8-6.0
5 烟草生根培养基：固体 MS 培养基
2、农杆菌侵染菌液的制备方法：
1 超净工作台紫外灯灭菌 15min，接种环酒精灯灼烧灭菌备用
2 铺皿：LB（50mg/L 卡那霉素+25mg/L 利福平）
3 划线：用接种环沾取预转化的农杆菌菌液于铺好的培养基划“之”字或者“#”字
4 封皿，做标记
（5）28℃恒温培养 1d-2d
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（6）用无菌刀刮取适量菌体于 50mL 液体 MS 培养基中，28℃，180r/min 震荡培养 1-2h 至 均匀悬浮液，紫外分光光度计测量菌液的OD600值，用液体MS 调整浓度至OD600值约为0.8-1.0 为宜，备用。 3、外植体的制备
农杆菌介导的烟草转基因技术
一、实验目的
了解转基因的基本原理及操作方法。
二、基本原理
根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）是一种能诱发植物产生肿瘤的细菌，根癌农 杆菌中含有诱导植物产生肿瘤的质粒（Tumor inducing plasmid），简称为 Ti 质粒。野生型农 杆菌的 Ti 质粒，含有两个与致瘤有关的区域：一个是 T-DNA 区（transferred DNA region）， 含致瘤基因；另一个是毒性区（Virulence region），在 T-DNA 的切割、转移与整合过程中起 作用。农杆菌可将 T-DNA 插入到植物基因组中，并且可以通过减数分裂稳定地遗传给后代。 我们将目的基因插入到经过改在的 T-DNA 区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞 的转移与整合，然后通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。
三、材料
1、植物材料：烟草无菌苗
2、农杆菌与载体：EHA105；PBI121
四、方法步骤
1、试剂的配制
1 LB 固体培养基：胰蛋白胨 10g/L，酵母提取物 5g/L，氯化钠 10g/L，H：5.8-6.0
3 烟草共培养培养基：固体 MS 培养基
4 烟草筛选培养基：
从共培养基上取下叶片，预 400mg/L 的头孢水中浸泡 5min，浸泡两次，然后用无菌水 清洗三次，无菌滤纸吸干叶片表面的水分，接种于筛选培养基上，25℃光培养，期间每 20d 继代一次，直至再生出芽。此时将再生芽切下置于生根培养基上诱导生根。
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准备生长 20d 健壮的烟草无菌苗，挑选接近植株顶端，完全舒展开且较大的叶片。将叶 片平铺在无菌滤纸上，左手拿镊子，右手拿刀。用镊子固定叶片，刀片切去也边缘和叶脉， 然后将叶片切成 5mm×5mm 的正方形，备用。 4、侵染与共培养
取制备好的侵染菌液 50mL 于三角瓶中，将切好的烟草叶片进入其中，摇晃使菌液与叶 片充分接触，侵染 10min，期间摇晃三角瓶数次。然后用镊子将叶片夹出，放在无菌滤纸上， 吸干其表面的菌液，接种于共培养基上，于 25℃培养室暗培养 3d。 5、筛选培养和生根培养