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第十三章腺病毒科（Adenoviridae）腺病毒是1953年Rowe等在用扁桃体组织块培养物分离“感冒病毒”的过程中，发现在组织块长出的新组织中，还没有接种病料，就逐渐出现细胞病变。
引起这种细胞病变的因子就是后来证明的人的1、2、5、6型腺病毒。
翌年，Hilleman等（1954）从急性呼吸道疾病患者的咽喉洗液中也分离到同样的病毒。
此后，相继由人、猴、牛、猪、马、犬、羊、小白鼠和鸡分离出将近80个血清型的腺病毒。
1956年，Enders等根据病毒经常存在于腺体，且第一次就是在腺体组织中分离获得的事实，提出了“腺病毒”这一名称，这一建议随后为国际病毒命名委员会所接受。
腺病毒在病毒学中的重要性有五个方面：第一，它可引起人类许多急性感染，包括流感样疾病，急性咽炎，婴幼儿致死性肺炎，结膜炎，角膜结膜炎，膀胱炎以及严重的肠炎等；第二，它可引起人类扁桃体、腺样体和其它淋巴组织的隐性持续性感染；第三，迄今所研究的腺病毒均可使非许可性鼠细胞发生转化，有些型别甚至在新生地鼠和小鼠有致癌性；第四，腺病毒是研究真核基因表达的良好模型，这是因为腺病毒易于培养和纯化，在感染过程中可以产生大量的病毒RNA。
其次，它的基因组具有中等程度的复杂性，其复制与转录依赖于细胞的聚合酶，所以，在病毒基因的表达控制方面，可以模拟宿主细胞的基因表达机制，腺病毒基因组可称为一个微型染色体，实际上很多真核基因的结构与表达调控机制，是从研究腺病毒获得的；第五，它是缺损性DNA病毒――腺联病毒的辅助病毒。
第一节腺病毒科的分类与毒粒结构一、腺病毒的分类腺病毒在自然界分布广泛，迄今所知至少有93个型别，腺病毒科可分为哺乳动物腺病毒属(Mastadenovirus)和禽腺病毒属(Aviadenovirus）两个属。
其成员均为脊椎动物腺病毒。
（一）哺乳动物腺病毒属根据其毒粒结构、生物学、生化和免疫学特性，哺乳动物腺病毒又可分为A～F6个亚属。
人腺病毒有49个型，以h1～49表示，分属于6个亚属中；猴腺病毒有27个型，牛腺病毒至少12个型，猪4个型，马1个型，犬2个型，羊5个型以及小鼠2个型。
腺病毒病因临床表现及治疗原则一、腺病毒的病因腺病毒是一种引起呼吸道感染和其他疾病的常见病原体，主要通过飞沫传播引起感染。
腺病毒感染通常在冬春季节较为流行，特别是在幼儿园、学校等集中人群的场所更易传播。
腺病毒感染还可通过接触受污染的物品表面传播，因此好的个人卫生习惯是预防腺病毒感染的重要措施之一。
二、腺病毒的临床表现1.上呼吸道感染：腺病毒感染可引起流感样症状，如发热、咳嗽、流涕、喉痛等。
轻者症状可不明显，重者可发展为支气管炎或肺炎。
2.结膜炎：腺病毒引起的结膜炎症状包括眼睑水肿、充血、异物感和分泌物增多等。
3.脑膜炎和脑炎：腺病毒感染在极少数情况下可引起脑膜炎和脑炎，表现为剧烈头痛、呕吐、抽搐等严重症状。
4.其他系统感染：腺病毒感染还可引起心肌炎、肌炎等其他系统感染，临床表现多样。
三、腺病毒的治疗原则1.对症治疗：针对腺病毒感染引起的症状，如发热、咳嗽等，可以适当使用退烧药和止咳药进行缓解。
2.抗病毒治疗：目前尚无特效的抗腺病毒药物，但部分抗病毒药物如奥司他韦等可在早期感染时使用，有助于减轻症状和缩短病程。
3.支持疗法：重视患者的休息和营养，保持室内空气清新，加强个人卫生。
对于合并其他并发症的病例，需根据具体情况进行相应的处理。
4.注意隔离：对于疑似或确诊的腺病毒感染患者，应加强隔离措施，避免传播给他人。
5.预防措施：注重个人卫生、保持良好的生活习惯，避免密切接触已感染者和密集人群，定期通风、勤洗手等措施有助于减少腺病毒感染的风险。
综上所述，腺病毒感染是一种临床常见的呼吸道感染病原体，了解其病因、临床表现和治疗原则对于及时有效地应对疾病具有重要意义，希望本文能对相关知识有所帮助。
腺病毒载体过表达基因的流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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腺病毒载体过表达基因的流程英文回答：The process of overexpressing a gene using anadenovirus vector involves several steps. First, the target gene of interest is cloned into a plasmid vector that contains the necessary elements for replication and expression in mammalian cells. This plasmid is then transfected into a packaging cell line that provides the necessary adenoviral proteins for viral particle production.Once the packaging cell line is transfected with the plasmid, it undergoes a series of replication and recombination events to generate recombinant adenoviral DNA. This DNA is then packaged into viral particles, which are released from the packaging cells and harvested.The harvested viral particles can be used to infect target cells of interest. The viral particles enter the target cells and release their DNA, which is thentransported to the nucleus. Once in the nucleus, the viral DNA is transcribed into mRNA, which can be translated into the desired protein.To ensure efficient overexpression of the gene, a strong promoter is usually used in the plasmid vector. Additionally, regulatory elements such as enhancers and polyadenylation signals may be included to enhance gene expression. The choice of promoter and other regulatory elements depends on the specific requirements of the experiment or application.Once the target gene is overexpressed in the infected cells, its effects can be studied. For example, if the gene encodes a protein involved in a specific cellular pathway, the overexpression can be used to investigate the function of that pathway. Alternatively, the overexpression of a therapeutic gene can be used to evaluate its potential for gene therapy applications.Overall, the process of overexpressing a gene using an adenovirus vector involves cloning the gene into a plasmidvector, transfecting the vector into a packaging cell line, harvesting and purifying the viral particles, infecting target cells, and studying the effects of gene overexpression.中文回答：腺病毒载体过表达基因的流程包括多个步骤。
腺病毒的制备
简介：
腺病毒(adenovirus)是一种无包膜的线状双链DNA病毒，基因组长约36kb。
基因组上分布着4个早期转录子（E1、E2、E3、E4）承担调节功能，以及一个晚期转录子负责结构蛋白的编码。
其中，E1的缺失可造成病毒在复制阶段的流产，重组腺病毒必须在293细胞等表达E1蛋白的细胞系中包装；E3为复制非必须区，影响病毒的免疫逃逸，其缺失则可以大大地扩大插入容量。
腺病毒在自然界分布广泛，至少存在100种以上的血清型。
目前的腺病毒载体大多以5型（Ad5）、2型（Ad2）为基础。
腺病毒载体转基因效率高，体外实验通常接近100％的转导效率；可转导不同类型的人组织细胞，不受靶细胞是否为分裂细胞所限，甚至包括来自高度分化的组织中的细胞，例如骨骼肌细胞，肺细胞，神经细胞和心脏细胞；容易制得高滴度病毒载体；进入细胞内并不整合到除卵细胞外的宿主细胞基因组中，仅瞬间表达，安全性高。
腺病毒载体已成为继逆转录病毒载体之后广泛应用且最具前景的病毒载体。
基本概念：
RCA：
在扩增或制备复制缺陷型腺病毒时会产生复制型腺病毒（replication competent adenoviruses，RCA），RCA是因为重组腺病毒的基因组与293基因组的E1同源序列间发生重组而产生的。
这就导致目的基因丢失而被E1区代替。
具体表现是在本不支持病毒载体复制的细胞株（如A549细胞）上产生病毒的复制和扩增。
实验证明，复制型腺病毒(RCA) 数量随着腺病毒载体在293细胞上的传代次数的增加而增加。
RCA在其宿主细胞中可以自主复制和扩增，因此RCA的产生会严重干扰重组腺病毒载体的使用效果和带来安全隐患。
要避免RCA出现，以下两点非常必要：
1）对原始毒种进行1~3轮空斑纯化；
2）尽量减少腺病毒在293细胞上的传代次数，建议建立至少两级病毒种子库。
（尤为重要：一旦毒种中发现了RCA，建议重新重组出毒。
）
各种常用病毒单位的含义：
VP：病毒颗粒（viral particle），是“活”（有感染性）和“死”（无感染性）的腺病毒颗粒的总量。
在体内实验中，它代表了进入肌体可能引起宿主针对腺病毒的免疫反应的腺病毒颗粒总量。
测定方法是OD260法，只有经过纯化的腺病毒才能通过此方法测定VP/ml值。
PFU：空斑形成单位（plaque formation unit），是有感染性的“活”的腺病毒的总量，即腺病毒得活性单位。
测定方法是将腺病毒样品经过一系列梯度稀释后，感染293细胞并培养，通过计算细胞病变空斑数得到腺病毒样品中PFU/ml值。
IU：感染单位（infectious unit），和PFU一样，是另一种腺病毒活性单位。
测定方法是TCID50法。
VP/PFU或VP/IU的值是判断腺病毒纯品中活病毒所占比例的重要依据。
如果该病毒产品要用于人体实验，按中国生物制品质量要求，该比值应该在33以下。
用于普通实验研究，该比值要求可以适当放宽。
操作细节：
腺病毒的保存：
避免反复冻融，分装后液氮速冻，于-70℃保存，建议不要在-20℃下长期保存。
腺病毒解冻后最好保持在冰浴中，并尽快使用。
如果解冻后的病毒一时用不完，滴度足够高时（比如1011~12VP/ml），4℃可保存1~2周。
另外，保存病毒的缓冲液保持在pH8.0对维持滴度非常重要。
腺病毒载体在体外实验（in vitro）中应注意的问题：
1）由于细胞表面受体的差异，腺病毒载体在不同的细胞中转导效率不同。
可根据文献报道或用带报告基因的腺病毒载体判断病毒用量。
2）在细胞处于对数生长期时感染病毒效果较好。
避免在消化细胞后立刻感染病毒，因为此时细胞膜上的病毒受体往往受到了暂时的破坏。
培养过夜后再感染病毒，效果较好。
3）选择适当的转导MOI（病毒感染单位数/细胞数），可以在MOI为0.1~1000范围内进行试验( 10倍比稀释)。
4）感染病毒时细胞培养液的体积尽量小一些，以完全覆盖细胞为准。
如24孔板可用200ul，6孔板1ml。
5）感染时间为90-120分钟，即感染实验时，用尽量少的培养液覆盖细胞，接毒后2小时再补充足够的培养基。
（可选：每15分钟轻轻晃动培养液一次，以混匀。
）
6）选择适当表达检测时间，一般感染病毒24h后就能检测到目的基因的表达，48小时表达达到较高水平。
下面按AdEasy TM腺病毒载体表达系统简述腺病毒的构建与制备流程：
1．将基因克隆入穿梭载体（shuttle）。
（其中，pShuttle不含有启动子和polyA，pShuttle-CMV含有CMV启动子和polyA）
另外，还有pAdTrack-CMV载体，载体内有两套启动子和polyA，可根据GFP的表达跟踪目的基因的表达情况。
2．PmeI酶切构建好的shuttle质粒，电泳鉴定回收线性化的质粒。
3．线性化的质粒转化入BJ5183-AD-1感受态细胞（预先转化入了pAdEasy-1基因组DNA），Kan抗性的LB平板上篮白斑筛选。
4．挑选直径偏小的白色菌落，摇菌过夜，小量纯化大质粒（不能用普通试剂盒）。
5．取1/5~1/2体积小量纯化后的质粒用PacI酶切检测，用重组前的shuttle质粒作酶切对照。
0.8%的琼脂糖凝胶电泳。
（如下图所示，4为重组前的shuttle质粒，5为pAdEasy-1基因组DNA，6为重组后的质粒。
重组后的质粒经PacI酶切后，通常得到约30kb大片段和3.0kb或4.5kb的小片段）
6．将鉴定为重组阳性的质粒阳转入DH5α感受态。
大量提取。
7．PacI酶切后，酚-氯仿抽提，乙醇沉淀回收，脱盐，无菌去离子水溶解。
8．按照5ug线性化质粒/35mm dish的比例用jetPEI转染试剂转染293A细胞。
9．培养7—14天，35mm dish中的转染后细胞出现CPE效应（细胞变圆飘起，细胞核区明显膨大）。
收取原代病毒（107~8pfu/ml）：旧培养基重悬所有细胞，液氮/37o C反复冻融4-7次。
12，000rpm收上清。
分装后冻存于-80o C。
10．扩增病毒：向5×106个293A细胞（100mm培养皿，~60%汇度）中加入0.5ml 原代病毒保存液，加入培养基至1ml，混匀。
37℃CO2培养箱中培养2小时。
补加入9ml DMEM5%。
再培养48~72小时，至半数左右细胞出现CPE。
收集细胞，600×g 离心3~5分钟沉淀细胞，去上清后加入最小体积（一般为原始体积的1/10即1ml）缓冲液（病毒保存溶液）重悬细胞。
液氮/37℃冻融4-7次，12，000rpm离心去除细胞碎片，收集上清。
进行下一轮感染扩增。
11．培养3×108~109个细胞，接毒后48-72小时收裂解上清。
在用氯化铯梯度离心纯化。
12．氯化铯梯度离心法纯化病毒：
配好的CsCl/TE溶液（D=1.43）加至sw32Ti离心管中
沿着管壁从同一点往下填入病毒清液（不成滴，保证匀速成线）
Sw32Ti 25，600rpm（~112，700g）4o C 2hr
超净台中小心将分层后的上层（培养基/PBS）吸走
分层后的界面上有白色细条带（病毒带），取出（~2-3ml）
生理盐水中4o C透析过夜（500ml 0.9% NaCl/次X 3次）
加入2x冻存buffer
分装后液氮速冻，冻存于-80o C
备注：
sw32Ti离心管有38.5ml和10ml两种，用细管便于吸取；离心管洗净后115o C高压灭菌30分钟
溶液配制：
CsCl溶液密度D与溶液中CsCl的重量百分比浓度P之间的关系：
D=138.11/137.48-P
e.g.配制D=1.43的CsCl TE溶液，算出P=40.899，
按TE（1mM-10mM）密度=水密度
称40.9g CsCl 溶于59.1ml TE中，滤菌
2x冻存buffer（adapted from Nature protocol Vol.2 No.5,2007:1236-1247）: 10mM Tris pH8.0，100mM NaCl，0.1%BSA，20%glycerol。
