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Shanghai GeneChem Co. Ltd 重组腺病毒操作手册(Version 2.0)上海吉凯基因技术有限公司 二〇〇九年二月地址：上海张江高科技园区蔡伦路 720 弄 1 号 408 室 电话：86-21-51320189 网址： 邮编：201203 传真：86-21-51320179 Email：service@Page 1 of 4 Shanghai GeneChem Co. Ltd 重组腺病毒实验系统腺病毒是一种的线型双链 DNA 无包膜病毒， 它的 DNA 和核心蛋白形成的内核， 蛋白外壳 是直径约 80nm 的正二十面体，由 240 个六 面体和 12 个位于正二十面体顶部的五面体 构成。
Genechem 重组腺病毒系统是将携带外源基 因的腺病毒穿梭质粒与携带腺病毒基因组的 包装质粒共转染 HEK293 细胞， 通过 Cre/loxP 系统的作用实现重组，产生重组腺病毒。
重组腺病毒能够表达较大的外源基因片段， 感染分裂和非分裂细胞，具有广泛的宿主。
GFP-adenovirus 感染的代表细胞――腺病毒可以感染绝大多数细胞TCA8113SGC-7901NRKPC-3Huh-7GliaRabbit Mesenchymal Stem CellsHuman Mesenchymal Stem CellRat Cardiac Fibroblasts地址：上海张江高科技园区蔡伦路 720 弄 1 号 408 室 电话：86-21-51320189 网址： 邮编：201203 传真：86-21-51320179 Email：service@Page 2 of 4 Shanghai GeneChem Co. Ltd 重组腺病毒操作过程一, 注意事项:1. 操作病毒时请尽量使用生物安全柜。
如有疑问欢迎垂询上海电话：************-8009苏州电话：*************-8042E-mail：************************** E-mail：************************吉玛重组腺病毒操作手册GenePharma Recombinant Adenovirus Operation Manual2017 年 6 月如有疑问欢迎垂询上海电话：************-8009苏州电话：*************-8042E-mail：**************************E-mail：************************目录一、产品简介 (4)二、腺病毒载体优势 (4)三、生物安全性 (5)3.1安全性 (5)3.2实验室安全措施 (5)四、流程描述 (6)五、材料与仪器 (7)5.1实验材料 (7)5.1.1细胞株 (7)5.1.2质粒 (7)5.1.3试剂 (8)5.2实验耗材及仪器 (8)5.2.1耗材 (8)5.2.2仪器 (9)六、具体步骤 (9)6.1细胞培养 (9)6.1.1活细胞计数 (9)6.1.2细胞株的冻存 (9)6.1.3细胞复苏 (10)6.1.4细胞传代 (10)6.2病毒包装 (10)6.3病毒收集 (11)6.4病毒扩增 (12)6.5病毒纯化 (12)6.6病毒重悬和保存 (13)6.7病毒滴度检测 (13)七、使用方法 (14)如有疑问欢迎垂询上海电话：************-8009苏州电话：*************-8042E-mail：************************** E-mail：************************重组腺病毒在细胞水平使用 (14)7.1病毒滴度复核（有限稀释法测定） (14)7.2靶细胞感染预实验 (16)7.3正式试验 (18)八、运输和储存 (18)九、常见问题及解决方案 (19)十、吉玛案例 (20)十一、附录 (21)如有疑问欢迎垂询上海电话：************-8009苏州电话：*************-8042E-mail：************************** E-mail：************************一、产品简介腺病毒(Adenovirus，Adv)是一种线性双链DNA 病毒。
广州英思特生物科技有限公司为您提供高效快速的病毒包装实验外包服务，病毒感染细胞实验整体流程及原理目的基因不能直接整合到大多数真核细胞，常用的手段是将目的基因包装成病毒来感染细胞，从而得到表达满足实验需求。
1、病毒的种类1.11.1.1体，一方面1.1.21）研。
? 2）可以通过简单方式，在短时间内获得稳定表达特定基因的多种细胞株。
3）可用于基因敲除、基因治疗和转基因动物研究。
4）无需任何转染试剂，操作简便。
5）可以根据客户需要制备多种标记。
1.1.3慢病毒包装简要流程：1）含有目的基因的慢病毒 RNAi 干扰载体的构建和质粒纯化提取。
2）慢病毒载体，包装系统共转染病毒包装细胞293T等。
3）培养 48hrs - 72hrs 左右，收集含有病毒的上清培养液。
4）病毒的纯化和浓缩。
5）分装、- 80 ℃保存。
6）滴度测定目的基因检定，并出具检测报告。
1.21.2.1达E11.2.21）2）3）4）5）1.2.3腺病毒包装简要流程1）构建表达 siRNA/miRNA 的腺病毒载体2）采用 PacI 消化纯化的质粒。
3）消化好的腺病毒表达载体转染 293A 细胞，收获细胞以制备病毒粗提液。
4）将病毒粗提液感染 293A 细胞以扩增病毒。
5）分装，-80℃保存。
1.3、慢病毒和腺病毒的比较2、构建目的基因到载体2.1构建手段一般是根据原始质粒信息确定克隆方案，有以下两种手段。
1）如果原始质粒与载体有匹配酶切位点，采用相应的内切酶切下相应片段，回收并连接到载体，酶切，并测序鉴定DNA分子。
质粒在宿主细胞体内外都可复制。
通过个些特性，人们可以把一些目的DNA片断构建在质粒中，通过转化入大肠杆菌中，利用选择培养基来筛选从而不断的复制，来得到目的产物。
3、质粒DNA在大肠杆菌里转化连接上目的基因的质粒转化大肠杆菌是为了让目的基因在大肠杆菌里扩增，然后提取质粒，以下是质粒DNA在大肠杆菌里转化的三步骤。
3.1大肠杆菌感受态细胞的制备30min2）离心管放到42℃保温90s3）冰浴2min4）每管加800ulLB液体培养基，37℃培养1h（150r/min）5）取适当体积（100ul）的复苏细胞，涂布在选择性培养基上，正置6）倒置平皿37℃，12~16h，出现菌落3.3质粒提取步骤1）取1~4ml在LB培养基中培养过夜的菌液，12000转离心1min，弃上清一次。
实验步骤：1) 转染前24 h ，准备6孔板293T细胞，培养液用（DMED+10%FBS）。
24 h后待细胞密度达70% ～80% 时即可用于转染。
2) Packing Plasmid (pspax) 1ug，Envelope (pMD2G) 1ug，ShRNA 1ug （5ul）加入Opti-MEM 100ul 轻轻混匀。
3) 将Lipofectamine 2000试剂轻柔摇匀，取9μl Lipofectamine 2000 试剂在另一管中与100ul Opti-MEM 混合，轻轻混匀。
4) 把稀释后的DNA与稀释后的Lipofectamine 2000进行混合，轻轻混匀。
5) 混合后，在室温下温育10~15(<25)分钟，以便形成DNA与Lipofectamine 2000稀释液的转染复合物。
6) 将DNA与Lipofectamine 2000混合液转移至293T细胞的培养液中，混匀，于37 ℃,5% CO2细胞培养箱中培养。
7) D0：培养3.5~5h后倒去含有转染混和物的培养基，并用PBS 液洗残余混合物，并换用10%FBS+DMEM;8) D1：24h换新鲜DMEM(含10%FBS+P/S)。
9）D2：48h、60h分别收集病毒上清液，-80℃保存。
9）D3：72h收集病毒上清液。
10）所有病毒上清液收集后混合均匀，分装。
3、基因敲除稳转细胞PanC1构建：ShRNA包装的病毒上清。
Puromycin筛选浓度5 ug/ml，维持浓度1 ug/ml。
实验步骤：1）、实验前1天铺2-dish 6-well ，加10%FBS+DEME+P/S培养，待细胞融合约80-90%时进病毒感染；2）、冻存的病毒上清液在冰上融化后，每孔加入1ml virus+1ml DMEM(10%FBS+P/S)+0.1%polybrene（4 ug/ml）3)、12h添加1ml DMEM(含10%FBS+P/S)4)、24换2ml DMEM(含10%FBS+P/S)5）、感染48小时后加药筛选；若感染24小时后，若细胞长满6-Well，则将细胞消化下来，传代移到10cm皿中继续培养。
腺相关病毒（AAV）包装技巧上⽂已经介绍了腺相关病毒的基础知识，具有如此多优点、功能如此强⼤的腺相关病毒是如何⽣产的？本⽂将为⼤家揭开腺相关病毒⽣产的神秘⾯纱。
腺相关病毒⽣产流程⼤致可分为基因克隆、细胞转染、收毒、病毒纯化、滴度检测等步骤，具体步骤我们下⽂分解？怎么可能，下⾯就是腺相关病毒⽣产流程。
腺相关病毒重组克隆载体构建1）根据订单不同选择不同的载体，在此以⼈源基因克隆为例。
2）Vigenebio 公司的 AAV 载体与我们的⼈源 ORF （注：维真⽣物拥有18000⼈源cDNA ORF克隆，可以最快的时间克隆到载体）库中的穿梭质粒的多克隆位点相兼容，通过酶切，连接，转化的⽅式将基因亚克隆进⼊ pAV-FH AAV 载体，得到阳性克隆之后进⾏酶切跑胶验证及测序以确认插曲⽚段的正确性。
细胞冻存流程1) 按照培养细胞流程，将细胞吹下来加⼊ 50ml 离⼼管中， 800g 离⼼5min。
2) 配制冻存液，90% ⾎清，10% DMSO，混匀。
3) 离⼼后去上清，将配制的冻存液加⼊，将细胞吹匀4) 取上述溶液 1ml 分⾄ 1.5ml 细胞冻存管中，做好标记和⽇期。
5) 放⼊装有异丙醇的冻存盒中，放⼊-80度冰箱过夜。
（冻存盒要提前⼀天从冰箱中拿⾄室温，使异丙醇的温度达到室温，每次冻存前确保异丙醇的加⼊量在刻度线上）。
6) 第⼆天将冻存盒放⼊液氮或-150℃冰箱中。
细胞复苏流程1) 10cm 培养盘中加 10cm 新鲜 DMEM 培养基，放培养箱预热⾄ 37℃。
2) 从液氮中取出冷冻管，迅速投⼊37 ℃～38℃⽔浴中，使其融化（1-2 分钟左右）。
3) 待细胞冻存管中溶液尚未完全融化时加⼊预热的培养盘中。
4) 摇晃均匀，放培养箱培养。
5) 4h后待细胞完全贴壁后更换新鲜培养基（除去冻存液中 DMSO 对细胞的毒害作⽤。
也可在第 3步中 800g 离⼼5min，除去培养基后再悬浮细胞添加⾄新鲜预热的 DMEM 细胞培养⽫中）。
腺相关病毒（AAV）构建及包装操作手册目录一、AAV安全注意事项二、AAV储存和稀释注意事项三、AAV介绍四、汉恒生物AAV产品服务及载体信息与现货列表五、AAV整体实验流程六、实验材料七、AAV载体构建八、AAV包装九、AAV收集和纯化十、AAV滴度测定十一、AAV感染细胞测试十二、AAV用于动物实验（重磅干货，五星推荐）十三、案例分享附件1附件2一、AAV安全使用注意事项（*非常重要！！！*）1)AAV相关实验请在生物安全柜（BL-2级别）内操作。
2)操作病毒时请穿实验服，佩戴口罩和手套，尽量不要裸露双手及手臂的皮肤。
3)操作病毒时特别小心病毒溅出。
如果操作时超净工作台有病毒污染，请立即用70%乙醇加1%的SDS溶液擦拭干净。
接触过病毒的枪头、离心管、培养板、培养液请用84消毒液浸泡后统一处理。
4)如需要离心，应使用密封性好的离心管，如有必要请用封口膜封口后离心。
5)动物注射操作请在生物安全柜内（BL-2级别）完成。
6)病毒相关的废弃物需要特殊收集，统一经高温灭菌处理。
7)实验完毕用洗手液清洗双手。
二、AAV储存和稀释注意事项1.AAV的储存收到病毒液后若在短期内使用，可将病毒放置于4℃保存（一周内使用完最佳）；如需长期保存请分装后放置于-80℃。
注：a．反复冻融会降低病毒滴度（每次冻融病毒滴度会降低10%-50%），因此在病毒使用过程中应尽量避免反复冻融。
汉恒生物已对病毒进行了分装（200 l/tube），收到后请直接放置-80℃保存即可。
b．若病毒储存时间超过6个月，汉恒生物建议在使用前重新测定病毒滴度。
2.AAV的稀释需要稀释病毒时，请将病毒取出冰浴融解，再使用无菌PBS或生理盐水混匀分装后置于4℃保存(一周内使用完最佳)。
三、AAV介绍腺相关病毒（AAV）属微小病毒科( parvovirus)，为无包膜的单链线状DNA 病毒。
只有在腺病毒或者疱疹病毒等辅助病毒协助下，宿主才能产生具有感染性的AAV，所以AAV被称作腺相关病毒。
腺病毒载体的分类及包装方法1.腺病毒载体分类第一代腺病毒载体：指E1或E3基因缺失的腺病毒载体。
特点：(1)外源基因容量为6.5-8Kb；(2)适用于大多数基因治疗，且容易获得高滴度的病毒；(3)可用于表达重组蛋白质或将外源基因导入对其他转染方法不敏感的细胞株中；(4)若未经纯化使用，容易引发机体产生强烈的炎症反应和免疫反应，纯化后可安全使用。
第二代腺病毒载体：指E2A或E4基因缺失的腺病毒载体。
特点：(1)外源基因容量增加，可达14Kb；(2)病毒蛋白表达降低，引发机体的免疫反应比第一代弱；(3)外源基因表达时间较长；(4)病毒产量较低，且滴度降低。
第三代腺病毒载体：也称为空壳载体或辅助病毒载体，指全部或大部分腺病毒基因组缺失，仅可保留ITR和包装信号序列的腺病毒载体。
特点：(1)外源基因容量大幅度提高，可达37Kb；(2)无病毒蛋白表达，降低了机体的免疫反应，提高了安全性；(3)外源基因可长期稳定表达；(4)需要一个腺病毒突变体作为辅助病毒；(5)可反复应用，无需考虑机体的抗腺病毒中和抗体的影响。
2.腺病毒载体包装方法传统的双质粒共转染法将插入了外源基因的穿梭载体质粒与携带腺病毒基因组的质粒共转染293细胞，这两种质粒在293细胞内通过随机的同源重组（同源序列的DNA分子之间或者分子之内的重新组合），形成重组腺病毒载体基因组，并包装成病毒颗粒。
局限性：(1) 操作较复杂，因其易被亲代病毒污染，需经过多次纯化和鉴定；(2) 重组效率低，耗费时间较长。
注：此方法适用于临床。
(1)Ad-Easy法将克隆了外源基因的腺病毒穿梭质粒与携带腺病毒大部分基因组的质粒共转染RecA+细菌，在细菌RecA 重组酶的作用下，经抗性筛选获得重组腺病毒基因组质粒，将其酶切纯化后转染293细胞，包装成重组病毒颗粒。
特点：(1) 酶切和连接步骤少，操作简便；(2) 可选择的穿梭载体多；(3) 同源重组率达60%以上，效率相对较高；局限性：(1) 某些腺病毒基因容易发生突变；(2) 设备和技术要求较高。
腺病毒的包装与制备1 转染AD293第一轮:1. pAd质粒转染AD293，可使用六孔板或60mm皿。
当细胞出现明显细胞病变效应(CPE)时回收细胞，(吸去培养基用PBS洗一遍，若细胞已经悬浮则取所有培养基低速离心，细胞用PBS洗一遍)，并用0.5ml PBS重悬。
置于1.5ml microcentrifuge tube中2. 裂解细胞:进行四轮-80?/37?3. 12000g 10min 室温离心，将上清移入新的离心管中。
-80?保存。
第二轮:1. 取第一轮的病毒液50μl(或设置梯度)感染100mm皿。
(如细胞第一天就出现病变则用量太高，一般应在第一天少量病变，第二三天全部病变)。
重复第一轮方法裂解细胞并收集腺病毒，终体积1ml第三轮取第二轮的病毒感染4个150mm皿(100μl/皿或设置梯度)，并用CsCl密度梯度法纯化腺病毒。
2 透析Transfecting AD-293 Cells以Lipofectamine? 2000说明书为本，更改了细胞密度和DNA量51. One day before transfection, plate 4x 10 cells per 6-wellofgrowth medium without antibiotics so that cells will be 50-70% confluent at the time of transfection. 2. For each transfection sample, prepare complexes as follows:a. Dilute 4μg linearized DNA in 250 μl of Opti-MEM I Reduced Serum Medium without serum (or other medium without serum). Mix gently.b. Mix Lipofectamine? 2000 gently before use, then dilute 10μl lipofectaminein250 μl of Opti-MEM I Medium. Incubate for 5 minutes at room temperature. Note:Proceed to Step c within 25 minutes.c. After the 5 minute incubation, combine the diluted DNA withdilutedLipofectamine? 2000 (total volume = 100 μl). Mix gently andincubate for 20 minutes at room temperature (solution may appear cloudy). Note:Complexes are stable for 6 hours at room temperature. 3. Add the 500 μl of complexes to each well containing cells and medium. Mix gently by rocking the plate back and forth.4. Incubate cells at 37?C in a CO2 incubator for 17-10days prior to testing for GFP. Medium may be changed after 4-6 hours.Preparing the Primary Viral Stocks1. Prepare a small dry ice-methanol bath and a small 37?C water bath and placethem in the laminar flow hood.2. Carefully remove growth medium from adenovirus-producing AD-293 plates andwash the cells once with PBS. Take care not to lose any clusters of floating andpartially attached cells during this process.Note :If the cells are already mostly detached, pipet up and down gently in the growth medium until cells become completely resuspended. Transfer cell suspension to a screw cap centrifuge tube and pellet the cells by low speed centrifugation. Aspirate medium, and wash the cells once with 0.5 ml of sterile PBS. Resuspend the cell pellet in a fresh 0.5 ml sterile PBS (per 60-mM dish) and proceed to Step 5. 3. Add 0.5 ml of PBS to each plate of cells to be harvested. Collect the cells by holding the plate at an angle and scraping the cells into the pool of PBS with a cell lifter.4. Transfer the cell suspension to a 1.7-ml screw-capmicrocentrifuge tube. If duplicate DNA samples were transfected, the cells from duplicate samples may be combined in the microcentrifuge tube at this stage.5. Subject the cell suspension to four rounds of freeze/thaw by alternating the tubes between the dry ice-methanol bath and the 37?C water bath,vortexing briefly after each thaw.Note :Each freeze and each thaw will require approximately 5 minutes’ incubationtime.6. Collect cellular debris by microcentrifugation at 12,000 × g for 10 minutes at room temperature.7. Transfer the supernatant (primary virus stock) to a fresh screw-cap microcentrifuge tube. Viral stocks can be stored for more than one year at –80?C.腺病毒扩增1. Plate 5 X 106 QBI-293A cells in a 100 mm culture dish in 10 mL DMEM 5%.2. Remove 50μl(100μl) of the viral stock of the first amplification, complete to 1 mL with DMEM 5% and mix. This dilution will give a MOI of about 5.3. Remove the medium from the 100 mm dish, delicately add the viral particle mix onto the cells taking care not to disturb the monolayer and spread by slowly rocking the dish 3 times in a cross shape. Incubate for 90 minutes at 37?C in 5% CO2.4. Add 9 mL of DMEM 5%.5. Incubate at 37?C in a CO2 incubator for 72 hours. At this point you should have between 5 x91010 and 5 x 10 VP in 10 mL of DMEM 5%. Perform a MOI test (section 5.3) to estimate the titer if desired.If this quantity of virus is sufficient, you can immediately proceed to the titration step (section 5.8). In this case, collect the cells in a centrifuge tube, spin at 600 x g for 5 min, discard supernatant and resuspend the cell pellet in a minimal volume, typically 1:10 of the original volume or about 1mL. Then proceed with 3 freeze/thaw cycles (-20?C / 37?C), spin at maximum speed on a tabletop centrifuge to remove cellular debris, and collect the supernatant. Titer as described in section 5.8. 6. Perform three freeze/thaw cycles at -20?C until completely frozen/37?C until fully thawed. 7. Pellet cell debris in a sterile 15 mL conical tube. Centrifuge at maximum speed in a tabletop centrifuge for 10 minutes, remove and store the supernatant in another sterile 15 mL conical tube at -20?C or -80?C.8. Plate 3 x 107 QBI-293A cells in 3 x 175 cm2(150mm dish) culture flasks (1 X 107cells/flask).9. Mix 3 mL of cell lysate supernatant from step 7 with 12 mL DMEM 5%. Remove the mediumfrom the flask, then delicately add 5 mL of supernatant mix perflask on the cells, taking care notto disturb the monolayer, and spread by slowly rocking the dish 3 times in a cross shape. Incubate for 90 minutes at 37?C in 5% CO2. This should give a MOI of 25.10. Complete to 30 mL/flask with DMEM 5%.11. Incubate at 37?C in a CO2 incubator for 48 to 72 hours. At this point you should have between 3 x 1010 and 3 x 1011 VP in 90mL of DMEM 5%. Perform a MOI test (section 5.3) to estimate the titer if desired. Again, if this quantity of virus is sufficient, you can immediately proceed to the titration step (section 5.8). In this case, collect the cells in a centrifuge tube, spin at 600 x g for 5 min, discard supernatant and resuspend the cell pellet in a minimal volume, typically 1:10 of the original volume. Then proceed with 3 freeze/thaw cycles (-20?C / 37?C), spin at maximum speed on a tabletop centrifuge to remove cellular debris, and collect the supernatant. Titer as described in section 5.8.12. Perform three freeze/thaw cycles at -20?C/37?C.13. Pellet cell debris in a sterile 50 mL conical tube. Centrifugeat maximum speed in a tabletop centrifuge for 10 minutes. Remove and store the supernatant.14. Plate 3 x 108 QBI-293A cells in 30 x 175 cm2 culture flasks (1 X 107 cells/flask). 15. Mix 45 mL of cell lysate supernatant from step 13 with 105 mL DMEM 5%. Remove the medium from the 175 cm2 flasks, pour 5 mL of the cell lysate mix per flask on the cells, taking care not to disturb the cell monolayer, and spread by slowly rocking the flask 3 times in a cross shape. Incubate for 90 minutes at 37?C in 5% CO2. This should give a MOI of 25.16. Complete to 30 mL/flask with DMEM 5%.17. Put the cells back at 37?C in a CO2 incubator for 2-3 days. You should now have between 3 x 111210 to 3 x 10 VP. Perform a MOI test (section 5.3) to estimate the titer if desired. If you want to produce viral particles, first collect and pellet the infected cells, then resuspend in 5 mL DMEM 5%. Extract viral particles by performing three freeze/thaw cycles at -20?C/37?C; pellet cell debris by centrifugation. At this point you should have between 3 x 1011 to 3 x 1012 recombinant virus particles in 5 mL DMEM 5%, for a final VP/mL of 6 X 1010 to 6 x 1011. Your viral particle pre-stock will now be ready to be titrated directly, asdescribed in section 5.8, or purified, using standard cesiumchloride gradients (section 5.7). Further amplifying your recombinant virus on 109 cells will result in the production of a viral stock, while amplification on 1 x 1010 cells is technically a viral production. You should never use the virus from a production stock to infect additional cells because you will at the same time significantly increase the amount of RCA generated. Instead, use virus from an earlieramplification steps such as the stock, pre-stock or pre-amplification in order to produce more virus particles. You can eventually go back to the purified eluted plaque in order to minimize RCAproduction as much as possible. If a purified eluted plaque is no longer available, you will have to perform a plaque assay of your recombinant virus and start the amplification step again from a purified eluted plaque, after analysis of your clone. If more material than produced in the first 4 passages(see Table 5) is needed, remember to always return to the previous passage as your source for virus. For example, use virus from passage 2 in order to generate passage 3. Note that once you have depleted all of your viruses from passage 2, you must use virus from the first amplification in order to create a new passage 2. Proceeding in this fashion will keep the level of RCA as low as possible. If you want to overexpress a protein, pellet the cells and extract the protein according to its characteristics. Typically, about 1-5 mg of a well-expressed protein can beretrieved from the pellet. It is recommended to first determine the best time pi to extract the protein on a smallscale, then to proceed with large-scale protein production.CsCl密度梯度法纯化腺病毒1 Add either purified Ad or unpurified Ad (medium) to monolayer culture cells (50-100pfu/cell)2 If using one T150 flask total 10-12 ml medium is used to cover the cells and allow cells to culture for one day3 Cells should look swollen and part of the cells may be floating. Another 10ml of complete medium is added into cells and allow another day culture (36-40hrs infection period )4 All of the cells should be floating. Collect all the cells and resuspend them in 0.5-1ml of complete medium . Also save the culture medium and store at -70?.5 Freeze in methanol/dry ice bath and thaw at 37?. Repeat for 3-4times6 Spin at high speed for 5min.7 Make 40% and 15% CsCl in TBS, PH8.1(50ml each and keep at 4?)8 Make CsCl gradient solution(5ml of 15% and 4.5ml of 40%) in Beckman centrifuge tube (14*89mm, which frist sw41 rotor)9 Load the supernatant from step 6 on the top of gradient10 Centrifuge at 4? 30000rpm for 16hr11 Two bands can be seen: the faint top band (mainly defective Ad) and the lower Ad band. Only the lower band is collected.12 the Ad is dialyzed in TBS PH8.1 for 1hr and then in TBS containing 10% glycol twice (1hr each time)13 Determine the Ad concentration, aliquot into microfuge tube(50μl each )and store at -70?TBS: tris 10mM, NaCl 0.9%, PH8.115% CsCl(50ml): 9.085g CsCl+47.69ml TBS40% CsCl(50ml): 28.45g CsCl+42.7ml TBSDialyze:1 透析袋: MW 8000-144002 透析缓冲液: TBS PH8.1 灭菌甘油步骤:1冲洗透析袋，如果是蛋白则需NaHCO-NaEDTA煮沸处理后用蒸馏水洗。
腺病毒包装、扩增、纯化、滴度测定及感染腺病毒包装、扩增、纯化、滴度测定及感染一、包装1.包装细胞详情见AD-293 Cells.pdf，AdEasy? Adenoviral Vector System.pdf（P31-P32）2.细胞转染方法一、详情见Adeno-X Expression System 1 User Manual.pdf（P28-P29）C0508磷酸钙法细胞转染试剂盒.pdf3.病毒收集详情见AdEasy? Adenoviral Vector System.pdf（P34）二、扩增详情见Adeno-X Expression System 1 User Manual.pdf（P29-P30）三、纯化(i) 病毒上清（接一、包装3.病毒收集）.(ii) Add 51 ml of a 50% PEG 6000 solution.(iii) Add 21.7 ml of a 4 M NaCl stock solution.(iv) Add 23.3 ml of PBS. This will result in a final volume of 300 ml. The final PEG 6000 concentration will be 8.5% and the final NaCl concentration will be B0.3 M.(v) Distribute the sample as 150-ml aliquots in two 250-ml polypropylenewide-mouthed bottles.(vi) Store the bottles at 4 1C for 1.5 h. Mix contents every 20–30 min.(vii) Centrifuge bottles at 7,000g for 10 min at 4 1C using a Beckman fixed-angel JLA-10.500 rotor.(viii) After centrifugation, a white pellet should be visible.(ix) Carefully decant the supernatant and add 1.2 ml of 50 mM Tris-HCl, pH 7.4, perbottle. Resuspend the pellets byvigorously pipetting liquid up and down.(x) Vortex the bottles vigorously for 20–30 s to further resuspend the pellets.(xi) Transfer the vector suspension into screw-cap microfuge tubes in aliquots of 100 ml.(xii) Snap-freeze the tubes in crushed dry ice and store at -80 。
汉恒重组腺病毒操作手册目录腺病毒安全使用和注意事项腺病毒储存与稀释的注意事项一、整体实验流程二、实验材料三、腺病毒包装和浓缩四、重组腺病毒滴度（PFU）的测定五、重组腺病毒感染目的细胞六、重组腺病毒用于动物实验附1：汉恒生物腺病毒载体附2：腺病毒感染细胞最佳MOI的摸索（表达荧光的病毒） 附3：汉恒生物常见三种病毒感染目的细胞比较腺病毒安全使用和注意事项➢腺病毒安全使用注意事项（*非常重要*）1) 腺病毒相关实验请在生物安全柜（BL-2级别）内操作。
2) 操作病毒时请穿实验服，佩戴口罩和手套，尽量不要裸露双手及手臂的皮肤。
3) 操作病毒时需要特别小心病毒溅出。
如果操作时超净工作台有病毒污染，请立即用70%乙醇加 1%的SDS溶液擦拭干净。
4) 接触过病毒的枪头、离心管、培养板及培养瓶请用84消毒液浸泡后统一处理。
5) 如实验过程中需要离心，应使用密封性好的离心管，必要时请用封口膜封口后离心。
6) 病毒相关的废弃物需要特殊收集，统一经高温灭菌后处理。
7) 实验完毕后请用香皂清洗双手。
➢腺病毒储存与稀释的注意事项1）腺病毒的储存收到病毒液后若在短期内使用，可将病毒放置于 4℃保存（一周内使用完最佳）；如需长期保存请分装后放置于 -80 ℃ 。
注：a.反复冻融会降低病毒滴度（每次冻融会使病毒滴度降低10%~50%），因此在病毒使用过程中尽量避免反复冻融。
汉恒生物对病毒已进行分装（200 μl/tube），收到后请直接放置-80℃冰箱保存即可。
b.若病毒储存时间超过6个月，汉恒生物建议在使用前重新测定病毒滴度（参见附表2-慢病毒滴度测定方法）。
2）腺病毒的稀释需要稀释病毒时，请将病毒取出置于冰浴融解后，使用PBS或培养目的细胞用的无血清培养基(含血清或含双抗不影响病毒感染)混匀分装后置于 4℃保存(一周内使用完最佳)。
重组腺病毒是一种复制缺陷的腺病毒载体系统，在基因治疗、基础生命科学研究等领域被广泛应用。
汉恒重组腺病毒操作手册目录腺病毒安全使用和注意事项腺病毒储存与稀释的注意事项一、整体实验流程二、实验材料三、腺病毒包装和浓缩四、重组腺病毒滴度（PFU）的测定五、重组腺病毒感染目的细胞六、重组腺病毒用于动物实验附1：汉恒生物腺病毒载体附2：腺病毒感染细胞最佳MOI的摸索（表达荧光的病毒）附3：汉恒生物常见三种病毒感染目的细胞比较腺病毒安全使用和注意事项➢腺病毒安全使用注意事项（*非常重要！！！*）1)腺病毒相关实验请在生物安全柜（BL-2级别）内操作。
2)操作病毒时请穿实验服，佩戴口罩和手套，尽量不要裸露双手及手臂的皮肤。
3)操作病毒时需要特别小心病毒溅出。
如果操作时超净工作台有病毒污染，请立即用70%乙醇加1%的SDS溶液擦拭干净。
4)接触过病毒的枪头、离心管、培养板及培养瓶请用84消毒液浸泡后统一处理。
5)如实验过程中需要离心，应使用密封性好的离心管，必要时请用封口膜封口后离心。
6)病毒相关的废弃物需要特殊收集，统一经高温灭菌后处理。
7)实验完毕后请用香皂清洗双手。
➢腺病毒储存与稀释的注意事项1）腺病毒的储存收到病毒液后若在短期内使用，可将病毒放置于4℃保存（一周内使用完最佳）；如需长期保存请分装后放置于-80 ℃。
注：a.反复冻融会降低病毒滴度（每次冻融会使病毒滴度降低10%~50%），因此在病毒使用过程中尽量避免反复冻融。
汉恒生物对病毒已进行分装（200 μl/tube），收到后请直接放置-80℃冰箱保存即可。
b.若病毒储存时间超过6个月，汉恒生物建议在使用前重新测定病毒滴度（参见附表2-慢病毒滴度测定方法）。
2）腺病毒的稀释需要稀释病毒时，请将病毒取出置于冰浴融解后，使用PBS或培养目的细胞用的无血清培养基(含血清或含双抗不影响病毒感染)混匀分装后置于4℃保存(一周内使用完最佳)。
重组腺病毒是一种复制缺陷的腺病毒载体系统，在基因治疗、基础生命科学研究等领域被广泛应用。
重组腺病毒具有以下几个显著优点：感染范围广，几乎可以感染所有的细胞系、原代细胞和部分组织；感染效率高达100%，可全面超越其他病毒载体工具和脂质体转染；对外源基因容载能力大（可以高达8Kb）；不整合基因组；滴度高，操作方便。
因此，重组腺病毒是一种最具有潜力的基因递送工具。
目前常用的腺病毒载体基于人腺病毒5型（Ad5），其基因组是36Kb长的线性双链DNA。
腺病毒可通过自身的纤维（fiber）和细胞表面的受体结合被内吞进入细胞，然后从内吞体（endosome）转移到细胞质和细胞核内，借助细胞的转录和翻译机器启动病毒的复制组装。
一个完整的病毒生活周期会引发细胞死亡从而释放出病毒粒子。
目前最常用的腺病毒包装体系有AdEasy和AdMAX两种，其共同特点是目的基因首先克隆到穿梭载体，然后再重组到腺病毒的大骨架上。
这两个系统均具有腺病毒早期转录复制基因E1和E3的缺陷(ΔE1, ΔE3)，其中E3基因对病毒产生并非必需。
因此，腺病毒包装必需依赖表达E1的细胞系，例如HEK-293，HEK-293A等。
相对于Adeasy系统，AdMAX系统操作便利，并且可以获得更好的病毒滴度。
本操作说明均基于AdMAX系统，该系统由pHBAd系列穿梭质粒、腺病毒骨架载体pBHGlox(delta)E1, 3Cre双载体组成。
一、整体实验流程二、实验材料该病毒包装系统为两质粒系统，组成为穿梭质粒（pHBAd系列，包括包括过表达、干扰等类型）和骨架质粒（pBHGlox(delta)E1, 3Cre)。
1、载体信息（见附1）2、菌株：大肠杆菌菌株DH5α。
用于扩增腺病毒载体和腺病毒骨架载体质粒。
3、细胞株：293A，腺病毒的包装细胞，表达腺病毒基因E1，为贴壁依赖型成上皮样细胞，经培养生长增殖形成单层细胞，生长培养基为DMEM+10% FBS+双抗（DMEM完全培养基）。
293A细胞来源于一个用作空斑测定的亚克隆，具有易使用和易转染的特性。
该细胞株对于高细胞密度很敏感，当细胞超过70%汇合时，一些细胞可能会丢失它们的表型。
若细胞密度持续在70% 以下，则293A细胞能连续培养3～4个月维持原有的细胞特性。
若以购买得到的293A作为第一代，则30代内都能得到最佳结果。
随着传代次数的增加，293A细胞会出现生长状态变差、突变等现象。
为了防止此类现象的出现，我们需要在初始阶段对细胞进行大量的冻存保种，以保证实验的稳定性和持续性。
在细胞对数生长期进行冻存，可增加细胞复苏成活率。
注：为了达到最好的细胞状态，提高腺病毒出毒效率，推荐在培养基中加入汉恒生物的SaveIt TM抗支原体试剂。
三、腺病毒包装和浓缩（一）质粒构建和扩增构建有目的基因的腺病毒穿梭质粒和骨架质粒需经过大量抽提，浓度要求大于1 μg/μl，A260/280在1.7~1.8范围内方可用于病毒包装。
推荐使用Qiagen大抽试剂盒进行质粒的大量去内毒素抽提（质粒质量会极大影响后续转染效率和病毒的滴度）。
注：质粒构建推荐使用汉恒生物HB-infusion TM无缝克隆试剂盒。
（二）腺病毒包装事先准备好用于包装病毒的293A细胞（50-70%的汇合度）和病毒质粒，转染每个直径为6 cm的培养皿成分如下：pHBAd系列穿梭质粒 2 μgpBHGlox(delta)E1, 3Cre 4 μgDMEM需在37℃水浴中预热，LipoFiter TM转染试剂需恢复至室温方可使用，并在使用前摇匀。
转染6h后置换成新鲜培养液。
注：1、LipoFiter TM转染试剂为汉恒生物产品，使用说明参考LipoFiter TM说明书。
2、转染前细胞必须处于良好的生长状态。
（三）病毒收集病毒收集前要观察病毒空斑是否形成。
为了限制病毒的扩散而让空斑更好地形成，通常在培养液中加入低熔点琼脂糖，转染后一般在第10至21天可以在显微镜下看到小的空斑。
如果穿梭质粒带有荧光蛋白（GFP或RFP），则在空斑形成之前观察荧光，以确定转染效率。
空斑形成后将空斑与琼脂糖一起挑起，放入1 ml新鲜培养基中过夜。
通常挑取3-6个空斑不等，然后比较滴度，使用滴度最高的一个空斑进行后续实验。
空斑示意图注：高纯度的低熔点琼脂糖储液可以配制在无菌PBS中，终浓度5%；使用之前用沸水浴完全融化，然后自然降温到45℃待用。
用37℃预热的完全培养基稀释5%的琼脂糖溶液到终浓度1.25%，混匀后马上加到去除培养基的细胞上，轻轻地覆盖均匀。
6孔板每孔覆盖3 ml琼脂糖/培养基。
（四）病毒扩增第二天，将培养基中病毒加入新鲜293A细胞培养液中进行病毒少量扩增。
至细胞再次出现空斑，收集细胞及上清，反复冻融三次收集病毒，以此病毒为P1代病毒，以P1代腺病毒感染293A细胞，连续进行三代感染，至P4代进行腺病毒的大量扩增，待空斑形成后收集病毒并对病毒进行体外纯化和浓缩。
注：1、收集细胞的时候一般使用细胞刮，不能用胰酶消化，4℃500 g离心10 min，去除大部分上清，只留取2 ml上清重悬细胞沉淀进行-80℃（干冰或者液氮均可）冻融。
2、37℃冻融时一旦病毒融化就马上取出，长时间在37℃温育会降低病毒滴度，完全融化后可以剧烈震荡30s。
冻融周期通常会持续2~4次才可以获得高滴度的病毒。
3、细胞冻融结束裂解液可以4℃500×g离心10 min，不立即使用的话可以冻存在-20℃或-80℃。
（五）病毒纯化病毒纯化采用PEG8000沉淀-CsCl密度梯度离心-透析联用法纯化病毒，具体操作如下:1、融化：提前1 天将病毒从-80℃冰箱拿出，室温水浴融化。
收集全部细胞裂解物，7000×g 4℃离心10 min，弃细胞碎片，收集上清。
2、PEG8000沉淀：每100 ml上清加入50 ml PEG8000（20% PEG8000，2.5 M NaCl），冰上放置1h使病毒沉淀（可适当延长时间）。
7000×g 4℃离心上述混合物20 min，弃上清，将沉淀物悬浮在10 ml 密度为1.10 g/ml 的CsCl 溶液中（溶剂为20 mM Tris-HCl，PH8.0）（溶液配置见下表），病毒液应呈粉红色。
三种不同密度CsCl溶液的配制密度（g/ml）浓度（mg/ml）CsCl的量（g）终体积（ml）(20℃)1.40 548.3 5.483 101.30 402.4 4.024 101.10 143.8 1.438 103、CsCl 梯度离心：CsCl 梯度的制备方法如下：加入2 ml 密度为1.40 g/ml 的CsCl 溶液（溶剂同上），然后再缓慢加入3 ml 密度为1.30 g/ml 的CsCl 溶液（配置如下表），再加入5 ml 的病毒悬浮液。
使用Beckman SW28转子，26,000 rpm，4℃离心2小时。
4、收集病毒：用注射器收集密度在1.30 g/ml 和1.40 g/ml 之间的病毒条带至透析袋中。
注：透析袋使用前用10 mM EDTA-Na2煮沸10 min，降至室温使用。
5、透析：在透析缓冲液（50 g 蔗糖，10 ml 1M Tris-HCl，PH8.0，2 ml 1M MgCl2定容至1L）中，4℃搅拌过夜，中间需更换一次透析液。
收集病毒，测定病毒滴度。
6、重悬：500 μl PBS重悬病毒沉淀，一周内使用则置于4℃保存，如需长时间存放需置于-80℃保存。
四、测定腺病毒滴度（PFU）空斑(Plaque)是病毒诱导的细胞裂解形成的点状物，可以通过显微镜和肉眼观察。
空斑形成单位(Plaque-forming unit, PFU)是单位体积的病毒形成的空斑数，是代表有活性的病毒粒子的浓度单位。
PFU测定方法如下：293细胞铺于60 mm dish，24h后细胞密度接近100%后加入不同稀释度的病毒，37℃感染4~8h后，铺8 ml低熔点胶（10%FBS，1.25% Agarose）。
培养9~11天后对空斑进行计数来计算腺病毒滴度。
注：腺病毒滴度还可以通过观测荧光蛋白（若有）或者通过目的基因的WB、免疫荧光或免疫组化等方法测定。
五、感染目的细胞因为不同细胞的MOI不同，所以在正式实验前，需设计预实验以确定目的细胞中加入的病毒数。
注：MOI值: MOI 是multiplicity of infection的缩写，中文译为感染复数,实际的含义即为每个细胞被多少个有活力病毒颗粒所感染。
不同实验室、不同操作手法及不同细胞系条件下所对应的细胞最佳MOI 都是不同的，在正式实验之前强烈建议实验操作者进行一次摸索最佳MOI的预实验。
（一）细胞准备将状态良好的目的细胞接种到24孔板，使细胞密度约为1×105/ml。
注：接种细胞数量因细胞的生长速度而略有不同，一般是保证第二天进行病毒感染的时候细胞汇合率在50%至70%之间。
