人类胚胎干细胞基础培训教材HEN system office room 【HEN16H-HENS2AHENS8Q8-HENH1688】人类胚胎干细胞基础技术高级培训班2010-12目录1.绪论本操作手册将为您详细介绍人胚胎干细胞/iPS细胞培养的基础知识、技术细节及相关的产品信息。
目的是为了让您更好地培养您购买的细胞，请按照此手册进行培养操作直至获得可靠的冻存细胞。
上海斯丹赛生物技术有限公司专业提供各类胚胎干细胞/iPS细胞及成套产品服务，为您的干细胞研究提供一站式解决方案。
2.饲养层细胞的制备材料与仪器成纤维细胞完全培养基，货号EFM-01胰酶，货号M-005-1成纤维细胞冻存液（2x），货号EFFM-01基质胶（Matrigel matrix），BD Pharmingen，货号356235CF-1小鼠胚胎成纤维细胞（MEF），货号MEF-CF1-01T25透气培养瓶，NUNC，货号156367T75透气培养瓶，NUNC，货号1564992 ml移液管，NUNC，货号1596175ml移液管，NUNC，货号15962510 ml移液管，NUNC，货号15963315ml离心管，货号36603650ml离心管，货号373660冻存管，NUNC，货号377267Thermo-Fisher Finnpipette F3移液器和灭过菌的枪头生物安全柜，货号CO2培养箱，Thermo，HERA cell 150i电子计数器，millipore，货号PHCC00000电动移液器，Thermo Scientific Finnpipette C1，货号4580800低速离心机，Thermo Scientific CL10液氮罐，Thermofisher，货号CN509002.1从胎鼠获得小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）1. 拉断颈椎处死怀孕12-13天的CF-1小鼠，浸入70％的酒精中消毒。
2. 将小鼠放在超净台无菌的解剖盘中，在腹中线处做一横向切口。
3. 剪开的皮肤拉向切口的上下两侧，提起腹膜，将其剪开，充分暴露腹腔。
4. 找出子宫，一只手用无菌钝口镊子轻轻提起子宫，另一只手持无菌镊子小心分离子宫周围的结缔组织。
当两侧子宫都与其相连的组织分离好后，用剪刀将左右两侧的子宫在输卵管与子宫角的衔接处剪下，小心剪下子宫的联体部分，置于无菌的60mm 培养皿中。
5. 用无菌的剪刀在子宫头与子宫尾分别剪去输卵管及子宫角部分。
6. 将子宫置于15ml离心管中，用10mlPBS洗三遍。
7. 用尖镊子撕开子宫壁和胎膜，取出胎鼠，放在新的培养皿中。
8. 用8mlPBS 将胎鼠洗三遍。
9. 用灭菌的眼科剪刀去除胎鼠的胚囊，释放胚胎，并胚胎计数。
10. 将胚胎移到干净的培养皿中，PBS洗三次。
11. 用镊子小心的去除胚胎的头和肝脏，PBS洗三次。
12. 将胚胎转移至新的培养皿中，用无菌剪刀将组织充分剪碎，加入％胰酶同时吹打几分钟使其消化均一并彻底酶解。
13. 用同样体积的MEF完全培养基中和胰酶。
14. 一个T75瓶加10ml MEF完全培养基，按照每2-3个胚胎一个T75瓶，将已消化的胚胎加入培养瓶中，放在5％CO2培养箱中培养，培养瓶注明细胞名称，代数及日期。
2.2MEF的传代1. 将T75瓶中的MEF培养基吸出。
2. 加入大约3ml胰酶，于37℃的CO2培养箱中放置3-5分钟3. 取出瓶子，轻轻晃动，可以看见白色的细胞层开始从瓶子的底壁掉落。
确保瓶盖是拧紧的。
用手掌根轻拍瓶侧3-5次。
在灯下观察细胞是否已从瓶子上脱落。
4. 加入同等体积（3ml）的MEF培养基，混匀，吹打几次以形成单细胞悬浮液。
▲Note: 这一培养基是包含血清的，将会完全抑制胰酶的活性。
5. 补加42mlMEF培养基到瓶子中，使总体积达到50ml，混匀。
6. 将上述细胞悬浮液均分至5个新的T75瓶子中，每瓶10ml。
7. 放在5％CO2培养箱中培养，逐日观察。
2.3MEF的冻存1. 吸去培养液，加％胰酶至完全覆盖瓶底（以T75为例）。
2. CO2培养箱中孵育3-5分钟，不时轻拍瓶壁，使细胞层脱落。
3. 加入同等体积的MEF培养液中和胰酶，吹打混匀。
4. 将其转移至15ml离心管，用电子计数器进行细胞计数后，以1000rpm的速度离心5分钟。
5. 移去上清，用少量新鲜的MEF培养液重悬细胞沉淀。
6. 缓慢加入等量的MEF细胞冻存液（2x）并混匀。
7. 分装上述细胞悬液于2ml冻存管中，每管。
8. 在冻存管上注明细胞名称，代数，数目，冻存时间。
9. 将冻存管放到冻存盒中，-80℃冰箱过夜。
10. 最后将冻存管转移至液氮罐中以便长期保存。
2.4MEF的失活1. MEF传代到3－5代时，当细胞铺满培养瓶后（以T75为例），加3ml ％胰酶，放入37℃的CO2培养箱孵育3-5分钟。
2. 加入同等体积的MEF培养液中和胰酶，用移液枪吹打几次以形成单细胞悬浮液。
3. 将所有细胞悬液混合到一个50ml离心管中，补加适量新鲜的MEF培养液。
4. 取上述细胞悬液，转移至新的15ml离心管中，用培养液稀释，混匀。
5. 用电子计数器计数细胞。
6. 将原来的50ml离心管封口，使用gama射线辐照仪，50－80戈雷辐照。
7. 辐照完后，以1000rpm的速度离心5分钟。
8. 移去上清，用适量新鲜的MEF培养液重悬细胞。
用于培养人胚胎干细胞的饲养层细胞标准浓度是～30,000 cells/cm2。
按照此标准铺板。
具体铺板步骤请见3饲养层细胞的准备。
对于暂时不用的细胞，将其冻存，需要时复苏。
具体冻存步骤请见 MEF 的冻存。
3.饲养层细胞的准备材料和仪器CF-1小鼠胚胎成纤维细胞（MEF），货号MEF-CF1-01成纤维细胞完全培养基，货号EFM-01基质胶（Matrigel matrix），BD Pharmingen，货号356235CO2培养箱，Thermo，HERA cell 240Thermo-Fisher Finnpipette F3移液器和灭过菌的枪头T25透气培养瓶，NUNC，货号1563672 ml移液管，NUNC，货号1596175ml移液管，NUNC，货号15962510 ml移液管，NUNC，货号159633电动移液器，Thermo Scientific Finnpipette C1，货号4580800加入足量的基质胶均匀铺到瓶（或孔板或皿）底部，以能覆盖全部底部为准，譬如T25透气培养瓶以超过为宜。
37℃培养箱放置至少30min。
从培养箱中取出瓶（或孔板或皿），轻轻推送板子将未被基质胶覆盖的地方再次覆盖，然后立即吸弃基质胶。
加入适量成纤维细胞完全培养基（37℃预孵育超过10min），譬如T25透气培养瓶以加入4ml为宜。
从液氮中取出冻存的失活过的MEF细胞，立即投入37℃水浴中，迅速解冻（1min之内）。
根据预实验将相应数量的饲养层细胞加到之前已经准备好的瓶（或孔板或皿）中，混匀。
推荐的饲养层细胞密度为3万cells/cm2。
Point饲养层细胞需在ES/iPS细胞传代前两至三天准备。
饲养层细胞的密度最适宜是80－90％, 太密或是太稀疏都容易使干细胞分化。
请在铺被前先做预实验估算细胞的复苏存活率，以一个T25培养瓶计算，若存活率为90%，则铺入的细胞量应为万。
▲Note: 饲养层细胞铺了10天之后推荐不再使用。
培养容器的类型基质胶体积24-well35mmFlask105 cells/ml）4.ES/iPS细胞的复苏材料和仪器人类ES/iPS细胞（SiDSH -01, SiDSH -03），货号HIPS-01/03人类胚胎干细胞完全培养基，货号HESM-01-500CO2培养箱，Thermo，货号HERA Cell 240Thermo-Fisher Finnpipette F3移液器和灭过菌的枪头电动移液器，Thermo Scientific Finnpipette C1，货号4580800T25透气培养皿，NUNC，货号1563675ml移液管，NUNC，货号15962515ml离心管，NUNC，货号366036解冻人ES/iPS细胞，从液氮中取出冰冻的人类ES/iPS细胞冻存管，立即投入37℃水浴中快速的旋转以迅速解冻（控制在1min之内）。
▲Note: 水不要淹没瓶盖当只有一片冰晶存在时，从水中取出冻存管。
用消毒酒精棉将冻存管外壁擦拭一遍，以去除水缸中的微生物。
将细胞转移到一个预装有2ml人类胚胎干细胞完全培养基的15ml离心管中，混匀。
200×g（1000rpm）, 离心5 分钟。
吸弃上清液。
用4ml的人类胚胎干细胞完全培养基重悬细胞沉淀。
转移悬浮液到一个预铺有饲养层细胞的T25瓶中，补加人类胚胎干细胞完全培养基至总体积为5ml。
将瓶放入37℃的CO2培养箱中，观察细胞每天的生长情况。
Point复苏的第二天无需更换培养液，从第三天起每天更换新鲜的人类胚胎干细胞完全培养基。
复苏后第5天左右可以看见微小的克隆出现，之后逐渐长大。
复苏后第10-12天传代，具体情况视ES细胞生长情况而定。
5.ES/iPS细胞的传代材料和仪器人类胚胎干细胞培养液（含bFGF 货号 HESM-01-500 ；不含 bFGF 货号 HESM-02-500）Ⅳ型胶原酶（货号 M-001）已经包被好饲养层细胞的培养瓶/板Thermo-Fisher Finnpipette F3移液器和灭过菌的枪头T25透气培养皿，NUNC，货号1563675ml移液管，NUNC，货号15962515ml离心管，NUNC，货号366036电动吸引器Point当出现以下情况之一即可以进行细胞传代：1． MEF滋养层细胞生长超过两周。
2．克隆太大，或太密集。
3．当培养的ES克隆中出现越来越多的分化。
人的ES细胞传代（以T25培养瓶为例）从培养瓶中吸出旧的人胚胎干细胞培养液立即加入3-4ml的Ⅳ型胶原酶到瓶中，温柔的摇晃培养瓶使之覆盖到所有的细胞。
▲Note: Ⅳ型胶原酶需在37度预热。
将T25瓶重新放回37度培养箱中，放置约20min－30min。
消化期间可以处理预铺了饲养层细胞准备用来传代的新的培养瓶，处理如下：吸弃里面的成纤维细胞完全培养基，加入1ml人类胚胎干细胞培养液（不含bFGF）洗涤feeder（只要将瓶底盖过），吸弃，然后加入4-5ml新的人类胚胎干细胞完全培养基，以备传代。
待克隆消化下来后，取出培养瓶，将瓶中液体连同脱落的克隆转移到15ml离心管里。
加入2ml的人类胚胎干细胞培养液（不含bFGF），混匀。
待干细胞团块沉降下来后，吸弃上清液。
加入2ml新鲜的人类胚胎干细胞培养液（不含bFGF）洗涤细胞（即吹打重悬），待细胞沉降下来后，吸弃上清。
