反相高效液相色谱测定动物源食品中大观霉素残留(精)

反相高效液相色谱测定动物源食品中大观霉素残留作者：苑丽胡功政肖传斌梁军李奎司红彬【摘要】目的建立反相高效液相色谱法配合电化学检测器测定动物源食品中大观霉素残留。

方法用三氯乙酸匀浆抽提以脱去试样中的蛋白，然后用二氯甲烷去除试样中的脂溶性物质，再经LC??SCX阳离子固相萃取小柱净化处理，产物进行检测。

流动相为离子对缓冲体系(0.02mol/L柠檬酸∶0.004mol/L庚烷磺酸钠，50% NaOH调pH至6.10)∶乙腈(体积比为92.5∶7.5)，流速0.6ml/min，工作电极电压1.0V，柱温35℃，检测波长254nm。

结果大观霉素在0.01～10.0μg/ml范围内线性关系良好，相关系数R=0.99998。

结论该法简便、直接、准确。

【关键词】反相高效液相色谱电化学检测器大观霉素残留 Determination of spectinomycin residues in animal food by RP??HPLC ABSTRACT Objective A reversed??phase high performance liquid chromatography (RP??HPLC) method with electrochemical detector was established for the determination of spectinomycin residues in animal food.Methods The samples were deproteinized by trichloroacetic acid, and the fatty soluble substances were extracted with dichloromethane. Followed by cleaned??up on a LC??SCX positive ion solid??phase extraction column, then the extracts were determined. The mobile phase was citric acid ion??pair buffer solution (0.02mol/L citric acid∶0.004mol/L sodium heptanes ulfonate, the pH adjusted to 6.10 by 50% NaOH)∶acetonitrile (92.5∶7.5, V/V). The flow rate was 0.6ml/min, the working electrode voltage was 1.0V, the column temperature was maintained at 35℃, and the detection wavelength was at UV 254nm. Results The linear relationship of the peak and concentration of spectinomycin was determined as 0.01～10.0μg/ml, with a regression coefficient of0.99998. Conclusions The method is simple, direct,andaccurate. KEY WORDS RP??HPLC; Electrochemicaldetector; Spectinomycin; Residues 大观霉素(spectinomycin，曾译壮观霉素)是氨基糖苷类抗生素，主要通过作用于细菌核糖体30S亚基来抑制其蛋白质的合成，对革兰阴性菌(如大肠埃希菌、沙门菌、布鲁菌、变形菌、铜绿假单胞菌、巴氏杆菌等)有较强作用，对革兰阳性菌和支原体亦有一定作用。

我国兽药典兽药使用指南(化学药品卷，2005版)［1］及美国FDA均规定本品在牛、羊、猪、鸡等食用组织中最高允许残留量分别为：肌肉：500μg/kg；脂肪、肝：2000μg/kg和肾：5000μg/kg。

国外一些学者建立了各种HPLC法［2～6］来检测动物源食品中本品的残留，但大观霉素无紫外吸收，必须形成紫外可见光或荧光化合物后才能进行HPLC分析［7，8］，即必须先进行衍化生成相应的衍化物。

迄今为止，所有这些方法即缺乏必要的灵敏度，亦有繁杂的衍化过程，难以推广应用。

1994年美国农业部又建立微生物学方法来检测本品在食品中的残留，但其灵敏度也低，且缺乏特异性。

Elrod等［9］发现大观霉素具有电化学活性，发展了一种使用离子对色谱电化学检测器的方法测定大观霉素，但并未用该法测定生物样品。

Schermerhorn等［10］报道用带有电化学检测器的HPLC来检测牛奶中的大观霉素残留。

我国进出口商品检疫局1997年发布了出口肉及肉制品中大观霉素残留检测的HPLC电化学法，测定方法灵敏度高，但样品提取步骤繁杂，不适用于脂肪组织，其净化过程系用活性炭制柱，处理后的待检液中的杂质仍干扰测定结果。

本方法采用三氯乙酸抽提去除样品中的蛋白、二氯甲烷去除试样中脂溶性物质，经LC??SCX 阳离子固相萃取小柱净化处理，再用反相高效液相色谱配合电化学检测器直接检测动物源食品中残留的大观霉素，结果表明，本方法简单、直接，且回收率、检测限和准确度均可达到相关标准。

1 仪器和试药 1.1 仪器带515泵、2465电化学检测器的高效液相色谱仪(美国Waters公司)、电子天平(感量0.0001g)、高速组织捣碎机、回旋式振荡器、高速冷冻离心机和Supelclean LC??SCX SPE阳离子固相萃取小柱(500mg/3ml，含碳量≥14%)。

1.2 试药大观霉素为山东鲁抗生产，含量不少于99.0%；乙腈(色谱纯，Baker公司)，庚烷磺酸钠(色谱纯，Sigma公司)；水为色谱级超纯水(采用Millipore公司纯水系统自制)；带一个结晶水的柠檬酸、甲醇、氢氧化钠、氯化钠、三氯乙酸和二氯甲烷均为分析纯试剂。

2 方法与结果 2.1 色谱条件色谱柱：C18柱(瑞典AKZO NOBEL Kromasi C18，250mm×4.6mm，5μm)；保护柱(LabALLianceTM C18)；流动相为柠檬酸离子对缓冲体系(0.2mol/L柠檬酸∶0.004mol/L庚烷磺酸钠，50% NaOH调pH至6.10)∶乙腈(体积比为92.5∶7.5)，流速为0.6ml/min，工作电极电压1.0V，柱温35℃，检测波长254nm，进样量20μl，分离结果见图1。

2.2 标准曲线的绘制准确称取大观霉素0.0298g，加水溶解并定容为100ml，配成浓度为200μg/ml的储备液(按有效量计)，置4℃冰箱中保存，一周内用完。

临用前，取此储图1 大观霉素标准溶液的高效液相色谱图(20μg/ml)备液用纯水稀释成0.01、0.02、0.05、0.25、0.5、1.0、2.0、5.0和10.0μg/ml浓度的大观霉素标准溶液，在“2.1”色谱条件下进样，经电化学检测器检测，按其所得峰面积与对应的标准液浓度作标准曲线，并计算回归方程为： A=0.75468+16.53266C R=0.999976 表明大观霉素在0.01～10.0μg/ml范围内线性关系良好。

2.3 样品处理 2.3.1 抽提称取(15g±0.05g)试样，转至一个50ml的离心管中，加入12ml超纯水，在1800r/min条件下用高速组织捣碎机捣1min，取粘稠液18g加50%三氯乙酸2ml和二氯甲烷10ml，在回旋式振荡器上高速振摇30min。

然后在4℃ 3800RCF［RCF=0.0000118×R×N2，R为离心半径(cm)，N 为转速(r/min)］条件下离心30min，取上清10ml，加二氯甲烷2ml，在回旋加速器上振荡混合20min，再在4℃ 12000RCF条件下离心30min，上清液即为药物的抽提液。

2.3.2 净化采用LC??SCX阳离子固相萃取小柱净化。

首先LC??SCX小柱用甲醛活化，再用纯水平衡后，将经“2.3.1”法制得的备用液过柱，起始2ml弃去，收集随后3ml，经水性滤膜(0.45μm)过滤，滤液供HPLC测定。

对肌肉和脂肪内本药的残留测定，可取“2.3.1”法制得的抽提液直接过0.45μm水性滤膜即可。

百事通 2.4 试样中药物残留量计算经“2.3”方法处理过的组织待测试样在“2.1”色谱条件下进样，经电化学检测器检测，空白鸡脂肪组织、鸡肉组织、鸡肝脏组织和鸡肾脏组织HPLC杂质峰不干扰加药(加药量为最高残留限量)后试样的HPLC色谱图(图2)，大观霉素峰依次位于10.43、10.63、10.62和10.54min。

将其所得峰面积带入标准曲线回归方程，可求出试样中残留的药物浓度或药物含量。

2.5 灵敏度、回收率和精密度试验图2 加药鸡脂肪组织的高效液相色谱图(2μg/g)用添加法测定。

分别取猪、鸡空白肌肉、脂肪、肝、肾组织各15.0g，添加适量的大观霉素标准溶液，按“2.3”方法处理后在“2.1”色谱条件下进样，经电化学检测器检测，将其所得峰面积带入标准曲线回归方程，计算大观霉素含量，以加入量与测得量之比计算回收率。

每种组织各测定包括最高残留限量和灵敏度在内的三种添加浓度，每个浓度各测3批样品计算批间变异系数，每批样品各进行5个重复计算批内变异系数。

结果表明，猪、鸡肌肉、脂肪中本品的检测限为100μg/kg，肝脏、肾脏中的检测限为200μg/kg，均低于最高允许残留量［1］。

各浓度点回收率均在71.38%～94.81%范围内。

本方法的批内变异系数在4.19%～9.86%范围之内，批间变异系数在4.86%～12.99%范围之内。

2.6 抗干扰试验鉴于大观霉素在畜禽疾病防治中多与林可霉素复配使用，故进行了林可霉素对大观霉素在本实验条件下的干扰试验。

结果表明，当用同时含10μg/ml林可霉素和10μg/ml大观霉素的标准混合溶液按上述方法进行测定时，无林可霉素色谱峰，仅有大观霉素峰，且其保留时间及峰面积与单独测定10μg/ml大观霉素标准溶液时一致，说明林可霉素对大观霉素的测定无影响。

3 讨论 (1)抽提液的选择氨基糖苷类抗生素与组织成分结合较紧密，从组织样品(尤其是肾)中抽提本品要比从体液中困难的多，迄今为止，报道的方法不多［5，7，11］，且灵敏度不高，只适于测定氨基糖苷类抗生素残留量高的样品(如肾)。

Schermerhorn等［10］报道先用三氯乙酸沉淀试样中的蛋白质，再用二氯甲烷、正己烷、乙酸乙酯按顺序液液萃取，但此试样中的共萃物对色谱柱的分离有干扰，影响了检测的灵敏度，且步骤复杂，回收率低。