瑞氏染色操作流程

外周血涂片的制作方法1、采血：胶头滴管吸取血液，血液直接滴加到洗净烘干并且硅化过的载玻片的一头。

2、推片：将推片的平齐端置载玻片上血滴的稍前方，将推片略向后移使与血液相接触，血液遂于推片与载玻片的夹角间散开。

以约30度的夹角向前均匀地推动推片即可制成血涂片。

其薄厚度要适中，分布均匀而无空泡，边缘整齐。

3、固定：推片做好后，涂片后潮干固定，以免细胞漂落太多，影响制片质量，甲醇固定液固定：涂片直接浸入固定液内，因固定液充足，固定效果较好。

但细胞易脱落而发生交叉污染，因此应该分瓶固定，固定液回收时应过滤。

多数标本用此法固定，固定时间15-30分钟。

4、染色：瑞氏-基姆萨双染1）从固定缸里取出载片后，在室温下通风晾干。

将载片平放在玻璃板上准备染色。

2）所用的两种染料事先过滤好（染料中有颗粒物，会沉淀在载玻片上影响载片的质量）3）将染料滴加到载玻片上以后，让其均匀覆盖住载片上的血细胞，染色时间约为2到3分钟。

等瑞氏染液有变红的趋势时，迅速滴加与瑞氏染液等量的PBS 溶液。

继续染色2到3分钟。

4）染色时间到后，用PBS溶液冲片，小股水流，防止将大量的细胞从载片上冲落下来从而影响以后的观察。

冲片结束后将载片放到阴凉处风干。

5）在玻璃板上放好牙签，将风干的载片倒扣在一根牙签上，从背面滴加基姆萨染液进行扣染。

染色时间约为10分钟。

时间到后用蒸馏水冲片，洗净染液后常温下风干。

5、封片：中性树胶封片，制作成永久涂片。

6、显微观察：将干燥后的血涂片置显微镜下观察。

用低倍镜观察血涂片体、尾交界处的血细胞。

在显微镜下，成熟红细胞染成粉红色；血小板染成紫色；中性粒细胞胞质染成粉红色，含紫红色颗粒；嗜酸性粒细胞含大的桔黄色颗粒；嗜碱性粒细胞胞质含有大量深紫蓝色颗粒；单核细胞胞质染成灰蓝色；淋巴细胞胞质染成淡蓝色。

所需材料：硅化过的载玻片，推片，甲醇瑞氏-基姆萨双染，过滤，PBS，牙签，蒸馏水，中性树胶，显微镜，吸耳球1．载玻片使用前，必须仔细清洗，并用乙醇或软布清洁。

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英文拼写 Wright's stain是由酸性染料伊红和碱性染料美蓝组成的复合染料，溶于甲醇。

后解离为带正电的美蓝和带负电的伊红离子。

使用方法瑞氏（Wright's staim；美蓝－伊红Ｙ）染色：1．瑞氏染料是由碱性染料美蓝（Methvlem blue）和酸性染料黄色伊红（Eostm Y）合称伊红美蓝染料即瑞氏（美蓝－伊红Ｙ）染料。

2．用甲醇作瑞氏染料溶剂，即成瑞氏染液。

甲醇是瑞氏染料良好溶剂，有两种作用：（1）甲醇使瑞氏染料中美蓝（M）与伊红（E）在溶液中离解，可使细胞成分选择性吸附其中的有色物质而着色。

甲醇ME（瑞氏染料）----→M+ + E-在配制的瑞氏染液中美蓝如放置过久即可氧化而含有天青，美蓝天青与伊红化合物能使核染成紫红色，但不能使胞浆染为蓝色，多余美蓝就可以使胞浆染成蓝色，染色主要是化学作用，是离子彼此结合的反应。

（2）甲醇具有强大的脱水力，可将细胞固定在一定形态及增加细胞结构的表面积，提高细胞对染料吸收作用，同时由于甲醇吸附染色液中的水，使染色液升温，加速染色反应。

染液配制(1) 瑞氏染液配制：瑞氏染料 830gm或1g甲醇（AR）500ml或600ml○先称干燥（事先放入温箱干燥过夜）瑞氏染料放置乳钵内，用乳棒轻轻敲碎染料成粉末，再行研磨至听不到研芝麻声即呈细粉末，加少许甘油或甲醇溶解研磨，使染料在乳缸内显“一面镜”光泽，而无染料粉粒沉着。

○再加较多量甲醇研磨呈一面镜光亮，静置片刻，将上层液体倒入一清洁储存瓶内（最好用甲醇空瓶），再加甲醇研磨，重复数次，至乳钵内染料及甲醇用完为止，摇匀，密封瓶口。

○存室温暗处，储存愈久，则染料溶解、分解就越好，一般储存3个月以上为佳。

(2) 缓冲液：●缓冲液作用：○染色对氢离子浓度是十分敏感的，据观察pH值的改变，可使蛋白质与染料形成的化合物重新离解。

○缓冲液须保持一定的pH使染色稳定，PBS的pH 一般在6.4~6.8，○偏碱性染料可与缓冲液中酸基起中和作用，偏酸性染料则与缓冲液中的碱基起中和作用，使pH恒定。

瑞氏染色操作流程一、瑞氏染色实验前准备1.1准备染色液和显影液针对瑞氏染色实验，首先要准备染色液和显影液，染色液由25mL的瑞氏染料，90mL的盐酸溶液（浓度为5％），以及1mL的激发剂混合而成。

而显影液则是在10mL的9N的硫酸、10mL的5％的NaOH溶液、10mL的1％的苯甲醇和10mL的1％的芳香族醇基乙醇混合而成。

1.2准备染色木质菌梗在预先准备瑞氏染色液和显影液后，接下来要准备染色用的木质菌梗才能开始瑞氏染色实验。

首先，用洗碗笠将要染色的木质菌梗洗淨，然后用医用刀在木质菌梗中切出厚约2mm的薄片，最后用蒸汽–水泼淋法将木质菌梗片浸湿，方可准备瑞氏染色实验。

二、瑞氏染色实验操作2.1放置染色片在准备好染色液和显影液，以及木质菌梗薄片后，此时要把准备的的木质菌梗薄片放置在染色槽内，以留出表面空间，方便染色液充分浸渍。

2.2加入染色液之后将准备的瑞氏染色液加入染色槽，在实验室内控制温度为37℃，放置20分钟后，可以观察菌梗表面是否呈染色，一般都可以看到浅色到深色之间的蓝色或紫色染色，这说明瑞氏染色已经取得成功。

2.3加入显影液如果瑞氏染色实验成功，那么接下来可以准备将木质菌梗片洗净后加入显影液了，而此时温度需要将控制在22℃，放置5-10分钟后，可以发现菌梗片变淡，并且半透明，证明显影液已经取得成功。

2.4用x网影像再接着，用X网影像观测染色后的木质菌梗，当观测到菌梗表面开始出现斑斑点点发亮时，这表明染色实验结束，在此基础上对木质菌梗进行另一个体系的判断，也就是对菌梗的形态和染色的准确性进行分类、认定和鉴定。

三、瑞氏染色实验结束完成上述瑞氏染色实验操作后，就可以对经过染色后的木质菌梗进行分析、鉴定，完成木质菌梗的离子吸收率、分子斑点和染色效果等等内容，通过瑞氏染色实验把细菌聚集在一起，以便进行实验分析，这正是瑞氏染色实验取得成功的原因。

瑞氏染液配制、使用方法及注意事项南宁市二医院检验科马升俊1.瑞氏染色的原理：瑞氏染色法使细胞着色既有化学亲和反应，又有物理吸附作用。

瑞氏染料由酸性染料伊红和碱性染料美蓝的氧化物（天青）组成,其深于甲醇后,解离为带正电的美蓝和带负电的伊红离子。

各种细胞由于其所含化学成分不同，对染料的亲和力也不一样，因此，染色后各种细胞呈现出各自的染色特点。

2.试剂的配制：2.1 瑞氏染液的配制：2.1.1 自配染液:瑞氏染粉0.1g，甲醇（AR）60ml。

将瑞氏染粉放入清洁干燥研钵中，先加少量甲醇，充分研磨使染料溶解，将巳溶解的染料倒入棕色试剂瓶中，未溶解的再加少量甲醇研磨，直至染料完全溶解，甲醇全部用完为止。

染液配好后放于室温下，一周后即可使用。

新配制染液效果较差，放置时间延长，染色效果越好。

久置应密封，以免甲醇挥发或氧化成甲酸。

染液中也可加中性甘油2～3ml，除可防止甲醇过早挥发外，也可使细胞着色清晰。

2.1.2 成品瑞氏染液:现巳有成品瑞氏染液，如四川迈克科技公司出的快速瑞氏染色试剂（500ml/瓶）其只需室温密闭储存，可长期稳定，染色效果好。

2.2 缓冲液的配制: 称取磷酸二氢钾（无水）0.3 g，磷酸氢二钠（无水）0.2 g；加蒸馏水至1000 ml使其溶解。

配好后磷酸盐缓冲溶液应校正PH值，其范围在PH6.4～6.8即可，后塞紧瓶口备用。

3. 瑞氏染色的使用方法：（以血涂片为例）：3.1把制好的血涂片编好号，然后将血片平放在染色架上；3.2加瑞氏染液数滴，使其覆盖整个血膜，固定细胞约1分钟；3.3滴加等量或稍多的缓冲液（可按1：2滴加），使染液充分混匀，染色5～10分钟；3.4用流水冲洗去染液,待干后镜检。

4.染色结果判断：在正常情况下，血膜外观染成淡紫红色。

显微镜下，红细胞呈粉红色，在厚薄均匀处，略有碟状感。

白细胞浆中颗粒清楚，并显示出各种细胞特有的色彩。

细胞核染紫红色，核染色质结构清楚。

5.注意事项:5.1 PH对细胞染色有影响。

英文拼写 Wright's stain是由酸性染料伊红和碱性染料美蓝组成的复合染料，溶于甲醇。

后解离为带正电的美蓝和带负电的伊红离子。

使用方法瑞氏（Wright's staim；美蓝－伊红Ｙ）染色：1．瑞氏染料是由碱性染料美蓝（Methvlem blue）和酸性染料黄色伊红（Eostm Y）合称伊红美蓝染料即瑞氏（美蓝－伊红Ｙ）染料。

2．用甲醇作瑞氏染料溶剂，即成瑞氏染液。

甲醇是瑞氏染料良好溶剂，有两种作用：（1）甲醇使瑞氏染料中美蓝（M）与伊红（E）在溶液中离解，可使细胞成分选择性吸附其中的有色物质而着色。

甲醇ME（瑞氏染料）----→M+ + E-在配制的瑞氏染液中美蓝如放置过久即可氧化而含有天青，美蓝天青与伊红化合物能使核染成紫红色，但不能使胞浆染为蓝色，多余美蓝就可以使胞浆染成蓝色，染色主要是化学作用，是离子彼此结合的反应。

（2）甲醇具有强大的脱水力，可将细胞固定在一定形态及增加细胞结构的表面积，提高细胞对染料吸收作用，同时由于甲醇吸附染色液中的水，使染色液升温，加速染色反应。

染液配制(1) 瑞氏染液配制：瑞氏染料 830gm或1g甲醇（AR）500ml或600ml○先称干燥（事先放入温箱干燥过夜）瑞氏染料放置乳钵内，用乳棒轻轻敲碎染料成粉末，再行研磨至听不到研芝麻声即呈细粉末，加少许甘油或甲醇溶解研磨，使染料在乳缸内显“一面镜”光泽，而无染料粉粒沉着。

○再加较多量甲醇研磨呈一面镜光亮，静置片刻，将上层液体倒入一清洁储存瓶内（最好用甲醇空瓶），再加甲醇研磨，重复数次，至乳钵内染料及甲醇用完为止，摇匀，密封瓶口。

○存室温暗处，储存愈久，则染料溶解、分解就越好，一般储存3个月以上为佳。

(2) 缓冲液：●缓冲液作用：○染色对氢离子浓度是十分敏感的，据观察pH值的改变，可使蛋白质与染料形成的化合物重新离解。

○缓冲液须保持一定的pH使染色稳定，PBS的pH 一般在6.4~6.8，○偏碱性染料可与缓冲液中酸基起中和作用，偏酸性染料则与缓冲液中的碱基起中和作用，使pH恒定。

瑞氏姬姆萨染色操作规程生效日期：20150125 页码：第1页共2页1 目的：规范瑞氏姬姆萨染色操作规程，保证染色效果。

2 原理：2.1 染色原理：瑞氏姬姆萨染色液是利用Romanowsky Stain技术原理改良而成。

细胞的着色过程是染料透入被染物并存留其内部的一种过程，此过程既有物理吸附作用，又有化学亲和作用。

各种细胞及细胞的各种成分由于其化学性质不同，对瑞氏-姬姆萨染色液中的酸性染料（伊红）和碱性染料（亚甲蓝）的亲和力也不一样。

因此，标本涂片经瑞氏-姬姆萨染色液染色后，相应各类细胞呈现不同的着色，从而达到辨别其形态特征的目的。

2.2 试剂组成：瑞氏姬姆萨A液（瑞氏染料、姬姆萨染料）瑞氏姬姆萨B液（磷酸盐）3 操作步骤：3.1 滴加瑞氏姬姆萨A液(约0.5ml-0.8ml)涂片上，并让染液覆盖整个标本染色1min；3.2 再将瑞氏姬姆萨B液加于A液上面（滴加量为A液的2-3倍），以嘴或洗耳球吹出微风使液面产生涟漪状，使两液充分混合，染色3-10min。

（染血片时间可略短，染骨髓片时间应视细胞量多少而异）3.3 水洗（冲洗时不能先倒掉染液，应以流水冲去，以防有沉渣沉淀在标本上），干燥、镜检。

4 结果解释：4.1 血细胞涂片、骨髓涂片染色：红细胞呈粉红色，白细胞浆中颗粒清楚，并显示出各种细胞特有的色彩，细胞核染紫红色，核染色质结构清楚。

4.2 阴道分泌物（妇科白带染色）：4.2.1 滴虫：经过染色后的滴虫跟活的滴虫呈现完全不同形态，一般情况下，看不到鞭毛，经过染色后，滴虫多为梨形、圆形、椭圆形或呈不规则形态，浆被染成灰蓝或天蓝色，核小，枣核状，常偏于一侧，需注意观察，避免与上皮细胞混淆。

4.2.2 念珠菌（霉菌）：染成深蓝色，可见芽生孢子，假菌丝细长而直。

4.2.3 白细胞：形态上与血细胞涂片的白细胞相同，一般白细胞的多少，提示发炎程瑞氏姬姆萨染色操作规程生效日期：20150125 页码：第2页共2页度的高低，对医生的诊断具有一定的指标作用。