骨髓细胞学检查骨髓细胞学检查应抽取骨髓少量制成薄片;采用骨髓小粒丰富、制片厚薄均匀的涂片,经瑞氏—姬姆萨混合染色后,于显微镜下检查细胞质和量的变化;试剂1)瑞氏染色液：瑞氏染粉18,置洁净干操的研钵内,加甘油,研磨片刻,使瑞氏染粉充分溶解,加甲醇约50ml,继续研磨片刻后,收集上层染液；残余部分再加甲醇50ml研磨：再收集上层染液,重复几次后,用甲醇冲洗研钵,倒入同一瓶内,最后加甲醇至500mi;开始几周应经常振摇染色液;染色液存放的时间越长,染色效果也越佳;此外,研磨时染粉内应先加甘油,、以免染粉在研磨过程中结成块,更易溶解;染粉未经研磨配成的染液不宜用作骨髓片染色;2)姬姆萨浓缩染液：将姬姆萨染粉3．8g放入纯甘油250ml中,置60℃水浴2小时,溶解后力口60℃预热的甲醇250m1混匀,于室温、棕色瓶内保存,配后数天即可使用,可长期保存;3)pH6．5磷酸盐缓冲液：磷酸二氢钾1．5g,磷酸氢二钠1．0g、加蒸馏水到5000ml;最后纠正pH6．5;4)姬姆萨稀释液：取姬姆萨溶液50m1,加pH6．5磷酸盐缓冲液到500ml,混匀;此液为姬姆萨应用液,可直接作涂片复染用;作瑞氏稀释液时,取此液10一20mL加蒸馏水至100ml,混匀即可;操作1．骨髓取材：取材部位有胸骨、棘突、髂骨前嵴或后嵴等;两岁以内小孩最好用胫骨,成人常取髂后上棘,此部位穿刺方便,病人也易接受．穿刺前要求严格消毒,杜绝细菌感染,除穿刺室紫外线消毒和皮肤消毒外,还应注意穿刺包和手套消毒时间有否过期;戴手套要熟练,避免手套接触来消毒物品;穿刺针进入髓腔时常有脱空感,吸取前针筒内应留有1m1左右的空隙,否则髓液很快进入针筒空隙而无法取出;针筒内若有水份也要用消毒纱布擦干,以免溶解细胞;吸液量一般控制在0．2m1左右;因吸量过多,易被外周血稀释;部分病人干抽或吸出量太少时,不要将针头立即拔出,可边抽边调节针头深浅,或边抽边缓慢外移针头,最后将针头内可能残留的髓液尽量推出、制片,以减少病人痛苦;2．涂片：选两块小粒较多、厚薄均匀的骨髓片,自然干燥后在较厚的头端髓膜上写上病人姓名、日期及“BM”标记;加瑞氏染色液8—12滴,用吸球吹吸并使其布满整张涂片,约半分钟后,加姬姆萨稀释液5-10滴,再用吸球吹吸气,使两液充分混匀,若有金黄色油膜出现,染色效果更佳;染色时间一般为10一20分钟,夏天可缩短些、冬天则可延长些;冲洗时应乎放玻片让流水缓慢冲洗;另外,因手拿玻片处可能会有染料残留,应更换手拿位置再予冲洗;染色太淡的涂片,可用姬姆萨稀释液复染3 分钟；着色太深时,可用瑞氏染液滴加于涂片上;立即冲洗即可;各实验室最好能摸索出自己的染色经验,尽量做到一次性染色成功;没有姬姆萨染液的单位,可用蒸馏水加少量天青或美蓝代替,但染色效果没有前者好;染好的涂片要自然干燥,切忌加热烘干,否则细胞退色而影响观察;3．染色选两块小粒较多、厚薄均匀的骨髓片,自然干燥后在较厚的头端髓膜上写上病人姓名、日期及“BM”标记;加瑞氏染色液8—12滴,用吸球吹吸并使其布满整张涂片,约半分钟后,加姬姆萨稀释液5-10滴,再用吸球吹吸气,使两液充分混匀,若有金黄色油膜出现,染色效果更佳;染色时间一般为10一20分钟,夏天可缩短些、冬天则可延长些;冲洗时应乎放玻片让流水缓慢冲洗;另外,因手拿玻片处可能会有染料残留,应更换手拿位置再予冲洗;染色太淡的涂片,可用姬姆萨稀释液复染3分钟；着色太深时,可用瑞氏染液滴加于涂片上;立即冲洗即可;各实验室最好能摸索出自己的染色经验,尽量做到一次性染色成功;没有姬姆萨染液的单位,可用蒸馏水加少量天青或美蓝代替,但染色效果没有前者好;染好的涂片要自然干燥,切忌加热烘干,否则细胞退色而影响观察;分析要点(1)骨髓片观察的内容:1)肉眼观察涂片有无骨髓小粒、脂肪滴制片、染色是否良好;2)低倍镜下观察骨髓增生情况主要分为5级,标本有否稀释,并计数全片的巨核细胞,了解有无特殊异常细胞;3)高倍镜下观察巨核细胞形态及巨核细胞分类计数一般被分类的巨核细胞应不少于25个,并进一步观察低倍镜下看到的可疑细胞;4)油镜下明确在低、高倍镜发现的异常或可疑细胞的性质,并作骨髓细胞分类和全面的细胞形态分析;骨髓细胞分类计数的正常范围较难制定;因为分析骨髓像是以骨髓细胞变化为基础,并结合临床表现和血像的综合性分析,不能只以单一的比例作为是否正常的标准;另外,个体差异、穿刺是否成功和分类部位等,都会影响细胞分类的结果;2正常骨髓主要指标及其分类原则：1．正常骨髓像主要指标：1 骨髓增生程度呈增生活跃;2 有核细胞量中等,小粒内细胞较丰富;3 涂片无脂肪滴,或在中老年者见少量脂肪滴;4 粒、红细胞比例约2—4：1,粒细胞可占50％,淋巴细胞约占20％小儿可高达40％,单核细胞、浆细胞、网状细胞一般＜3％;5 巨核细胞在1．5×3cm2涂片上可找到20—100只;若小于20只,排除因标本稀释原因外,可结合临床考虑巨核细胞减少;产血小板巨核细胞应不少于总巨核细胞的1／3,成按血小板易见到;6 嗜酸性粒细胞小于5％;嗜碱性粒细胞＜1％;7 原始细胞中,原故细胞和原红细胞均小于2％;8 偶尔可见内皮细胞、组织嗜碱细胞、组织嗜酸细胞、成骨细胞、破骨细胞和脂肪细胞等;2．观察骨照片应注意的事项：1 对介于上、下两阶段的同一系细胞,应按划下不划上的原则分类;对分类曲线出现不明原因的畸形分布时,介于上、下阶段的细胞可适当调整其阶段性；2 一般病人的骨髓片中,偶见或为疑似的原始单核细胞、原始淋巴细胞小儿除外及原始浆细胞,可不作报告或归于原始粒细胞中,以减少分类出现的混乱;3 骨髓细胞分类计数不应少于200个,否则分类误差太大,较难反映细胞的其实分布情况;4 书写报告时要对粒、红、巨三系细胞比例、形态变化分别描写,有特殊变化的情况,尤其对临床诊治有价值的细胞应另加说明;骨髓报告的结论应结合临床和其他实验室检验加以考虑,对尚不明确的结果只须描写看到的内容,不要任意下结论;5 骨髓片若出现下列情况,则提示标本全部或部分稀释;无骨髓小粒或有少量骨髓小粒,小粒内细胞丰富,但涂片有核细胞量减①少;②外周血中血小板量正常或增多,但涂片巨核细胞量减少;③成熟阶段粒细胞比例明显增高,而有核细胞量却减少;当怀疑骨髓有转移性肿瘤时,不管涂片是否稀释,应看完所有涂片,尤其要6注意涂片的头尾及两侧部位,是否有成堆排列的肿擅细胞;常见血液病骨髓像诊断要点：1缺铁性贫血IDA：成熟红细胞体积偏小,幼红细胞呈现核固缩和胞浆量少及着色偏蓝等核老、浆幼的核浆发育不平衡现象;外铁明性,含内铁细胞减少;此类贫血最常见,临床上常有胃病、痔疮和月经多等病史;2巨幼细胞性贫血MA：成熟红细胞体积偏大,可见巨大的红细胞,幼稚红细胞常呈核染色质疏松、浆量增多、着色偏红等核幼、浆老的核浆发育不平衡现象;且可找到巨大晚幼粒和杆状核粒细胞,分叶核粒细胞分叶也偏多;巨核细胞核分叶增多,但不出现多个小核的巨核细胞,巨核细胞浆内易见由核染色质脱落下来的核小体该类细胞约占巨核细胞20—30％;临床上常有胃肠手术、营养不良和妊娠等情况;外周血像常出现3系减少;3溶血性贫血HA：骨髓幼红细胞显着增生,其总比例常大于50％,但以中、晚幼红细胞增生为主,并可见球形红细胞、椭圆形红细胞等特殊形态的变化;此病临床资料对诊断尤为重要,病人常出现黄疽、尿胆原和间接胆红素增高,网织红细胞常大于5％;急性溶血时,外周血像可出现幼红细胞;抗人球蛋白试验和酸溶血试验常出现阳性;4再生障碍性贫血AA：骨髓小粒呈空架状,脂肪球增多;粒、红、巨三系细胞减少,其中以巨核细胞减少更为明显,成熟淋巴细胞比例相对增高,网状细胞、浆细胞、嗜碱组织细胞常偏多;血像3系减少,但脾脏不肿大;5骨髓增生异常综合征MDS：红细胞可见多核、核碎裂及巨幼样变,成熟粒细胞分叶减少或增多,粒细胞脑浆颗粒减少或无或过大而多,核浆发育不平衡;易见多个小核的颗粒巨核细胞和微小型巨核细胞;此类病人外周血像易见幼稚红细胞和幼稚粒细胞,成熟单核细胞常增多;临床抗贫血治疗效果差;诊断MD3后,按骨髓和外周血像中原始细胞多少,有否环状铁粒幼红细胞可分为难治性贫血RA、难治性贫血伴环状铁粒幼红细胞增多RAS、伴原始细胞增多的难治性贫血RAEB、转化中原始细胞片增多的难治性贫血RABBT4型,至于授性粒单细胞性白血病CMMl已属白血病可不再列入MDS;RA：外周血原始细胞无或＜1％,骨髓原始细胞＜5％;RAS：同RA,但骨髓中环形铁粒幼细胞,为铁粒细胞的15％以上;RAEB：外周血原始细胞＜5％,骨髓原始细胞5-20％;良AEBT：外周血原始细胞＞5％,骨髓原始细胞20、30％;6慢性粒细胞性白血病CML：粒系极度增生,以晚幼粒细胞和杆状粒细胞增生为主,嗜碱性粒细胞易见;血片中白细胞增多并出现中、晚幼粒细胞,嗜碱性粒细胞比例增高;临床上出现乏力,巨脾等;碱性磷酸酶NAP 积分明显减低;7慢性淋巴细胞性白血病CLL：成熟淋巴细胞明显增多,其比例占50％以上;原始和幼稚的淋巴细胞少见,不出现异型淋巴细胞;其他各系细胞增生情况不一;血像白细胞增高,成熟淋巴细胞明显增多;发病年龄较大,常伴有乏力、脾脏肿大;8急性淋巴细胞性白血病ALL：区分是ALL还是急性非淋巴细胞性白血病ANLL,对临床用药和病人的预后有重要意义,因此,报告时应慎重;ANLL可分为M0、M1、M2、M3、M4、 M5、 M6和M7等亚型; M0为极低分化的髓性白血病,其诊断与M7一样要结合免疫标记和电镜、组化;ALL分L1、L2、L3 3亚型,其各亚型特点见表;与急非淋巴细胞相比,原始和幼稚淋巴细胞体积小,胞浆量少,较透明,无颗粒及奥氏小体,核染色质粗,排列致密,着色深紫红色,核仁小而少,组织化学染色的POX或SB阳性率＜3％;此型白血病以儿童多见,预后较好;9急性粒细胞性白血病AGL：原始粒细胞、异常早幼粒细胞或中性中幼粒细胞显着增多;其白血病细胞浆较丰富,着色灰蓝,可见较粗大的非特异性颗粒单核细胞的颗粒常较细小,易见粗大奥氏小体;核染色质粗颗粒状,排列较规则;核仁清晰,数目1—4个;急性粒细胞性白血病又分为Ml、 M：包括M：．和M2b亚型、 M：包括M3n和M：b亚型3型; M,的骨馈原始粒细胞≥90％非红系分类,即NEC;M2l的骨髓原始粒细胞＞30一＜90％NEC,单核细胞＜20％,早幼粒及其以下各阶段细胞＞10％;M2b以异常中性中幼粒细胞增生为主,该类细胞核浆发育不平衡,可见核仁,数量＞30％,原始或早幼阶段细胞也同时增多;M”的早幼粒细胞布满粗大的非特异性颗粒,该类细胞大小不一,核形态不规则,可见内、外浆;M3b的早幼粒细胞布满细小的非持异性颗粒,形态变化同M30;该类白血病细胞数量＞30％NEC, POX或SB染色常强阳性;10急性单核细胞性白血病AMOL：该型的白血病细胞脑浆丰富,着色灰蓝,可有细小、散在颗粒,奥氏小体较细长,核形态不规则,有外折内切现象,核染色质呈细沙状,排列成疏松租网状,着色偏淡;核仁较大,数量少;根据白血病细胞分化程度,又可分为M5t和M5b型; M50的骨髓原始单核细胞＞80％NEC,为未分化型; Msb的骨髓原始单核细胞＜80％NEC,但原始和幼稚单核细胞＞30％NEC,为部分分化型;与粒细胞区别的组织化学染色是非特异性脂酶NSE阳性,且受氟化钠NaF抑制,而粒细胞的NSE阴性或弱阳性且不受NaF抑制;11真性红细胞增多症PV：红系增生活跃,幼红细胞形态正常,各期幼红细胞比值可有不同程度的增高, Hb＞180 g／L,红细胞量＞7×1012/L;皮肤和粘膜呈暗红色,脾肿大;12红白血病M6：骨髓中红系＞50％,且伴有形态学的异常,骨髓中原始粒细胞或原始、幼稚单核细胞＞30％NEC；若外周血中原始粒细胞或原始、幼稚单核细胞＞5％,骨髓原始粒细胞或原幼单核细胞＞20％ NEC；单纯原始红细胞,早幼红细胞显着增多者;13巨核细胞白血病M7：骨髓原始巨核细胞＞30％, 该类细胞为原粒或原淋细胞大小,胞浆丰富,常有伪足状突起;此型易与ALL混淆,诊断时要结合电镜组化和免疫标记测定;14粒细胞缺乏症：粒细胞显着减少,早期阶段,中性粒细胞可示“左移”现象;典型发作时,各阶段的中性粒细胞极度减少,但各阶段的红、巨两系细胞常无明显改变;临床上常伴有感染、高热等症状;外周血中性粒细胞极度减少或消失;15粒细胞减少症：粒系统增生不良,成熟障碍,部分粒细胞可出现空泡、中毒性颗粒;外周血中性粒细胞绝对值常在1—1．8×109/L之间;可由感染、化学或物理损伤、造血系统疾病、巨脾、胶原性疾病等所致;16原发性或免疫性血小板减少性紫癜ITP：骨髓巨核细胞量明显增多,少数病人可正常或轻度减少;产血细胞;瘤细胞分布常为弥漫性的,可引起广泛的骨路破坏和骨髓功能抑制,故有核细胞量常偏少;临床上常有骨痛史,X 片示骨质虫蚀样改变;并免疫球蛋白测定异常,成熟红细胞在涂片上呈串钱状排列,血沉明显加快,部分病人尿中可检出本周蛋白;17急性粒、单核细胞性白血病AMML：此白血病同时含有原始或早幼粒细胞和原始或幼稚单核细胞;根据两系血小板巨核细胞比例减低,病人常出现脾肿大、血小板抗体增高、皮肤有出血点等;18传染性单核细胞增多：骨髓中可见淋巴细胞稍增多,有少量异形淋巴细胞;主要表现在血片中成熟淋巴细胞在40一90％之间,其中多数细胞为胞浆增多,并有空泡的异形淋巴细胞,该类细胞易误认为单核细胞或原始细胞,但其核的变化小于胞浆的变化,结合临床上有发热、脾肿大及以青少年多见等,可作出判断;19脾功能亢进：骨髓增生明显活跃,粒、红、巨3系均示明显增生,粒系成熟障碍,巨核细胞系的产血小板巨核细胞减少,晚幼红细胞比例偏高,外周血有两系或三系减少,脾脏肿大;20骨髓纤维化：骨髓有核细胞偏少,骨髓和血片中均可见到泪滴状红细胞,骨髓穿刺时常为干抽,临床上脾明显肿大,贫血,外周血易见幼稚红细胞和幼稚粒细胞;此病诊断应结合骨髓活检;21纯红细胞再生障碍性贫血PRAA：幼红细胞显着减少,常小于5％,但粒系和巨核细胞系无明显异常;外周血中单纯红细胞减少或血红蛋白降低,白细胞和血小板多正．常或略低,网织红细胞明显减低;此病常与免疫功能紊乱有关;22多发性骨髓瘤MM：原始浆细胞、幼稚浆细胞或成熟浆细胞明显增多,该类细胞为恶性的浆细胞,即骨髓瘤的白血病细胞比例不一,又分M4a、M4b、M4c、M4EO4型;m4a是以原始和早幼粒细胞为主,原始单核细胞加幼稚单核细胞＞20％NEC； M4b以原始、幼稚单核细胞增生为主,原始．粒细胞和早幼粒细胞＞20％NEC； M4c的原始细胞既具有粒系细胞特征又具有单核细胞特征的细胞＞30％NEC,此型细胞形态较难识别,要结合免疫标记测定； M4EO除上述特征外,嗜酸性粒细胞占5—30％;23骨髓转移性肿瘤：以成堆出现的肿瘤细胞为特征,该类细胞核染色质疏松,有核仁,脑浆量多少不一,但胞界常不清;转移到骨髓的神经母细胞瘤,可见菊花状排列;此类病人的骨韶有核细胞量常明显减少或伴标本稀释,可找到坏死成分,个别病人涂片需找许多张才能发现堆集的肿瘤细胞;临床上常有骨痛、低热和消瘦等病史;24恶性组织细胞病：除可找到较多吞噬细胞、淋巴样、单核样组织细胞外,还可见到巨大的恶性组织细胞和多核巨组织细胞,该类细胞体积大可达30-40um,胞浆多,着色深蓝,核大,染色质粗、着色深紫红色,核仁大;血3系减少,持续高热,脾肿大; NAP积分减低;部分恶性组织细胞要与大恶性淋巴细胞瘤相鉴别;25其他不明原因发热的病人骨髓像：常以反应性骨髓像报告之;主要特征有粒细胞成熟障碍,毒性变；网状细胞增多,有时可见少量吞噬型网状细胞和淋巴样、单核样组织细胞；易见浆细胞、单核细胞;特殊情况下,可找到疟原虫或伤寒特征细胞等;此类病人常为各类微生物细菌、病毒、立克次体等感染或免疫系统疾病所致,控制病因后,骨髓像可自然好转;个别病人的发热可能是恶性淋巴瘤所致,但可找到淋巴母细胞或淋巴瘤细胞,但其诊断应结合病理活检再确定;。
