猪肺炎支原体P97TaqMan_BHQ荧光定量PCR检测方法的建立及应用

中图分类号：Ｓ　８５２．６２　文献标志码：Ａ　文章编号：１６７３－４６９６（２０１２）１２－１２６８－０５猪肺炎支原体Ｐ９７ＴａｑＭａｎ－ＢＨＱ荧光定量ＰＣＲ检测方法的建立及应用武昱孜１，靳蒙蒙１，２，白方方１，张　旭１，华利忠１，雷治海２，邵国青１＊（１．江苏省农业科学院兽医研究所农业部兽用生物制品工程技术重点实验室国家兽用生物制品工程技术研究中心，江苏南京　２１００１４；２．南京农业大学动物医学院，江苏南京　２１００１４） 摘要：根据猪肺炎支原体（Ｍｈｐ）Ｐ９７基因的保守序列设计合成了引物和ＴａｑＭａｎ－ＢＨＱ探针，建立了快速检测Ｍｈｐ的ＴａｑＭａｎ－ＢＨＱ荧光定量ＰＣＲ方法。

结果显示，该方法特异性良好，与其他病原不发生交叉反应；最低检测限可达１０ｃｏｐｉｅｓ／μＬ，敏感性高；不同梯度定量模板的拷贝数的对数值与Ｃｔ值之间的线性关系表达式为Ｃｔ＝－３．４２６×ｌｇ（ｃｏｎｃ）＋４３．３４３，有良好的线性关系，标准曲线的相关系数为０．９９７，扩增效率为９５．８５％，重复性良好。

对江苏省某猪场的４８份猪肺组织进行荧光定量ＰＣＲ检测，结果有４３份肺组织呈现阳性，阳性检出率为８９．５８％，比巢式ＰＣＲ的敏感性高。

表明，该检测方法能用于Ｍｈｐ的快速检测，可对猪支原体肺炎的早期诊断和流行病学调查提供新的技术手段。

关键词：猪肺炎支原体；Ｐ９７基因；荧光定量ＰＣＲ；ＴａｑＭａｎ－ＢＨＱ探针Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ａｎｄ　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＴａｑＭａｎ－ＢＨＱ　ｒｅａｌ　ｔｉｍｅ　ＰＣＲ　ａｓｓａｙｆｏｒ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ　ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ　Ｐ９７ＷＵ　Ｙｕ－ｚｉ　１，ＪＩＮ　Ｍｅｎｇ－ｍｅｎｇ１，２，ＢＡＩ　Ｆａｎｇ－ｆａｎｇ１，ＺＨＡＮＧ　Ｘｕ１，ＨＵＡ　Ｌｉ－ｚｈｏｎｇ１，ＬＥＩ　Ｚｈｉ－ｈａｉ　２，ＳＨＡＯ　Ｇｕｏ－ｑｉｎｇ１（１．Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｊｉａｎｇｓｕ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ／Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　ＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｔｈｅ　Ｍｉｎｉｓｔｒｙ　ｏｆ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ／Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　ｏｆＶｅｔｅｒｉｎａｒｙ　Ｂｉｏ－ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｎａｎｊｉｎｇ２１００１４，Ｃｈｉｎａ；２．Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｎａｎｊｉｎｇ　ＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ２１００１４，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ａ　ｐａｉｒ　ｏｆ　ｐｒｉｍｅｒｓ　ａｎｄ　ＴａｑＭａｎ－ＢＨＱ　ｐｒｏｂｅ　ｗｅｒｅ　ｄｅｓｉｇｎｅｄ　ａｃｃｏｒｄｉｎｇ　ｔｏ　ｔｈｅ　Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ　ｈｙｏ－ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（Ｍｈｐ）Ｐ９７ｓｅｑｕｅｎｃｅ，ａｎｄ　ＴａｑＭａｎ－ＢＨＱ　ｒｅａｌ　ｔｉｍｅ　ＰＣＲ　ａｓｓａｙ　ｗａｓ　ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ　ｆｏｒｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｍｈｐ．Ｉｎ　ｒｅｓｕｌｔ，ｔｈｅ　ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ　ｍｅｔｈｏｄ　ｃｏｕｌｄ　ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ　ｄｅｔｅｃｔ　Ｍｈｐ，ａｎｄ　ｈａｄ　ｎｏ　ｃｒｏｓｓ－ｒｅａｃｔｉｏｎｗｉｔｈ　ｐａｔｈｏｇｅｎｓ　ｏｆ　ｏｔｈｅｒ　ｓｗｉｎｅ　ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｔｈｅｒｅ　ｗａｓ　ａｎ　ｅｘｃｅｌｌｅｎｔ　ｌｉｎｅａｒ　ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ　ｄｕｒｉｎｇ　ｔｈｅ　ＤＮＡ　ｃｏｎｃｅｎ－ｔｒａｔｉｏｎ　ｆｒｏｍ　１０１　ｃｏｐｉｅｓ／μＬ　ｔｏ　１０７　ｃｏｐｉｅｓ／μＬ．Ｔｈｅ　ａｎａｌｙｔｉｃ　ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　ａｓｓａｙ　ｗａｓ　１０ｃｏｐｉｅｓ／μＬ．Ｔｈｅｅｑｕａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ａｓｓａｙ　ｗａｓ　Ｃｔ＝－３．４２６×ｌｇ（ｃｏｎｃ）＋４３．３４３，ｔｈｅ　ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ　ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｓｔａｎｄａｒｄ　ｃｕｒｖｅｗａｓ　０．９９７，ａｎｄ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ　ｗａｓ　９５．８５％ｗｉｔｈ　ｇｏｏｄ　ｒｅｐｅａｔａｂｉｌｉｔｙ．Ｔｈｅ　４８ｐｉｇ　ｌｕｎｇ　ｔｉｓｓｕｅｓ　ｆｒｏｍｐｉｇ　ｆａｒｍｓ　ｉｎ　Ｊｉａｎｇｓｕ　Ｐｒｏｖｉｎｃｅ　ｗｅｒｅ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ，ａｎｄ　ｔｈｅ　ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｒａｔｅｓ　ｗｅｒｅ　８９．５８％．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔｔｈｅ　ＴａｑＭａｎ－ＢＨＱ　ｒｅａｌ　ｔｉｍｅ　ＰＣＲ　ｃａｎ　ｂｅ　ｕｓｅｆｕｌ　ｆｏｒ　ｒａｐｉｄ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｍｈｐ　ｉｎ　ｃｌｉｎｉｃ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｆｏｒ　ｅｐｉ－ｄｅｍｉｃ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｌ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａ　ｏｆ　ｓｗｉｎｅ　ｉｎ　ｆｉｅｌｄ　ｓｔｕｄｙ．Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ　ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ；Ｐ９７ｇｅｎｅ；ｒｅａｌ　ｔｉｍｅ　ＰＣＲ；ＴａｑＭａｎ－ＢＨＱ　ｐｒｏｂｅ 猪支原体肺炎（ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｌ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａ　ｏｆｓｗｉｎｅ，ＭＰＳ）又称“气喘病”，是由猪肺炎支原体（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ　ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ，Ｍｈｐ）引起的一种慢性接触性传染病，以高发病率和低死亡率为特点，世收稿日期：２０１２－０６－２８；修回日期：２０１２－０９－２９基金项目：江苏省农业自主创新基金项目［ＣＸ（１１）２０５９］；国家自然科学基金项目（３１１００１３５）作者简介：武昱孜（１９８４－），女，山西太谷人，硕士。

＊通讯作者，Ｅ－ｍａｉｌ：８４３９１９７３＠１６３．ｃｏｍ中国兽医科学　２０１２，４２（１２）：１２６８－１２７２Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ　Ｓｃｉｅｎｃｅ界范围内广泛流行，且易引起猪呼吸道疾病综合征（ｐｏｒｃｉｎｅ　ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ　ｄｉｓｅａｓｅ　ｃｏｍｐｌｅｘ，ＰＲＤＣ），严重威胁养猪业的发展［１］。

荧光定量ＰＣＲ（ｒｅａｌ　ｔｉｍｅ　ＰＣＲ）因具有精确度高、特异性强、重复性好、自动化程度高［２］等优点，已成为疾病诊断的良好工具，可快速、灵敏地对病原进行定性和定量检测，使ＰＣＲ扩增和产物分析的全过程均在单管封闭条件下进行，并通过微机控制，实现了对ＰＣＲ扩增产物进行实时动态检测和自动分析［３－６］，可以动态地研究病原数量与疾病发生和发展的规律，从而为疾病的早期诊断和药物疗效观察［７－８］提供参考，具有极大的应用价值。

本研究选择了具有高度保守性的Ｍｈｐ　Ｐ９７基因作为研究对象，根据Ｐ９７基因序列设计了特异性引物和探针，建立了ＴａｑＭａｎ－ＢＨＱ荧光定量ＰＣＲ检测方法，并对该方法的敏感性、特异性进行试验，旨在建立成熟、稳定的Ｍｈｐ　Ｐ９７检测方法，为ＭＰＳ的流行病学调查以及疫病诊断和监测提供技术储备。

１　材料与方法１．１　菌（毒）株、质粒载体及病料 猪肺炎支原体（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ　ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ，Ｍｈｐ）、猪鼻支原体（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ　ｈｙｏｒｈｉｎｉｓ，Ｍｈｒ）、鸡毒支原体（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ　Ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ，ＭＧ）、副猪嗜血杆菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｐａｒａｓｕｉｓ，ＨＰＳ）、猪圆环病毒２型（ｐｏｒｃｉｎｅ　ｃｉｒｃｏｖｉｒｕｓ　ｔｙｐｅ　２，ＰＣＶ２）、猪胸膜肺炎放线杆菌（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ，ＡＰＰ）、猪瘟病毒（ｃｌａｓｓｉｃａｌ　ｓｗｉｎｅ　ｆｅｖｅｒ　ｖｉｒｕｓ，ＣＳ－ＦＶ）和猪流感病毒（ｓｗｉｎｅ　ｉｎｆｌｕｅｎｚａ　ｖｉｒｕｓ，ＳＩＶ）均由江苏省农业科学院兽医研究所家畜重大疫病防制研究室保存。

大肠杆菌Ｔｒａｎｓ５α感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司。

质粒载体ｐＭＤ１８－Ｔ购自大连宝生物工程有限公司。

４８头猪由江苏省某猪场提供，４８份肺组织由江苏省农业科学院兽医研究所家畜重大疫病防制研究室剖杀提供。

１．２　主要试剂及仪器 ＤＮＡ提取、ＰＣＲ产物回收试剂盒为天根生物技术有限公司产品。

Ｐｒｅｍｉｘ　Ｅｘ　Ｔａｑ（Ｐｅｒｆｅｃｔ　ＲｅａｌＴｉｍｅ）为大连宝生物工程有限公司产品。

ＡＢＩ　７５００实时荧光定量ＰＣＲ仪为美国Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ公司产品。

１．３　引物、探针的设计与合成 根据ＧｅｎＢａｎｋ上登录的猪肺炎支原体Ｐ９７全基因序列（ＣＰ００２２７４．１），利用Ｐｒｉｍｅｒ　５．０软件设计引物，进行Ｐ９７基因编码区的扩增，其引物序列为：Ｍｈｐ　Ｐ９７／Ｆ：５′－ＧＣＣＴＴＧＧＴＡＴＧＡＣＴＧＧＡＴＣＴＣ－３′，Ｍｈｐ　Ｐ９７／Ｒ：５′－ＣＧＣＧＡＡＡＴＣＣＴＧＡＧＧＡＴＴ－ＴＡＧ－３′，该引物由南京金斯瑞生物科技公司合成，产物长度为４６０ｂｐ。

根据ＧｅｎＢａｎｋ上登录的Ｍｈｐ　Ｐ９７全基因序列，设计合成了ｒｅａｌ　ｔｉｍｅ　ＰＣＲ引物对Ｍｈｐ　ｒｅａｌ／Ｆ和ｒｅａｌ／Ｒ及Ｍｈｐ　ｒｅａｌ　Ｐ探针，其上、下游引物扩增的片段长度为９０ｂｐ。

引物序列为：Ｍｈｐ　ｒｅａｌ／Ｆ：５′－ＣＣＡＧＡＡＣＣＡＡＡＴＴＣＣＴＴＣＧＣＴＧ－３′；Ｍｈｐ　ｒｅａｌ／Ｒ：５′－ＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＣＴＴＣＡＴＣＴＧＧＧＣＴＡ－３′。

探针序列为：Ｍｈｐ　ｒｅａｌ／Ｐ：５′－ＦＡＭ－ＡＧＣＡＧＡＴＣＴ－ＴＡＧＴＣＡＡＡＧＴＧＣＣＣＧＴＧ－ＢＨＱ－３′。

引物和探针均由南京金斯瑞生物科技公司合成。

１．４　阳性标准品的制备 用Ｔｉａｎｇｅｎ公司的柱式细菌ＤＮＡｏｕｔ试剂盒提取Ｍｈｐ菌种的基因组ＤＮＡ，以提取的产物为模板，Ｍｈｐ　Ｐ９７／Ｆ、Ｐ９７／Ｒ为引物，常规ＰＣＲ扩增ＭｈｐＰ９７基因。

２５μＬ反应体系为：１０×缓冲液２．５μＬ，ＭｇＣｌ２（２．５ｍｍｏｌ／Ｌ）２．０μＬ，ｄＮＴＰ（２．５ｍｍｏｌ／Ｌ）２．０μＬ，Ｐ９７／Ｆ　１．０μＬ，Ｐ９７／Ｒ　１．０μＬ，Ｔａｑ酶（５Ｕ／μＬ）０．３μＬ，ｄｄＨ２Ｏ　１１．２μＬ，模板ＤＮＡ　５．０μＬ。

反应程序为：９５℃５ｍｉｎ；９５℃３０ｓ，５８℃３０ｓ，７２℃１ｍｉｎ，共３０个循环；７２℃１０ｍｉｎ。

取扩增产物５．０μＬ于１０ｇ／Ｌ琼脂糖凝胶中进行检测。

将切胶纯化的ＰＣＲ产物与ｐＭＤ１８－Ｔ载体连接，转化Ｅ．ｃｏｌｉ　Ｔｒａｎｓ５α，构建重组质粒ｐＭＤ１８－Ｔ－Ｐ９７。

按照ＡｘｙＰｒｅｐ质量ＤＮＡ小量试剂盒提取重组质粒作为标准品，用于ｒｅａｌ　ｔｉｍｅ　ＰＣＲ扩增。