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第二章基因工程的酶学基础-文档资料

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第二章基因工程的酶学基础

第二章基因工程的酶学基础
P OH
经同尾酶消化的DNA末端连接示意图
BamH I 5' XXXXGGATCCXXXXXX 3' 3' XXXXCCTAGGXXXXXX 5'
Bgl II 5' XXXXAGATCTXXXXXX 3' 3' XXXXTCTAGAXXXXXX 5'
5' XXXXG GATCCXXXXXX 3' 3' XXXXCCTAG GXXXXXX 5'
限制性核酸内切酶的分类
I型
II 型
III 型
1. 限制修饰活性 单一多功能的酶 限制酶和修饰酶分开 双功能酶
2. 内切酶的蛋白 3种不同亚基
单一成分
2种亚基
质结构
3. 限制辅助因子 ATP、Mg2+和S- Mg2+ 腺苷甲硫氨酸
ATP、Mg2+和S腺苷甲硫氨酸
4. 切割位点
5. 特异性切割 6. 基因克隆中
距特异性位点 1000bp 不是
无用
特异性位点及其附近 特异性位点3‘端 24-26bp处
是
是
非常有用
有用
限制性核酸内切酶的命名
属名
种名
株名
Haemophilus influenzae d 嗜血流感杆菌 d株
H i n d III H i n d III
同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶
第一节 限制性核酸内切酶
4×10 — 4 1
大肠杆菌B
10 — 4
大肠杆菌K
1 E.O.P 成斑率
efficiency of plating
50年代初发现了由寄主控制的限制和修饰现象

工学基因工程第2章酶学基础2DNA连接酶

工学基因工程第2章酶学基础2DNA连接酶
• DNA片段末端同聚物加尾后连接（用末端 脱氧核苷酸转移酶（TdT）给具平末端的 DNA片段加上poly(dA)、 poly(dT)、 poly(dC)、 poly(dG)尾巴之后，再用DNA 连接酶将它们连接起来） P133
• 黏性末端修饰成平末端后再连接
3’突出末端
DNA片段末端同聚物加尾后连接
• 所谓连杆(1inker)，是指用化学方法合成的一 段由10～12个核苷酸组成的、具有一个或数个 限制酶识别位点的寡核苷酸片段。
• DNA片段末端加上化学合成的连杆，能形成黏 性末端，连接后可用内切酶进行切割。
• 连杆的5’-末端和待克隆的DNA片段5’末端，用多核苷酸激酶处理使之磷酸 化，然后再通过T4DNA连接酶的作用 使两者连接起来。接着用适当的限制 酶消化具有连杆的DNA分子和克隆载 体分子，这样的结果使二者都产生出 了彼此互补的黏性末端。于是便可以 按照常规的黏性末端连接法，将待克 隆的DNA片段同载体分子连接起来。
nick P OH
DNA连接酶
5‘…G--C--T--C--T--G--C--A--G--G--A--G … 3’
3‘…C--G--A--G--A--C--G--T--C--C--T--C … 5’
• 修复与RNA链结合的DNA链上切口处的磷 酸二酯键
5‘…G--C--U--C--U--G--C--A--G--G--A--G … 3’
这种方法的优点是定向连接克隆，筛选方便。 缺点则是PCR产物的酶切和判断比较困难，另 外酶切连接过程本身也相当的费时、费力。
现象：普通的Taq酶会自动给PCR产物的3’末端添 加一个A（3’ -A） ，因此不能直接将PCR产物末 端抹平后连接。
解决方法： • Fill in the ends with Klenow（Klenow酶处理PCR产物将

基因工程的酶学基础

基因工程的酶学基础

DNA甲基化对酶活性的影响 •大多数大肠杆菌菌株中含有Dam甲基化酶 和Dcm甲基化酶。 •Dam可以在GATC序列中腺嘌呤N-6位上 引入甲基 •Dcm在CCA/TGC序列的第一个胞嘧啶C-5 位置上引入甲基。 •部分限制性内切酶对甲基化的DNA不能切 割，如FbaI和MboI等。
通常有两种方法： ①选用上述酶的同功酶，如Sau3AI，DNA 识别切割位点与MboI相同；但不受甲基化 影响； ②利用甲基化酶缺失的受体细胞进行DNA 的制备，如E. coli & nbsp; JM110和链霉菌 等，前者Dam和Dcm甲基化酶已敲除，而 后者细胞内本就没有甲基化酶，从这些细 胞中抽提的DNA就能被上述酶切割。
CATG
SAGE Tag 5
CATG
SAGE Tag 2
SAGE Tag 4
SAGE Tag 6
•II型限制性内切酶的酶切位点位于识别位点之中或
附近，产生以下4种情况。 ① 5’粘性末端；② 3’粘性末端；③ 平末端和 ④ 非互补的粘性末端 •无论DNA的来源如何，只要是使用同一种限制性内 切酶，所留下的残端都是一样的。 •经酶切后，5’端总是保留一个磷酸根；3’端总是 保留一个OH
第二讲 基因工程的酶学基础
本节内容
•限制性内切酶—主要用于DNA分子的特异切割 •DNA甲基化酶—用于DNA分子的甲基化 •核酸酶—用于DNA和RNA的非特异性切割 •核酸聚合酶—用于DNA和RNA的合成 •核酸连接酶—用于DNA和RNA的连接 •核酸末端修饰酶—用于DNA和RNA的末端修饰 •其它酶类--用于生物细胞的破壁、转化、核酸纯化、 检测等。
Ⅱ型限制性内切核酸酶的基本特性
1.具有高度特异性的识别位点与酶切位点。 2.辅基： Mg++。 特定识别序列一般长4 - 8对碱基； 大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧；

第2章基因工程的酶学基础

第2章基因工程的酶学基础
第2章 基因工程的酶学基础
限制性内切酶
DNA连接酶
DNA聚合酶和反转录酶
DNA修饰酶
外切核酸酶
单链内切核酸酶
RNA酶
核酸酶：水解相邻的两个核苷酸残基之间 的磷酸二酯键，从而使核酸分子断链。 根据水解的不同方式，分为：
外切核酸酶（exonuclease） 内切核酸酶（endonuclease）
5' …C TGCA▼G…3' 3' …G▲ACGT C…5' Pst I 5' …CTGCA3’ G…3' 3' …G 3’ACGTC… 5'
（3）在对称轴中心同时切割双链，产生平 末端或称钝性末端（blunt end），如SmaI：
5' …CCC▼GGG…3' 3' …GGG▲CCC…5' Sma I 5' …CCC 3' …GGG GGG…3' CCC… 5'
2. 限制酶HindIII的发现
Smith 等于1970年首次从流感嗜血杆菌（H. influenzae）中发现并分离到HindIII限制酶。
3. SV40 限制图谱和转录图谱的绘制
Nathans（1971年）用HindIII绘制SV40的 限制酶谱。
二、限制性内切核酸酶的类型
已经鉴定出的限制性内切核酸酶可分为4种 不同类型： Ⅰ型酶：能识别专一的核苷酸序列，并在 识别位点附近的核苷酸切割DNA双链，但 切割序列是随即的，无专一性。在基因工 程中应用不大。 Ⅱ型酶：能识别专一的核苷酸序列，并在 识别序列的固定位置切割双链DNA分子， 是基因工程中最常用的工具酶。
酶切反应注意事项 价格昂贵 决不能用水稀释,以免变性失活。 预先加入除酶以外的所有其他试剂。 取酶立即放于冰上。分装小份避免反复冻融。 使用无菌的新吸头。 少加水,使体积最小,• 保证酶液体积不超过总 但 体积的10％,否则酶液中的甘油会抑制酶活性。

[医学保健]基因工程的酶学基础

[医学保健]基因工程的酶学基础

碱性磷酸酶:
来自于大肠杆菌(bacterial alkaline phosphatase BAP)或小牛肠(calf intestinal alkaline phosphatase CIP),该酶用于脱去 DNA(RNA)5’末端的磷酸根,使5’-P成为5’-OH,该 过程称核酸分子的脱磷酸作用。当需要5’端同位 素标记或为了避免DNA片段自身连接(或环化)时 可进行脱磷酸反应。
该酶全称为末端脱氧核苷酸转移酶(terminal deoxynucleotidyl transferase),它是从小牛胸腺中 纯化出来的一种小分子量的碱性蛋白质,在二甲胂 酸缓冲液中,能催化5’脱氧核苷三磷酸进行5’－3’ 方向的聚合作用,逐个地将脱氧核苷酸分子加到线 性DNA分子的3’-OH末端。
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上个世纪末,本世纪初，1996年,清华学界 对中医 气本质 ，经络 实质， 阴阳， 五行， 藏象， 中医哲 学观等 都有了 新的全 面整体 创造性 的认识 和解说 。如， 邓宇等 发现的 :气是 流动着 的‘信 息－能 量－物 质’的 混合统 一体； 分形分 维的经 络解剖 结构； 数理阴 阳；中 医分形 集：分 形阴阳 集－阴 阳集的 分形分 维数， 五行分 形集－ 五行集 的分维 数；分 形藏象 五系统 －暨心 系统、 肝系统 、脾系 统、肺 系统、 肾系统 ；中医 三个哲 学观－ 新提出 的第三 哲学观 ：相似 观－分 形论等 。
3’CTTAAG 5’
平末端
两条链上的断裂位置是处在一个 对称结构的中心这样形式的断裂是 形成具有平末端的DNA片断。不易 重新环化。
同裂酶(isoschizomers)
指来源不同但识别相同靶序列的核酸内 切酶。同裂酶进行同样的切割,产生同样的 末端。但有些同裂酶对甲基化位点的敏感性 不同。 Example: 限制酶HpaⅡ和MspⅠ是一对同裂酶 (CCGG) , 当靶序列中一个5-甲基胞嘧啶时HpaⅡ不能进行 切割,而MspⅠ可以。

基因工程 第二章 基因工程的酶学基础

基因工程 第二章 基因工程的酶学基础
Sau3A I
GATC CTAG SauI G TCGAC CAGCTG
BamH I
GGATCC CCTAGG Xho I CTCGAG GAGCT C GTCGAG
?
CAGCTC
利用同尾酶可使切割位点的选择余地更大(相容性末端);

同时，同尾酶产生的DNA片段能通过粘性末端之间的互 补作用而彼此连接起来，这在分子克隆中有一定的作用;
（三）DNA的甲基化程度 原核生物细胞内存在限制-修饰系统，其中MTase 甲基转移酶对DNA起修饰作用，从而使自身DNA不 受体内限制性内切核酸酶的切割 甲基化作用直接影响限制性内切核酸酶的活性 为了克服MTase甲基转移酶的影响，在基因克隆 中使用MTase缺失的菌株来制备质粒DNA。
普遍采用的是Smith和Nathans（1973）提议的 命名系统 由属名的第一个字母（大写）和种名的前两个字 母（小写），组成3个字母的略语组成酶的基本 名称。
例如，大肠杆菌（Escherichia coli）用Eco表示， 流感嗜血菌（Haemophilus influenzae）用Hin表示。
2 3 酶的纯度 DNA样品的纯度 DNA的甲基化程度
5
6 3 7
DNA分子的构型 反应缓冲液 酶的星号活性
4
酶切反应的温度
（一）酶的纯度 高质量的限制性内切核酸酶应是通过全面 提纯的，不存在其他内切核酸酶或外切酶的 污染
在长时间酶解时不出现识别序列特异性的下降 酶解的DNA片段连接后能重新被识别和切割等。
Ry13
EcoR I
属名 种名 株系 编号
• 若种名头2个字母相同则其中一个可用种名的第一和第三个 字母。
Escherichia coli RI — EcoRI Haemophilus influensae d Ⅲ— HindⅢ Streptomyces achromagenes I （Ⅱ) — SacI (II)

基因工程的酶学基础

5′···GTNAC···3′ 3′···CANTG···5′
切割方式
Ⅱ限制性核酸内切酶切割双链DNA，水解磷酸二酯键中3’ 位酯键产生两个末端，末端结构是5’-P和3’-OH，产生3种不同的切口。
粘性末端(cohesive ends):因酶切位点在两条DNA单链上不同（对称）酶切后形成的具有互补碱基的单链末端结构，酶切产生的两个粘性末端很容易通过互补碱基的配对而重新连接起来。
第二章 基因工程的酶学基础
从核酸分子末端逐个降解核苷酸，叫外切核酸酶 从核酸分子内部切割磷酸二酯键使之断裂形成小片段，叫内切核酸酶
按水解断裂核酸分子的方式:
核酸酶：通过切割相邻的两个核苷酸残基之间的磷酸二酯键，从而导致核酸分子多核酸链发生水解断裂的蛋白酶。 特异水解断裂RNA分子，核糖核酸酶（RNase） 特异水解断裂DNA分子，脱氧核糖核酸酶（DNase） 非专一性酶，底物或者为DNA或者为RNA
主要特性
Ⅰ型
Ⅱ型
Ⅲ型
限制修饰 蛋白结构 辅助因子 识别序列 切割位点
双功能（具甲基化） 异源三聚体 ATP Mg2+ SAM 距识别序列1kb处 随机性切割
单一功能 同源二聚体 Mg2+ 4-6bp回文序列 识别序列内或附近特异切割
双功能（具甲基化） 异源二聚体 ATP Mg2+ 距识别序列下游 24-26bp处 随机性切割
01
大肠杆菌（Escherichia coli）用Eco表示； 流感嗜血菌（Haemophilus influenzae）用Hin表示
01
限制性内切酶的命名
如果酶存在于一种特殊的菌株中，则将该菌株名的第一个字母加在基本名称后，若酶的编码基因位于噬菌体（病毒）或质粒上，则用一个大写字母表示此染色体外遗传成分。

第二章基因工程的酶学基础

第二章基因工程的酶学基础内容一、概述二、限制性内切核酸酶三、DNA连接酶四、其他工具酶一、概述工具酶：在生物技术中常用的各种工具酶系指能用于DNA和RNA分子的切割、连接、聚合、反转录等有关的各种酶系统称为工具酶。

工具酶名称主要功能限制性内切核酸酶在DNA分子内部的特异性的restriction endonucleases 碱基序列内部进行切割DNA连接酶将两条以上的线性DNA分子或片段DNA ligase 催化形成磷酸二酯键连接成一个整体DNA聚合酶I通过向3’端逐一增加核苷酸以填补双链DNA分子上的单链DNA polymerase I 裂口，即5’→3’DNA聚合酶活性与3’→5’及5’→3’外切酶活性多核苷酸激酶催化将把一个磷酸分子加到多核苷酸链的DNA polymerase kinease 5’-OH末端上(接下表格)工具酶名称主要功能反转录酶以RNA分子为模板合成互补的cDNA链reverse transcriptaseDNA末端转移酶将同聚物尾巴加到线性双链或单链DNA分子的3’-OH DNA terminal transferase 末端或DNA的3’-末端标记dNTP碱性磷酸酶去除DNA,RNA,dNTP的5’磷酸基团BAP orCIAP核酸外切酶III 降解DNA3’-OH末端的核苷酸残基exonuclease III降解酶S1 降解单链DNA或RNA,产生带5’磷酸的单核苷酸或nuclease S1寡聚核苷酸，同时也可切割双链核酸分子的单链工具酶名称主要功能核酸酶Bal 31 降解双链DNA,RNA的5’及3’末端，nuclease Bal31Taq DNA聚合酶能在高温（72℃）下的单链DNA为模板，Taq DNA polymerase从5’→3’方向合成新生的互补链核糖核酸酶专一性降解RNARNase脱氧核糖核酸酶内切核酸酶，水解单链或双链DNA DNase二、限制性内切核酸酶1、限制性核酸内切酶的分类2、限制性核酸内切酶的命名原则3、限制性核酸内切酶的基本特征4、影响限制性内切酶的活性因素5、限制性核酸内切酶的应用1、限制性核酸内切酶的分类限制性核酸内切酶主要分成三大类：I类：能识别专一的核苷酸顺序，并在识别点附近的一些核苷酸上切割双链，但切割序列没有专一性，是随机的。

第二章兰州大学基因工程基因工程酶学基础

1967年，世界多个实验室发现催化DNA双链上相邻的3`OH和5`-P共价结合形成3`-5`磷酸二酯键的酶
• 二 、特点
• 2 连接条件
• 3 DNA连接酶连接反应条件
• 三、连接反应机理
• 四、连接反应温度
• 五、影响因素
• 六、反应体系
• 七 、连接操作
• 八、体外连接DNA片段的几种方法
Nathan和Dr. Hamilton Smith博士第一次从 大肠杆菌中提取出限制性内切核酸酶 • 已经分离提取出500多种限制性内切核酸酶
Dr. Werner Arber
2性质
内切酶，即在核酸分子内部制造切 口的酶
形成5`-P 和3`-OH末端
3功能
自我保护作用 细菌的限制和修饰系统（R/M体系）
阿尔伯(Arber)、史密斯(Smith)和内森斯 (Nathans)，获1978年诺贝尔生理学和医学奖
• 同裂酶 (isoschizomers)： 来源不同， 识别的是同样的核苷酸靶序列
• 同尾酶(isocaudamer) ：来源不同，识别的靶 序列也各不相同,但都能产生相同的粘性末端
由同尾酶所产生的DNA片段，是能够通过其粘性末端之间的 互补作用而彼此连接起来的，在基因克隆实验中很有用处
• 消化反应温度高于或低于最适反应温度， 都会影响酶的活性
• 每ugDNA 用1-5U酶切1-2h
DNA的分子结构
• 某些核酸内切酶切割超螺旋的质粒DNA或病毒DNA所需的 酶量比消化线性DNA高出20倍
• 一些核酸内切酶，切割处于不同位置的限制位点，其效率有 明显的差异， 可能是由于侧翼序列的核苷酸成分的差异造 成的
• 由一对同尾酶分别产生的粘性末端共价结 合形成的位点，称之为“杂种位点 ”(hybrid site)。但这类杂种位点的结构， 一般不再被原来的任何一种同尾酶所识别
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第二章基因工程的 酶学基础
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第二章 基因工程的酶学基础
第一节 限制性核酸内切酶 第二节 DNA连接酶 第三节 DNA聚合酶和反转录酶 第四节 DNA修饰酶 第五节 外切核酸酶 第六节 单链内切核酸酶 第七节 RNA酶
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本章重点掌握的内容
➢ 限制性核酸内切酶、同裂酶、同尾酶、星星活性。 ➢ II型限制性核酸内切酶命名原则、操作注意事项及产生
一、寄主的限制与修饰现象
修饰的phage λ (B)
EOP=10-4（限制作用）
大肠杆菌B
大肠杆菌K
EOP=10-4（限制作用） 修饰的phage λ (K)
EOP=1Байду номын сангаас修饰作用）
人们发现侵染大肠杆菌的噬菌体都存在着一些功能性障碍。即所谓的 寄主控制的限制与修饰现象简称（R/M体系）。 细菌的R/M体系类似于 免疫系统，能辨别自身的DNA与外来的DNA，并能使后者降解掉。
据限制性核酸内切酶的识别切割特性、催化条件及是否具有修 饰酶活性，可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型。
基因工程中使用
主要特性
Ⅰ型
Ⅱ型
Ⅲ型
限制修饰 蛋白结构 辅助因子 识别序列 切割位点
双功能（具甲基化） 异源三聚体
ATP Mg2+ SAM 距识别序列1kb处
随机性切割
单一功能 同源二聚体
Mg2+ 4-6bp回文序列 识别序列内或附近
一、寄主的限制与修饰现象 寄主控制的限制与修饰的作用 一是保护自身的DNA不受限制； 二是破坏外源DNA使之迅速降解。 基因工程中，应采用缺少限制作用的菌株作为受体。
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第一节 限制性核酸内切酶
二、限制性内切酶的类型
限制性核酸内切酶（限制性酶）：在细胞内能够识别双链DNA 分子中的特定核苷酸序列，并对DNA分子进行切割的一种酶。
产生粘性末端
EcoR V 5’-GATATC-3’ 3’-CTATAG-5’
产生平齐末端
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HindⅢ切割位点
DNA
HindⅢ
AAG CTT TTC GAA
A
B
DNA
C
D
A
AGCTT
TTCGA
A
核酸内切酶HindⅢ对双链DNA分子的切割作用
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第一节 限制性核酸内切酶
3. III类限制性内切酶 在完全肯定的位点切割DNA(识别位点下游24-26bp)，
EOP Efficiency of plate 成斑率
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第一节 限制性核酸内切酶
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第一节 限制性核酸内切酶
一、寄主的限制与修饰现象 限制(restriction)：指一定类型的细菌可以通过限制酶的作 用，破坏入侵的噬菌体DNA，导致噬菌体的寄主幅度受到 限制。 限制作用:实际就是限制性内切酶降解外源DNA，维护宿 主遗传稳定的保护机制。
A’ B’ C’ C B A
A B N B’ A’ A’ B’ N’ B A
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第一节 限制性核酸内切酶
（2）切割位点
识别位点处。 切开双链DNA。形成粘性末端（sticky end）或平齐末 端（blunt end）。如：
EcoR I 5’-GAATTC-3’ 3’-CTTAAG-5’
Pst I 5’-CTGCAG-3’ 3’-GACGTC-5’
但反应需要ATP、 Mg2+和SAM（S-腺苷蛋氨酸）。
EcoP1: AGACC EcoP15: CAGCAG
在基因工程操作中用途不大。
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第一节 限制性核酸内切酶
核酸限制性内切酶的类型及主要特性
主要特性
限制修饰 蛋白结构 辅助因子 识别序列 切割位点
Ⅰ型
多功能（具甲基化） 异源三聚体
ATP Mg2+ SAM 距识别序列1kb处
特异切割
双功能（具甲基化） 异源二聚体 ATP Mg2+
距识别序列下游 24-26bp处 随机性切割
注： SAM为S－腺苷甲硫氨酸
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第一节 限制性核酸内切酶
1. I型限制性内切酶 首先由M. Meselson和R. Yuan在1968年从大肠杆菌 B
株和 K株分离的。 如 EcoB和 EcoK。
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第一节 限制性核酸内切酶
2. II类限制性内切酶 首先由H.O. Smith和K.W. Wilcox在1970年从流感嗜血
菌中分离出来。 分离的第一个酶是Hind Ⅱ
（1）识别位点序列 未甲基化修饰的双链DNA上的特殊靶序列（多数是回
文序列），与DNA的来源无关。
A B C C’ B’ A’ 或
一、寄主的限制与修饰现象 1968 Linn和Arber从E.coli B中发现限制酶Ⅰ 1970 Smith（美）在流感嗜血杆菌发现限制酶Ⅱ 1978 W. Arber，H. O.Smith，Nathans因发现限制性内
切酶及对其功能研究的突出贡献获得诺贝尔生物医学奖
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第一节 限制性核酸内切酶
随机性切割
Ⅱ型
单一功能 同源二聚体
Mg2+ 4-6bp回文序列 识别序列内或附近
特异切割
Ⅲ型
双功能（具甲基化） 异源二聚体 ATP Mg2+
距识别序列下游 24-26bp处 随机性切割
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第一节 限制性核酸内切酶
三、限制性内切酶的命名 1973年H.O Smith和D. Nathans提议的命名系统，命名
星活性的原因、影响酶活性的因素。 ➢ DNA聚合酶的种类及性质 ➢ 其它常用工具酶的功能及其用途。
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第一节 限制性核酸内切酶
任何一种生物体都存在防御外界物质进入的机制 限制/修饰系统
(R-M, Restriction-modification system)
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第一节 限制性核酸内切酶
（1）识别位点序列 未甲基化修饰的特异序列。
EcoB： TGA(N)8TGCT EcoK：AAC(N)6GTGC
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第一节 限制性核酸内切酶
（2）切割位点 在距离特异性识别位点约1000—1500 bp处随机切开
一条单链。
Recognize site
cut
1-1.5kb
（3）作用机理 需ATP、Mg2+和SAM（S-腺苷蛋氨酸）。
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第一节 限制性核酸内切酶
一、寄主的限制与修饰现象 修饰(modification)：指寄主本身的DNA，由于在合成
后通过甲基化酶的作用得以甲基化，使DNA得以修饰，从 而免遭自身限制性酶的破坏。
修饰作用:宿主细胞通过甲基化作用达到识别自身遗传 物质和外来遗传物质的目的。
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第一节 限制性核酸内切酶