甲基化特异性PCR联合结合重亚硫酸盐限制性内切酶法在胃癌抑癌基因甲基化检测中的应用

DNA甲基化检测实验一、重亚硫酸盐的测序法实验流程（BSP）（Bisulfite Genomic Sequence）原理：结合重亚硫酸盐的测序法是一种灵敏的能直接检测分析基因组DNA甲基化模式的方法。

重亚硫酸盐处理后，用针对改变后的DNA序列设计特异性引物并进行聚合酶链式反应（PCR）。

PCR产物中原先非甲基化的胞嘧啶位点被胸腺嘧啶所替代，而甲基化的胞嘧啶位点保持不变。

PCR产物克隆后进行测序。

通过这个方法能得到特定位点在各个基因组DNA 分子中的甲基化状态。

该方法特点是：•特异性高，它能够提供特异性很高的分析结果，这是所有其他研究甲基化的分析方法所不能比拟的；•灵敏度高，可以用于分析少于100个细胞的检测样品。

用微量的基因组DNA进行分析就能得到各个DNA分子精确的甲基化位点分布图。

重亚硫酸盐测序法技术实验流程A．DNA制备用DNA抽提试剂盒（Promega, cat. no. A1125）抽提组织，细胞培养物，石蜡包埋组织切片样品中的基因组DNA。

B．重亚硫酸盐处理C．DNA纯化用Wizard DNA clean-up kit (Promega, cat. no. A7280)纯化重亚硫酸盐处理后的DNA样品。

D．PCR扩增E．PCR产物琼脂糖电泳后回收纯化F．PCR产物连接到pMD19-T (Takara) 载体中克隆及测序。

G．用分析软件对各样本测序结果进行甲基化程度分析二、甲基化特异性的PCR实验流程（methylation-specific PCR, MSP）原理：甲基化特异性的PCR是一种灵敏度高且操作相对简单的甲基化研究方法。

重亚硫酸盐处理DNA后，基因组DNA发生的由甲基化状态决定的序列改变。

随后进行引物特异性的PCR。

该方法引物设计是关键。

MSP中设计两对引物，即一对结合处理后的甲基化DNA链（引物对M），另一对结合处理后的非甲基化DNA链（引物对U）。

检测MSP扩增产物，如果用引物M能扩增出片段，则说明检测位点存在甲基化；若用引物U扩增出片段，则说明被检测的位点不存在甲基化（图3）。

甲基化检测方法（亚硫酸氢盐修饰后测序法）第一部分基因组DNA的提取。

这一步没有悬念，完全可以购买供细胞或组织使用的DNA提取试剂盒，如果实验室条件成熟，自己配试剂提取完全可以。

DNA比较稳定，只要在操作中不要使用暴力，提出的基因组DNA应该是完整的。

此步重点在于DNA的纯度，即减少或避免RNA、蛋白的污染很重要。

因此在提取过程中需使用蛋白酶K及RNA酶以去除两者。

使用两者的细节：1：蛋白酶K可以使用灭菌双蒸水配制成20mg/ml；2：RNA酶必须要配制成不含DNA酶的RNA酶，即在购买市售RNA酶后进行再处理，配制成10mg/ml。

否则可能的后果是不仅没有RNA，连DNA也被消化了。

两者均于-20度保存。

验证提取DNA的纯度的方法有二：1：紫外分光光度计计算OD比值；2：1%-1.5%的琼脂糖凝胶电泳。

我倾向于第二种方法，这种方法完全可以明确所提基因组DNA的纯度，并根据Marker的上样量估计其浓度，以用于下一步的修饰。

第二部分亚硫酸氢钠修饰基因组DNA如不特别指出，所用双蒸水（DDW）均经高压蒸汽灭菌。

1：将约2ugDNA于1.5mlEP管中使用DDW稀释至50ul；2：加5.5ul新鲜配制的3M NaOH；3：42℃水浴30min；水浴期间配制：4：10mM对苯二酚（氢醌），加30ul至上述水浴后混合液中；（溶液变成淡黄色）5：3.6M亚硫酸氢钠（Sigma，S9000），配制方法：1.88g亚硫酸氢钠使用DDW稀释，并以3M NaOH滴定溶液至PH 5.0，最终体积为5ml。

这么大浓度的亚硫酸氢钠很难溶，但加入NaOH后会慢慢溶解，需要有耐心。

PH一定要准确为5.0。

加520ul至上述水浴后溶液中。

6：EP管外裹以铝箔纸，避光，轻柔颠倒混匀溶液。

7：加200 ul 石蜡油，防止水分蒸发，限制氧化。

8：50℃避光水浴16h。

一般此步在4pm开始做，熟练的话不到5pm即可完成，水浴16h正好至次日8am 以后收，时间上很合适。

DNA甲基化研究方法DNA甲基化是一种重要的表观遗传修饰形式，常见于生物体细胞中。

它在维持基因转录调控、胚胎发育、细胞分化以及肿瘤形成等过程中起着关键的作用。

因此，研究DNA甲基化的方法对于深入理解生物学和疾病发生机制具有重要的意义。

在接下来的1200字内，我将为您介绍几种常用的研究DNA甲基化的方法。

1.甲基化特异性限制酶消化（MSRE）：该方法利用能够识别并切割甲基化CpG岛的特异性限制酶来分析DNA甲基化水平。

首先，将DNA进行酶切，然后通过聚合酶链反应（PCR）扩增消化后的DNA片段。

最后，利用各种技术如限制性片段长度多态性（RFLP）分析、单体型检测或测序等方式来检测PCR产物是否被酶切。

甲基化的区域将在PCR产物中产生一个酶切位点的改变，从而可以推断原始DNA的甲基化状态。

2.甲基化特异性PCR（MSP）：MSP是一种常用的研究甲基化的方法，它结合了甲基化特异性限制酶消化和PCR扩增的优点。

首先，在甲基化和非甲基化的DNA样品中进行DNA甲基转化反应，将所有未甲基化的胞嘧啶转化为脱氧尿嘧啶。

接下来，使用特异性引物来扩增甲基化和非甲基化的DNA。

扩增产物可以通过聚丙烯酰胺凝胶电泳等方法来检测甲基化状态。

3.甲基化特异性PCR串联扩增（MSP-COOM）：MSP-COOM是一种修饰的MSP方法，它可以同时分析多个CpG位点的甲基化状态。

在该方法中，将样本DNA修饰成两种不同的状态（一种代表甲基化，一种代表非甲基化），然后再进行PCR反应。

扩增产物可以通过聚丙烯酰胺凝胶电泳等方法来检测多个甲基化位点的状态。

4.甲基化敏感限制性内切酶-PCR（MSRE-PCR）：该方法利用MSRE和PCR的组合，可以对CpG岛中的甲基化位点进行定量分析。

首先，将DNA 进行MSRE消化，保留未甲基化的DNA片段。

然后，在未甲基化DNA片段的末端引入一个特定序列，以便在PCR扩增中使用特异性引物。

扩增产物可以通过定量PCR等方法来分析未甲基化的DNA的含量，并间接推断出原始DNA的甲基化水平。

基因对肿瘤治愈的作用HIC-1在肿瘤发生中的作用机制肿瘤的发生通常伴随着表观遗传学的改变，包括基因甲基化、组蛋白修饰和非编码小RNA干扰等，这些改变可使基因功能发生变化，从而导致细胞恶变。

事实上，异常的表观遗传学修饰是肿瘤形成的必然要素，其已成共识。

越来越多的研究证明，HIC-1基因表观遗传学的改变，参与了多种肿瘤的发生。

启动子的甲基化与肿瘤的发生一般认为，HIC-1是一种肿瘤抑制基因，在多数实体瘤和白血病中表现为表观遗传学沉默，如前列腺癌、非小细胞肺癌、乳腺癌、胃癌和肝癌、食管癌、非精原生殖细胞癌、儿童髓母细胞瘤、神经胶质瘤和室管膜瘤。

应用甲基化特异性PCR（MSP）和重亚硫酸盐测序发现，人类许多实体瘤和白血病中HIC-1均表现出高甲基化。

例如，Yamanaka等在研究前列腺癌的发生与7种基因甲基化的相关性时发现，HIC-1的甲基化率为99%；Eguchi等在非小细胞肺癌标本检测出33%的肿瘤组织和31%非肿瘤组织中有HIC-1启动子的甲基化，且基因的甲基化程度与肿瘤分化程度呈负相关；Fujii等对39例原发性乳腺癌组织研究发现，有26例肿瘤组织（67%）出现HIC-1基因的完全甲基化。

一般认为HIC-1启动子区域的高甲基化可抑制HIC-1表达，且整个HIC-1基因的表达水平随肿瘤的发展不断降低。

HIC-1的表观遗传学失活可能促使细胞在肿瘤形成早期调整生存模式和信号通路，或调整一系列特异性转录因子的表达。

将HIC-1基因人为导入该基因失活的肿瘤细胞株可明显降低肿瘤细胞的成活率。

然而，HIC-1启动子甲基化也被发现存在于儿童正常脑组织、成人脑和前列腺上皮组织中。

此外，在已确诊的急性白血病和慢性粒细胞性白血病慢性期的病人中，仅有少数病人出现HIC-1甲基化。

但在复发的急性淋巴细胞白血病和急转的慢性粒细胞性白血病病人中，HIC-1均表现出高甲基化。

故HIC-1甲基化已被认为是造血系统肿瘤的晚期事件，提示降低HIC-1的表达可能存在其他机制。

提到遗传，我们都已经习惯于这样的概念，即基因组的编码信息存在于ACGT这四种碱基的排列顺序中。

然而，诸如胞嘧啶的甲基化修饰及其分布，组蛋白的乙酰化等，同样影响着表型。

这就构成了表观遗传学(epigenetics)的主要研究容。

其实，早在1942年，C.H.Waddinton就提出了表观遗传学的概念，他指出，表观遗传与遗传相对，主要研究基因型和表型的关系。

而现在，对于表观遗传学，比较统一的认识是，其研究在没有细胞核DNA序列改变的情况时，基因功能的可逆的可遗传的改变。

也就是说，在不改变基因组序列的前提下，通过DNA和组蛋白的修饰等来调控基因表达，其中又以DNA甲基化(DNA methylation)最为常见，成为表观遗传学的重要组成局部。

随着人类基因组方案的开展，科学家们开场在基因组水平来研究表观遗传学，逐步形成表观基因组学(epigenomics)。

表观基因组学就是要在整个基因组水平来研究表观遗传过程以及与这些过程密切相关的特定基因组区域的识别与鉴定。

2000年10月，人类表观基因组协会(Human Epigenome Consortium)由欧盟赞助，启动了旨在于人类6号染色体MHC区域首先做出DNA的甲基化图谱的先导方案(Pilot Project)。

该方案顺利完成，引导启动了2003年的人类表观基因组方案(Human Epigenome Project，HEP)。

2005年，美国国家卫生院(NIH)下属的国立癌症研究所启动了癌症基因组先导方案。

2006年，该所与国立人类基因组研究所一起共同启动癌症基因组方案(Cancer Genome Project)。

表观基因组学和DNA甲基化与癌症的研究成为新的热点。

本文将简要介绍DNA甲基化与CpG岛，癌症与DNA甲基化，和DNA甲基化的重要检测方法。

DNA甲基化与CpG岛：在人类表观遗传学研究中，最常见的就是CpG 二核苷酸中胞嘧啶的甲基化修饰。

其主要过程是，在CpG甲基化结合蛋白(Methyl-CpG Binding Proteins,MBDs) 和DNA甲基化转移酶(DNAmethyltransferases, DNMTs)的作用下，使CpG二核苷酸5’端的胞嘧啶转变成为5’甲基胞嘧啶。

甲基化岗考试题一、判断：1，表观遗传学（epigenetics）是与遗传学相对应的概念。

遗传学是指基于基因序列改变所致基因表达水平变化，最终引起相应表型，如基因突变、基因杂合丢失和微卫星不稳定等：而表观遗传学则是指基于非基因序列改变所致基因表达水平变化，如DNA甲基化和组蛋白的各种修饰。

答：正确。

强调一下表观遗传学，这不仅是当前研究的热点，对于我们理解生命现象也很重要。

2．由于DNA复制时是半保留复制，组蛋白是全保留复制，所以DNA甲基化和组蛋白修饰信息都无法遗传。

答：错误。

前半句“DNA 复制时是半保留复制，组蛋白是全保留复制”是正确的，后面是错误的。

若不能遗传，这套机制对发育调控的作用就很有限了，也不会被称为表观遗传学。

事实上，DNA甲基转移酶中的DNMT1亚类具有持续性DNA 甲基转移酶活性。

这种活性主要就是用于复制时，依照母代DNA甲基化信息为新合成的子代DNA进行选择性甲基化。

对于组蛋白修饰的遗传，据我所知目前了解相对有限，DNA甲基化信息可以为组蛋白修饰提供指导，另外还有其他途经也可以帮助组蛋白修饰信息遗传。

3，哺乳动物DNA甲基化发生在CpG岛的胞嘧啶。

答：正确。

而且很多文献宣称：哺乳动物DNA甲基化“只”发生在CpG岛的胞嘧啶。

这个我不太确定，所以把“只”去掉了。

4．通常，基因启动子区域高甲基化则该基因表达受到激活。

（）答：错误。

通常高甲基化会抑制表达。

5．如果重亚硫酸盐修饰不充分，则部分应该转变为U的非甲基化C没有转变，后续的检测分析有可能把它判断为甲基化的C，这就造成了假阳性。

答：正确。

6．甲基化特异性PCR（MSP）是一种定性的检测手段，可以定量判断目DNA 的片段甲基化程度。

答:错误。

MSP本身就是定性检测手段，它是以最终甲基化引物扩增有没有条带判断有没有甲基化，只能得到“有”或者“无”两种结果。

MSP本身不能定量检测甲基化程度，即便增加重复也没有意义。

7．设计MSP引物时，甲基化引物应该对应至少一个CpG。

DNA甲基化检测实验一、重亚硫酸盐的测序法实验流程（BSP）（Bisulfite Genomic Sequence）原理：结合重亚硫酸盐的测序法是一种灵敏的能直接检测分析基因组DNA甲基化模式的方法。

重亚硫酸盐处理后，用针对改变后的DNA序列设计特异性引物并进行聚合酶链式反应（PCR）。

PCR产物中原先非甲基化的胞嘧啶位点被胸腺嘧啶所替代，而甲基化的胞嘧啶位点保持不变。

PCR产物克隆后进行测序。

通过这个方法能得到特定位点在各个基因组DNA 分子中的甲基化状态。

该方法特点是：•特异性高，它能够提供特异性很高的分析结果，这是所有其他研究甲基化的分析方法所不能比拟的；•灵敏度高，可以用于分析少于100个细胞的检测样品。

用微量的基因组DNA进行分析就能得到各个DNA分子精确的甲基化位点分布图。

重亚硫酸盐测序法技术实验流程A．DNA制备用DNA抽提试剂盒（Promega, cat. no. A1125）抽提组织，细胞培养物，石蜡包埋组织切片样品中的基因组DNA。

B．重亚硫酸盐处理C．DNA纯化用Wizard DNA clean-up kit (Promega, cat. no. A7280)纯化重亚硫酸盐处理后的DNA样品。

D．PCR扩增E．PCR产物琼脂糖电泳后回收纯化F．PCR产物连接到pMD19-T (Takara) 载体中克隆及测序。

G．用分析软件对各样本测序结果进行甲基化程度分析二、甲基化特异性的PCR实验流程（methylation-specific PCR, MSP）原理：甲基化特异性的PCR是一种灵敏度高且操作相对简单的甲基化研究方法。

重亚硫酸盐处理DNA后，基因组DNA发生的由甲基化状态决定的序列改变。

随后进行引物特异性的PCR。

该方法引物设计是关键。

MSP中设计两对引物，即一对结合处理后的甲基化DNA链（引物对M），另一对结合处理后的非甲基化DNA链（引物对U）。

检测MSP扩增产物，如果用引物M能扩增出片段，则说明检测位点存在甲基化；若用引物U扩增出片段，则说明被检测的位点不存在甲基化（图3）。

抑癌基因甲基化与大肠癌陈建芝;张振书【期刊名称】《现代消化及介入诊疗》【年(卷),期】2000(5)3【摘要】大肠癌是常见消化道恶性肿瘤，近年发病率有上升趋势。

迄今，大肠癌的确切发病机制仍不十分清楚，随着分子生物学技术的发展和广泛应用，大肠癌的分子遗传学特征已逐渐被人们所了解。

目前，普遍认为大肠癌发病是一个涉及多基因多步骤的复杂过程，多个癌基因激活和抑癌基因失活的致癌模式逐渐为人们所认识。

在肿瘤的发生发展中一系列肿瘤抑制基因通过突变和染色体缺失而失活，CpG岛甲基化畸变近来被认为是肿瘤中抑癌基因改变的途径之一。

近年来的研究表明，大肠癌相关抑癌基因因CpG岛异常甲基化而失活在肿瘤的发展过程中起重要作用，而且是肿瘤发生的早期事件，其检测有助于肿瘤的早期诊断，评价肿瘤的发展及预后，对指导临床工作有重要意义。

本文就抑癌基因甲基化与大肠癌的关系作一综述。

【总页数】3页(P47-49)【关键词】抑癌基因;大肠癌;发病机制;分子生物学;甲基化;肿瘤分期【作者】陈建芝;张振书【作者单位】第一军医大学南方医院全军消化内科研究所【正文语种】中文【中图分类】R735.34【相关文献】1.甲基化特异性PCR联合结合重亚硫酸盐限制性内切酶法在胃癌抑癌基因甲基化检测中的应用 [J], 胡世莲;程昭栋;孙玉蓓;徐维平;沈干;孔祥勇2.抑癌基因、抑癌基因失活与杂合性丢失及甲基化研究进展 [J], 陈俊霞;崔秀云3.白血病细胞系中抑癌基因PTEN启动子区甲基化状态检测及其去甲基化研究 [J], 李敏;刘航;徐智芳;刘向荣;王洋;饶青;王建祥;王敏4.大肠癌p16抑癌基因甲基化及与Dukes分期的关系 [J], 王志伟;赵任;邹鸿志;王灏;郁宝铭;汤雪明5.抑癌基因TIP30启动子甲基化对大肠癌诊断及预后的影响 [J], 陈贝贝;马一杰;陈小兵;罗素霞;吕慧芳;李宁因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

甲基化特异性PCR：一种检测基因甲基化的简便方法什么是基因甲基化？基因甲基化是一种可以影响基因表达的化学修饰，它是指在DNA分子中，某些胞嘧啶（C）的碳原子上附加了一个甲基（CH3）。

基因甲基化可以改变DNA 的结构和功能，从而调节基因的开关和活性。

基因甲基化在细胞分化、发育、老化、癌症等生物过程中都起着重要的作用。

什么是甲基化特异性PCR？甲基化特异性PCR（Methylation-specific PCR，MSP）是一种简便、特异的、敏感的检测单基因甲基化的方法。

其原理是先用重亚硫酸氢盐（Bisulfite）处理基因组DNA，使所有未发生甲基化的胞嘧啶变成尿嘧啶（U），而甲基化的胞嘧啶不变；然后设计针对甲基化和非甲基化序列的3对特异性引物进行PCR，PCR是一种可以复制DNA的技术；最后通过电泳检测PCR扩增产物，电泳是一种可以分离DNA片段的技术。

通过这个方法，可以判断某个基因是否被甲methyl 化，以及甲methyl 化的程度。

甲基化特异性PCR的步骤甲基化特异性PCR主要包括以下几个步骤：DNA提取DNA提取是指从细胞或组织中分离出DNA分子的过程，通常采用苯酚-氯仿法或盐析法等方法进行。

DNA提取的目的是为了获得足够数量和质量的DNA 样本，以便进行后续的实验操作。

亚硫酸氢盐处理亚硫酸氢盐处理是指用重亚硫酸氢盐溶液对DNA样本进行脱氨基反应的过程，使所有未发生甲methyl 化的胞嘧啶变成尿嘧啶，而甲methyl 化的胞嘧啶不变。

亚硫酸氢盐处理的目的是为了区分不同状态的胞嘧啶，以便进行后续的引物设计和PCR扩增。

引物设计引物设计是指根据待测序列的CpG位点（即胞嘧啶和鸟嘌呤相邻的位置）甲methyl 化与非甲methyl 化时，经亚硫酸氢盐转化后的序列设计3对特异性引物（即野生型引物、甲methyl 化引物和非甲methyl 化引物）的过程。

引物设计的目的是为了让不同状态的DNA只能被相应状态的引物识别和扩增，从而达到检测目标序列是否被甲methyl 化的目的。