多克隆抗体制备

多抗制备的基本流程
多克隆抗体的制备，即多抗制备，是一种获取具有多种抗原决定簇抗体的方法。

基本流程如下：
1. 抗原制备：首先，需要制备具有多种抗原决定簇的抗原。

这些抗原可以是蛋白质、多肽、糖、脂类等生物大分子或小分子。

2. 动物免疫：将制备好的抗原注射到动物体内，激发其免疫系统产生抗体。

常用的免疫动物有兔子、小鼠、大鼠等。

3. 收集血清：在免疫动物后，收集其血清。

血清中含有多种抗体，即多克隆抗体。

4. 抗体的分离和纯化：将收集的血清进行分离和纯化，以获得目标抗体。

常用的方法有离心、层析、电泳等。

5. 鉴定和评价抗体：通过酶联免疫吸附试验、免疫印迹、免疫荧光等方法，对分离出的抗体进行鉴定和评价，确定其特异性和灵敏度。

6. 抗体应用：经过鉴定和评价后的多克隆抗体可应用于生物医学研究、诊断、治疗等领域。

需要注意的是，多克隆抗体的制备过程较为复杂，涉及多个环节，如抗原制备、动物免疫、血清收集等。

在实际操作中，需严格控制实验条件，以确保制备出的多克隆抗体具有较高的质量和应用价值。

多克隆抗体制备多抗一般制备流程：完全抗原的准备→兔子的免疫→效价检测和终放→抗体亲和纯化→抗体的浓缩和保存。

【晶莱生物】具体实验步骤如下：1.兔子的准备挑选健康的6周大小的新西兰大白兔两只（约2Kg），使其适应新的生活环境，至少稳定几天再进行首次取血.预采血（作阴性参照用）1.1 将兔子小心的放入固定的架中,使兔子平静；1.2小心剃去兔耳上的毛以使血管清晰可见(也可不剃)；1.3如果有必要,可用小棉球沾酒精涂抹血管部位,使血管膨胀；1.4用注射器从耳静脉抽取约10ml血液(约5ml血清)；1.5小心抽出针头,适当按压伤口以免流血,然后用酒精棉球消毒伤口；1.6将收集的血液置于37`C灭活30min,最后置于4`C过夜使其凝结释放血清；1.7将凝结好的血液在10000r／min离心10min； h.收集上清，即为血清。

2. 兔子的免疫2.1注射两只兔子的抗原为1ml,抗原缓冲溶液必须不含对兔子有害的化学试剂.每只兔子初次免疫400ug抗原比较适合,也可适当减少以获得更好的结果，后续免疫每次为100ug即可。

2.2 将1ml的佛氏完全佐剂与准备好的1ml抗原充分混匀,呈乳白色；2.3 小心从笼中取出兔子，每只兔子免疫4个部位(背部和大腿根部均可),每个部位250ul,针头呈45度角插入皮下1-2cm,注射完后停留数秒以防止抗原外流。

2.4 免疫周期为20天,免疫完后7-10天取血(包括中途测试取血和最终放血),总共免疫4-5次。

3.效价检测3.1 2个参照:阴性参照为预取血血清，均以1抗起始浓度稀释(封闭稀释液);阳性参照为以前阳性血清3.2 于96孔板中每孔滴加100ul，1ug/ml抗原，于4℃过夜，也可以37℃孵育2小时。

3.3倒掉抗原溶液，每孔加入200ul的封闭液，4℃过夜或者37℃孵育2小时。

3.4倒去封闭液，在吸水纸上拍打尽量吸干残留液体,用洗涤液洗板三次,每次尽量拍干残留液体,若要放置一段时间, 37℃烘干并用封口袋封好于-20℃存放。

多克隆抗体的原理及制作方法一、原理多克隆抗体是由针对多种不同抗原表位的抗体组成的混合物。

外源性抗原初次进入动物体内后，可引发机体初次免疫应答，即在抗原呈递细胞（antigenpresenting cell，APC）和T细胞的作用下，未成熟B细胞被激活分化为产生抗体的浆细胞，对于大多数可溶性蛋白抗原而言，动物注射后5～7天，血清中开始出现抗体，并在12天左右达到顶峰，然后逐渐下降。

初次免疫应答产生的抗体持续时间较短，亲和力也较低。

但是受抗原刺激的B细胞除了分化为抗体产生细胞外，还增殖形成大量记忆性B细胞，它们在实施加强免疫时被快速激活，加强免疫后抗体滴度迅速上升，并持续更长时间，抗体合成率也比初次反应增加几倍到几十倍，加强免疫后7～14天出现抗体的峰值。

由于记忆B细胞的存在，需要更少的抗原刺激即可引起再次免疫应答。

记忆B细胞是长寿细胞，因此，特异性抗体应答在最后一次加强免疫之后6个月到一年都会存在。

本节介绍用佐剂乳化的抗原免疫动物获得多克隆抗血清的方法。

该法可用于免疫家兔，小鼠、大鼠或地鼠，也可用于更大的动物如绵羊、山羊或马。

二、材料（一）动物选择根据需要可选择适当品系的家兔，小鼠，大鼠或地鼠等动物进行免疫获得抗体。

动物的选择取决于所需的抗血清量以及特异性抗原的物种来源和免疫动物物种之间进化上的差异。

家兔常被选作免疫动物，因为兔与人、兔与小鼠之间的遗传学差异大，而人和小鼠来源的蛋白是最经常被研究的对象。

每次获取25ml血清的采血量，对兔本身没有明显的损伤。

（二）抗原制备优质抗血清很大程度上取决于抗原的质量、纯度和数量。

常用纯化的抗原或部分纯化的抗原免疫动物，所用抗原往往是蛋白质或肽。

一般而言，细菌或病毒蛋白如血凝素或细菌包膜蛋白有很强的免疫原性，而哺乳动物蛋白如多肽类激素或细胞膜受体则免疫原性较弱。

有时也会用到与适当的蛋白质载体、细胞或细胞与组织提取物相交联的半抗原（多糖、核酸、脂类和小分子化学物质等）以增强半抗原的免疫原性，通过化学方法将半抗原连接到已知的免疫原性强的载体蛋白上，常用的载体蛋白有匙孔戚血蓝素（KLH）、牛血清白蛋白（BSA）、鸡卵清蛋白（OVA）等。

兔多克隆抗体的制备流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。

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1. 免疫原制备。

选择具有免疫原性的抗原，如蛋白质、多肽或多糖等。

多克隆抗体制备提高效价流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。

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多克隆抗体名词解释多克隆抗体是指由多个B细胞克隆所产生的抗体，能够针对同一种抗原的多个不同的位点进行识别和结合。

与单克隆抗体相比，多克隆抗体具有更高的亲和力和更广泛的抗原识别能力。

多克隆抗体因其独特的特性被广泛应用于生物医学研究、临床诊断和生物工程等领域。

多克隆抗体的制备过程通常包括以下几个步骤：首先，通过免疫动物（如小鼠、兔子等）免疫目标抗原，以激发其免疫系统产生抗体。

接着，从免疫动物体内采集血清，其中包含了众多的B细胞克隆所产生的不同抗体。

再经过一系列的加工和处理，如离心、加热灭活等，最终得到多克隆抗体产品。

多克隆抗体具有以下几个优点：首先，多克隆抗体能够识别和结合抗原的不同位点，从而提高抗原的检测敏感性和特异性。

其次，多克隆抗体可用于大规模和复杂多样的抗原检测，覆盖范围广，适用性强。

此外，多克隆抗体的制备工艺相对简单，成本较低。

然而，多克隆抗体也存在一些局限性。

首先，多克隆抗体的制备过程中可能会产生一些非特异性的抗体，从而降低了其特异性和纯度。

其次，多克隆抗体在不同免疫动物体内可能会产生批次差异，导致其品质和稳定性存在一定的波动。

此外，多克隆抗体由于来源于免疫动物，可能存在个体差异和免疫相容性问题。

为了克服多克隆抗体的局限性，科学家们也不断努力进行研究和改进。

例如，通过筛选和优化制备过程，可以提高多克隆抗体的特异性和纯度。

此外，还可以利用单克隆抗体技术将多克隆抗体中特异性较高的成分筛选出来，以获得更具特异性和统一性的抗体产品。

综上所述，多克隆抗体是一种能够针对同一种抗原的多个不同位点进行识别和结合的抗体。

多克隆抗体具有广泛的应用价值，但也存在一些局限性。

通过不断的研究和改进，科学家们正在努力提高多克隆抗体的质量和稳定性。

多克隆抗体的制备1.蛋白纯化：重组蛋白表达形式为包涵体时，可通过切胶进行蛋白纯化。

表达重组蛋白的细菌（200ml菌液为例）4500r/min离心20min，菌体沉淀用15ml PBS 悬起，4500r/min离心15min，共清洗3次。

沉淀用4ml PBS悬起，通过超声处理进行裂解。

超声条件为超声时间3s，间隔3s，全程时间为30min，4℃（置于冰水混合物中），功率为400W。

超声后10000r/min离心5min，沉淀用500µl PBS悬起，后加入400µl 2×SDS凝胶加样缓冲液、100µl DTT混合，立即加入沸水中煮10min。

将500µl 处理后样品进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（每块凝胶加入500µl 样品）。

凝胶用H2O、PBS清洗后，将凝胶放入预冷的0.25M KCl中显色（或低温显色）30s左右，可见不同位置出现白色的蛋白条带。

将目的蛋白位置的凝胶条切下（尽量避免同时切下其他蛋白条带），PBS（预冷）清洗后，将胶条碾碎放入EP管中（大约占1/2），加入PBS 浸没胶粒（PBS加入量控制在可使胶粒完全溶于其中，上下颠倒可缓慢流动）。

反复冻融3次，10000r/min离心3min，吸取的上清即为纯化后蛋白（可多次离心后小心吸取上清，避免吸到胶粒）。

取纯化后蛋白进行SDS-PAGE电泳，鉴定蛋白的纯化度并测定其浓度。

纯化蛋白置于4℃短暂保存。

2.蛋白复性将纯化蛋白置于已处理的透析袋中（透析袋于2% NaHCO3中煮沸10min，H2O冲洗后于1mM EDTA中煮沸10min，可于4℃1mM EDTA保存），放入复性液（配方：20mM Tris-HCl pH 8.0；0.1mM氧化型谷胱甘肽；0.9mM还原型谷胱甘肽）中，4℃作用1h。

更换复性液，4℃作用2h。

再放入TE缓冲液（配方：10mM Tris-HCl；1mM EDTA pH8.0）中，4℃作用2h或过夜。

多克隆抗体的应用及现状多克隆抗体是由多个B细胞克隆产生的抗体群体，与单克隆抗体相比具有更强的多样性和高度的特异性。

多克隆抗体广泛应用于生物医学研究、临床诊断和治疗等领域，成为重要的实验和临床工具。

本文将从多克隆抗体的制备、应用以及现状三个方面进行详细介绍。

首先，多克隆抗体的制备是实现其应用的基础。

多克隆抗体的制备一般包括以下几个步骤：首先，将目标抗原免疫动物（如兔、小鼠等）多次注射，刺激其产生特异性抗体。

然后，从动物体内收集血清，分离抗体。

接着，将抗体与大量不同的抗原冲突，筛选出特异性较高的抗体克隆。

最后，对特异性较高的抗体进行扩增和提纯，得到多克隆抗体。

多克隆抗体的应用广泛涉及多个领域。

在生物医学研究中，多克隆抗体常用于蛋白质表达与定位、蛋白质相互作用和信号转导的研究。

例如，通过使用多克隆抗体可以检测特定蛋白在细胞内的定位和表达水平，进一步了解其功能及参与的生物过程。

此外，多克隆抗体还可以用于免疫组织化学、免疫印迹和流式细胞术等实验技术，以便更全面地研究生物学问题。

在临床诊断中，多克隆抗体也有重要应用。

多克隆抗体可以用于特定抗原的定量测定，如肿瘤标志物的测定、感染病原体的检测等。

同时，多克隆抗体也可以用于免疫组织化学检测，辅助病理诊断。

另外，多克隆抗体还广泛应用于临床病原体的荧光染色和免疫组化检测，用于快速定位和识别病原体，提高诊断效率。

在治疗领域，多克隆抗体已经取得了巨大的成功。

多克隆抗体可以用于治疗多种疾病，如癌症、自身免疫疾病等。

通过靶向特定抗原，多克隆抗体可以选择性地破坏癌细胞，抑制肿瘤生长和转移。

此外，多克隆抗体还可以通过激活免疫系统来增强机体对疾病的免疫反应。

近年来，许多多克隆抗体药物已经获得上市和临床使用，成为治疗疾病的重要手段。

然而，多克隆抗体也存在一些局限性和挑战。

首先，多克隆抗体制备过程中存在批次差异，导致抗体的特异性和亲和力有一定的波动性。

此外，多克隆抗体的批量生产和提纯成本较高，难以大规模应用。

泰实验九 多克隆抗体的制备，纯化及免疫电泳【实验目的】⒈ 加深对抗体基本知识的了解。

⒉ 了解多克隆抗体的制备及纯化的基本方法。

⒊ 了解免疫电泳的基本过程和实验依据。

一、多克隆抗体的制备【实验原理】当将抗原注射入实验动物体内时，一系列抗体生成细胞会不同程度的与抗原结合，受抗原刺激后在血液中产生不同类型的抗体，这种由一种抗原刺激产生的抗体称为多克隆抗体。

多克隆抗体中不同的抗体分子可以以不同的亲和能力与抗原分子表面不同的部分—抗原决定簇相结合。

将抗原导入敏感动物体内后，可刺激网状内皮细胞系统，尤其是淋巴结和脾脏中的淋巴细胞大量增殖。

如图所示，实验动物对初次免疫和二次免疫的应答有明显的不同。

通常初次免疫应答往往比较弱，尤其是针对于易代谢，可溶性的抗原。

首次注射后大约7天，在血清中可以观察到抗体但抗体的浓度维持在一个较低的水平，在大约10天左右抗体的滴度会达到最大值。

但同种抗原注射而产生的二次免疫应答的结果明显不同，和初次免疫应答相比抗体的合成速度明显增加并且保留时间也长。

免疫应答的动力学结果取决于抗原和免疫动物的种类，但初次和二次免疫应答之间的关系是免疫应答的一个重要特点。

三次或以后的抗原注射所产生的应答和二次应答结果相似：抗体的滴度明显增加并且血清中抗体的种类和性质发生了改变，这种改变被称为免疫应答的成熟，具有重要的实际意义。

通常在抗原注射4-6周后会产生具有高亲和力的抗体。

【实验材料】⒈ 实验动物初次抗原注射后的周次0 1 2 3 4 5 6 7初次免疫 二次免疫血清中抗体的水平成年兔。

⒉实验器材特制兔盒；刀片；25G针头；1ml注射器；20 ml 血液收集管；药铲；离心机以及塑料离心管；加样器及加样管；烧杯。

⒊实验试剂⑴抗原；乙醇；20mM 磷酸缓冲溶液pH7.2。

⑵福氏完全佐剂和福氏不完全佐剂：【实验方法】⒈抗原的制备抗原制备的主要目的在于在免疫动物体内产生最强、最适当的抗体。

由于纯化的抗原适合产生抗体，因此在注射前通常采用一些经典的方法，比如柱层析、分级萃取、亚细胞分离等进行抗原的分离和纯化。

多克隆抗体制备练习题一、选择题A. 盐析法B. 硫酸铵盐析法C. 酶解法D. 凝胶过滤法A. 腹腔注射B. 静脉注射C. 肌肉注射D. 皮内注射A. 小鼠脾细胞B. 小鼠骨髓瘤细胞C. 人外周血淋巴细胞D. 大鼠腹水细胞4. 下列关于佐剂的说法，错误的是？A. 佐剂可以增强免疫原性B. 佐剂可以减少免疫次数C. 佐剂可以提高抗体产量D. 佐剂可以改变抗体类型A. 免疫动物B. 细胞融合C. 亲和层析D. 抗体纯化二、填空题1. 在多克隆抗体制备过程中，常用的免疫原为______、______和______等。

2. 抗体纯化方法包括______、______、______等。

3. 在细胞融合过程中，常用的融合剂为______和______。

4. 抗体效价的测定方法有______、______和______等。

5. 多克隆抗体的优点包括______、______和______等。

三、判断题1. 多克隆抗体只能识别一种抗原表位。

（）2. 免疫动物时，抗原剂量越大，抗体产量越高。

（）3. 细胞融合后，可以通过选择性培养基筛选出杂交瘤细胞。

（）4. 抗体纯化过程中，亲和层析法可以获得高纯度的抗体。

（）5. 多克隆抗体在临床诊断中的应用比单克隆抗体更为广泛。

（）四、简答题1. 简述多克隆抗体制备的基本流程。

2. 试述杂交瘤技术的原理。

3. 请列举三种常用的抗体纯化方法，并简要说明其原理。

4. 影响多克隆抗体效价的因素有哪些？5. 如何对多克隆抗体进行保存？五、案例分析题1. 病毒名称：HIV12. 免疫动物：新西兰大白兔3. 需要获得的抗体类型：IgG4. 抗体应用：ELISA检测六、计算题1. 若一只新西兰大白兔每次免疫需要100μg的抗原，共免疫4次，每次间隔两周。

已知抗原蛋白的纯度为80%，计算总共需要的抗原蛋白质量。

2. 在一次抗体纯化过程中，通过亲和层析柱得到了5mL的抗体洗脱液，测得其蛋白浓度为10mg/mL。

多克隆抗体(polyclonal antibody)制备1. 免疫动物：两只新西兰兔2. 佐剂：首先用完全弗氏佐剂（CFA），后用不完全弗氏佐剂（IFA）。

3. 免疫原：蛋白或KLH偶联的多肽。

每次免疫100-200μg免疫原。

4. 免疫：用生理盐水稀释免疫原，然后与相应的佐剂进行1:1混合。

抗原和佐剂完全混合形成稳定的乳剂，将该乳剂在兔子双肩周围的皮肤下进行皮下注射和后大腿进行肌肉注射。

每个区域大约用1/4的免疫原。

这样免疫原可以持久存在从而提高免疫应答。

5. 取血：用19号针头对兔子进行耳动脉取血，室温过夜析出血清。

6. 第0星期采血2ml（获得0.5-1ml免疫前血清）完全弗氏佐剂（CFA）混合的200μg抗原免疫兔。

第2星期完全弗氏佐剂（CFA）混合的200μg抗原免疫兔。

第4星期不完全弗氏佐剂（IFA）混合的100μg抗原免疫兔。

第5星期取检测血清20-30ml取适当的细胞或组织进行ELISA和WB检测，溶解在生理盐水中的100μg抗原免疫兔。

第6星期如果检测阳性第一次采血20-30ml,溶解在生理盐水中的100μg抗原免疫兔；如果上次检测是阴性，取适当的细胞或组织进行ELISA和WB检测。

第7星期第二次采血20-30ml,溶解在生理盐水中的100μg抗原免疫兔；如果检测仍为阴性，需要讨论这个项目是否继续。

第8星期第三次采血20-30ml,溶解在生理盐水中的100μg抗原免疫兔。

第9星期末次放血20-30ml,纯化混合血样，平均每次纯化可以获得100-150mg抗体，最后进行ELISA和WB等质量检测。

7. 注意：在整个项目中，兔子需要保持9周的免疫和放血。

检测的结果将决定这个项目的继续、修改或终止【注意事项】大家在用药的时候，药物说明书里面有三种标识，一般要注意一下：1.第一种就是禁用，就是绝对禁止使用。

2.第二种就是慎用，就是药物可以使用，但是要密切关注患者口服药以后的情况，一旦有不良反应发生，需要马上停止使用。