蛋白质的折叠复性
苏志国
中国科学院过程工程研究所 生化工程国家重点实验室
中国科学院过程工程研究所 Institute of Process Engineering, Chinese Academy of Sciences 原名：中国科学院化工冶金研究所，建立于1958年， 2001年更名
3个重点实验室（2个国家重点，1个中科院重点），1个国家工程中心 职工280人，学生360人；主要方向：生化工程，清洁化工，多相反应
生化工程国家重点实验室(1992) 国家生化工程技术研究中心（1996）
Initial investment 4 millions USD 12 professors，16 associate professors，120 students
生化工程
（生物化学工程，Biochemical Engineering）
生物技术
化学工程
生物技术产业化：突破瓶颈 化工可持续发展：建立新过程
研究领域
1980s 1990s 2000s-
医药生物技术
农业生物技术
生化工程 生化反应过程
工业生物技术
生物医药 生物能源 生物材料 生物化学品 其它产品
原料、辅料 ＋ 生物催化剂
生化分离过程 生化装备与介质 流程设计与优化
过程的基本规律和集成优化
美国生物技术产品销售额趋势
400 350 334 300 250 200 150 100 50 0 10 59 101 182 147 215 362
亿 美 元
平均增长率:20%，融资增长率：20% 就业增长率：12.5%，股市平均涨幅:8.76%
19 80 19 91 19 96 19 98 20 01 20 03 20 06 20 08
美国各类生物技术产品销售额
(2000年158.5亿美元)
16%
人治疗药
5% 3% 2%
诊断试剂 农 业
特殊化合物
74%
非医学诊断剂
资料来源：Consulting Resources Corp
100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0
核酸药物 细胞因子 基因治疗 抗体 溶栓药物 疫苗 激素
已上市 临床中
目前生物技术的最大成功 – 蛋白质药物
用微生物、动物细胞生产人体药用蛋白质或疫苗
载体 DNA
人体 某种蛋白质 基因 转化
重组体
发 酵 罐 或 细 胞 培 养 罐
气体
克隆微生物、动物细胞
某单克隆抗体的生产线—分离纯化流程复杂
生物分离工段
分离纯化 占总成本 60-90%
分离纯化
举例：剪切失活 － 泵送造成蛋白质絮凝体
450 400 350 300 250 200 150 100 50 0
0 20 10 30
Filtrate volume (ml)
1 mg/ml 500ml/min
No pumping 5 min pumping 10 min pumping
Membrane filtration
0.2 µ
Filtration time (min)
干 扰 素（Interferon）
IFN-α(IFN-β,γ, ω) 白细胞产生 165－166 氨基酸 4个半胱氨酸，两对二硫键 Cys1-Cys99；Cys29-Cys139 市场上销售前10名的生物药
Size and shape of soluble proteins
D.S. Goodsell and A.J. Olson, TIBS 18:3 (1993) 65-68
蛋白质药物生产的基本流程
基因工程细胞
生 物 反 应 器 离心机
膜分离器
（分离细胞和培养基） 胞内产品 细胞破碎机
碎片分离
蛋白质复性
胞外产品
成 品
膜分离器 (I) 层析法 (I) 层析法 (II) 膜分离器 (II) 冷冻干燥或 分装
蛋白质回收率变化范围
100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0
低值 高值
回收率
复性
盐析
膜分离
层析
scFv57P包涵体
蛋白质的重折叠（复性）
（大肠杆菌表达产物）
显微镜下含scFv57P包涵体的 E. Coli 示意图
包涵体
伸展肽链
活性蛋白质
加变性剂 溶解
远离变性剂后 自动折叠
最常用的折叠方法 – 溶液稀释
变性蛋白质
稀释
复性溶液 例：磷酸盐 缓冲液
稀释率1:10-200
不同稀释倍数和时间对复性的影响
14000
Specific activity (U/mg)
12000 10000 8000 6000 4000 2000 0 0 100 200 300 400
200 100 10
Time (min)
原料：6mg/mL溶菌酶（8mol/L脲） 复性溶液0.1mol/L Tris-HCl at pH8.8, 1mol/L Urea, 3mmol/L GSH and 0.3mmol/L GSSG.
不同终点浓度对蛋白质复性的影响
200 180
Specific activity (U/mg)
160 140 120 100 80 60 40 20 0 0 20 40 60 80 100
40 ug/mL 60 ug/mL 80 ug/mL 100 ug/mL
Refolding time (h)
原料：4 mg/L SOD,50mmol/L PBS缓冲液，10mol/L脲 复性溶液：50 mmol/L PBS at pH7.4, 2 mol/L Urea and 0.1 mol/L NaCl
