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贴壁细胞稳转细胞株构建方案细胞株的构建是生命科学研究中的重要环节之一。
对于疾病的研究、药物筛选、基因功能研究等方面，都需要构建稳定的细胞株。
贴壁细胞是一类广泛应用的细胞类型，其构建稳定细胞株的技术也受到了广泛关注。
本文将介绍一种贴壁细胞稳转细胞株构建方案。
一、细胞的来源和处理本方案首先需要确定所需的细胞类型。
对于不同的研究目的，所需的细胞类型也不同。
在选择细胞时，需要考虑细胞的生长特性、转染效率、稳定性等因素。
本方案中采用了人类胚肺细胞株293T作为细胞来源。
细胞的处理包括细胞的培养、传代和冻存等过程。
在培养细胞时，需要注意细胞的生长环境，包括培养基的配方、CO2浓度、温度等因素。
传代时需要注意细胞的状态，避免过度生长或细胞死亡。
在冻存细胞时，需要使用保护剂来保护细胞的完整性和活性。
二、转染载体的构建在构建贴壁细胞稳转细胞株时，需要使用转染载体来将目的基因导入细胞中。
转染载体的构建需要考虑多个因素，包括载体的大小、选择的启动子、标记基因等。
本方案中使用了pLVX-IRES-ZsGreen1载体，该载体可以使转染的细胞表达绿色荧光蛋白，便于筛选和鉴定。
三、转染转染是将转染载体导入细胞的过程。
在转染中需要选择合适的转染试剂和转染方法，以提高转染效率。
本方案中使用了聚乙烯酰胺（PEI）试剂进行转染，该试剂具有高效、低毒性等特点。
转染的过程中需要注意多个因素，包括转染剂和载体的浓度、转染时间、细胞的状态等。
在转染后，需要对细胞进行筛选和鉴定，以筛选出表达目的基因的细胞。
四、筛选和鉴定在转染后，需要筛选和鉴定表达目的基因的细胞。
本方案中使用了荧光筛选法，即筛选表达绿色荧光蛋白的细胞。
同时，还需进行PCR、Western blot等方法进行鉴定，以确认目的基因的表达并确定细胞株的稳定性。
五、细胞株的构建在确定表达目的基因的细胞后，需要进行细胞株的构建。
细胞株的构建包括细胞的传代、冻存和鉴定等过程。
在传代时需要注意细胞的状态，防止细胞的过度生长或死亡。
行业近况我们坚定看好未来 3-5 年中国消费电器、消费电子产品品牌成建制出海的重大趋势。
RCEP 协议顺利签订，营造良好全球环境，我们特别召开行业电话会议，以下为重点纪要。
评论中国品牌成建制出海：1）中国品牌全球扩张势头类似日本 1980-1990 年代，韩国 2000S 年代。
预计 3-5 年中国消费电器、消费电子品牌（包括自有品牌、并购的外资品牌）有望在全球成为主流。
2）当前海外品牌业务突飞猛进的消费电器公司如石头科技、JS 环球生活 H、TCL 电子 H、美的集团；消费电子公司如小米集团、安克创新、传音控股等。
3）全球规模最大的自贸协定区 RCEP 签署意味着中国品牌未来依然会有一个稳定的外部扩张环境。
3）近期家电出口持续保持强劲趋势。
市场担忧随着全球疫苗研发的突破，增长趋势会减弱。
我们认为中国家电出口要区分代工出口与品牌出海两个概念。
代工增长势头有减弱的可能，但是品牌增长势头是一个中长期的趋势。
数字化改造是中国品牌全球化竞争力的根源：1）中国企业在数字经济升级趋势下，全球竞争优势不再局限于成本优势，已经转换为全面的产业链优势、产品优势、零售效率优势。
具体可参考中金公司深度报告《数字赋能经济：产业数字化未来已来》2）中国正在享受工程师红利，产品创新引领市场，在新兴品类的产品创新优势尤为明显。
技术、产品迭代提升中国品牌定位，与国外品牌产品价差持续缩窄。
例如，中国的扫地机器人智能化性能领先，在欧美的市场份额和品牌定位快速提升。
渠道创新降低中国品牌出海门槛：1）专业的外贸公司如慕晨、专业跨境电商如速卖通、专业品牌出海服务商如俄速通，降低了中国品牌出海的难度。
以俄速通为例，为中国品牌提供多模块、一站式出海服务，打通海外销售的各个环节，帮助品牌企业建立自身的海外销售渠道。
2）国外市场电商占比提升，正在冲击传统的线下品牌格局。
疫情期间，欧美的线上销售占比大幅提升，进一步加剧了市场格局的改变。
在过去，中国品牌在欧美往往需要熟悉线下渠道。
修饰引物十问十答1.常见的引物修饰的有哪些?常见的引物修饰包括有磷酸化（Phosphorylation）、生物素（Biotin）、地高新（Digoxigenin）、内部氨基修饰、5'氨基修饰、3'氨基修饰、巯基（Thiol）、间臂（Spacer）、硫代（Phosphorthioate）、脱氧脲嘧啶（DeoxyUridine，dU）和脱氧次黄嘌呤（deoxyInosine，dI）等。
2.为什么修饰引物的产量要比一般引物低，价格要高?由于修饰单体稳定性较差，偶联时间长，效率低，最后得到的产量自然低于一般的引物。
并且，修饰引物通常需要PAGE或HPLC纯化，纯化过程损失较大。
修饰引物使用的原料是一般引物原料的几百倍，所以产品的价格自然高。
3. 合成的荧光标记探针应如何保存?1）荧光探针必须避光保存。
2）干品可于-80℃保存一年以上，无条件时可于-20℃保存。
3）强烈建议用RNase-free的TE (pH 8.0) buffer溶解探针，这样得到的探针溶液更稳定，保存时间更长。
4）可将探针配制成100 pmol/μl的储备液，分装成几份于-20 ℃保存。
使用前，将配制好的储备液稀释成工作液 (10 pmol/μl或20 pmol/μl)，剩余部分于-20 ℃保存，防止反复冻融。
4. 修饰标记对OD值的测量有影响吗?有些荧光基团在260 nm处也有吸收光，例如 FAM, HEX, TAMRA, TET。
其它在260 nm 处可能也有吸收值，但是数据没有公布，因此计算时不包括在里面。
5. 磷酸化是怎么回事？5'磷酸化作用是通过B-氰乙基化学反应添加到引物5'端的糖环上，而不是最后一个碱基上；3'磷酸盐被连接到固体支持介质上，所以在合成的第一个循环，碱基就与它偶联。
3'磷酸化修饰具有阻止聚合酶延伸的功能。
6. Phospothioate(S-oligos)硫代引物和普通的引物有什么区别?S-oligos是寡核苷酸中的单核苷酸之间的磷酸二酯键中的一个氧被硫代替后形成的。
稳转表达细胞株一、啥是稳转表达细胞株呀稳转表达细胞株呢，简单来说，就是通过一些基因工程的手段，把我们想要研究的特定基因，稳定地整合到细胞的基因组里面，让这个细胞能够持续地表达这个基因所编码的蛋白质。
就好像给细胞装了一个“小工厂”，这个“小工厂”可以源源不断地生产出我们需要的蛋白质产品哦。
这种细胞株在很多领域都超级有用的。
比如说在医学研究方面，我们可以用它来研究某些疾病的发病机制。
如果我们怀疑某个基因和某种疾病有关，那就可以把这个基因导入到稳转表达细胞株里面，看看细胞会有啥变化，是不是会出现和疾病相关的一些特征。
再比如说在药物研发领域，稳转表达细胞株也能派上大用场。
我们可以用它来筛选药物，看看哪些药物能够影响这个基因的表达或者这个蛋白质的功能，从而找到治疗疾病的有效药物。
二、稳转表达细胞株的构建方法构建稳转表达细胞株可不是一件简单的事儿哦，需要经过好几个步骤呢。
第一步，就是要选择合适的细胞系。
这就好比盖房子要选好地基一样重要。
不同的细胞系有不同的特点，有的细胞容易培养，有的细胞对某些基因的表达比较敏感。
所以我们得根据自己的研究目的和需求，挑选最适合的细胞系。
比如说，如果我们要研究人类的疾病，那一般就会选择人类的细胞系。
第二步，就是要把我们想要表达的基因克隆到合适的载体上。
这个载体就像是一辆“货车”，它可以把基因运送到细胞里面去。
载体有很多种，常见的有质粒载体、病毒载体等等。
我们要根据基因的大小、细胞的类型等因素来选择合适的载体。
然后通过一些分子生物学的技术，比如酶切、连接等，把基因和载体连接在一起，形成一个重组载体。
第三步，就是把重组载体导入到细胞里面去。
这就好比把“货车”开到“目的地”。
导入的方法也有很多种，常见的有转染、感染等。
转染就是通过一些化学试剂或者物理方法，让细胞把重组载体“吞”进去；感染则是利用病毒的特性，让病毒把重组载体带到细胞里面去。
第四步，就是筛选出成功整合了基因的细胞。
因为不是所有的细胞都能成功地把基因整合到自己的基因组里面的，所以我们得想办法把那些成功的细胞挑出来。
文库测序十问十答从核酸提取、文库构建，到上机测序、数据分析，越来越多的实验室选择将这些决定实验命运的关键步骤掌控在自己手中。
下面就由小编带大家看一看自建库和测序过程中有哪些需要特别注意的环节，干货满满，不要错过哦~问：常规Illumina NGS文库长什么样图1 单端index文库测序模式图图2 双端index文库测序模式图（NovaSeq 6000平台）图3 双端index文库测序模式图（HiSeq X平台）答：如图，文库结构可分为以下几个部分：插入片段，P5、P7接头，测序引物结合位点及index。
中P5、P7接头位于文库两端，可以与flowcell上的寡核苷酸结合，在簇生成和测序过程中可作为引物或起到固定模板链的作用。
Index是不同样本的区分依据，当同一条lane中混入多个样本测序时，即可根据index区分来自不同样本的reads。
根据建库时使用接头结构不同，又分为单index文库和双index文库。
随着测序通量的不断增加，每条lane可以容纳的样本量也越来越多，双index可以变化出更多种组合，且能够降低标签串扰的比例，因此一些对灵敏度要求较高的检测通常会构建双index文库[1]。
图中黄色和蓝色的部分是测序引物结合位点，相信机智的你一定发现了：index5在NovaSeq 6000和HiSeq X平台的测序方向是不同的。
完成Read1、index7测序之后，NovaSeq 6000平台会继续以这条链为模板进行index5的测序，测序引物是flowcell上的P5接头，因此index5的测序方向和Read1、index7是一致的。
而HiSeq X平台的index5、Read2测序则是在末端翻转后进行的，因此index5的测序方向与Read2一致，而与Read1、index7相反，同样的index5在HiSeq X和NovaSeq 6000平台测得的序列是反向互补的，因此在填写文库信息的时候一定要注意测序平台和序列的对应关系。
Vigene-稳转株构建流程
本文将介绍 Vigene Biosciences 公司提供的稳转株构建流程。
该流程适用于将
外源基因稳定地整合到目标细胞株中，并实现其高效表达。
以下是详细的步骤及操作细节。
1. 提供模板质粒和目标细胞
在开始构建稳转株前，需准备两种重要的生物材料：模板质粒和目标细胞。
其中，模板质粒包括外源基因和表达载体，可通过基因合成或克隆技术获得；目标细胞则根据不同的研究目的选择，如 HEK 293、CHO、及其他细胞株。
2. 质粒转染和筛选
将待转染的目标细胞株接种在培养皿或板上并培养至适当的密度。
使用细胞转
染试剂将模板质粒导入细胞内，使其整合到宿主基因组中。
经过一段时间（如48
小时）后，加入必要的筛选物质（如抗生素、抗代谢毒素等），淘汰未转染成功的细胞。
剩余的细胞则继续进行培养和筛选，直至筛选出稳定的转染株。
3. 稳定株的筛选和鉴定
使用 Western blot、荧光定量等多种技术手段，对稳定株进行鉴定和筛选。
只
有表达效果和稳定性良好的稳转株才能继续进行后续实验。
4. 大规模细胞培养和基因组验证
经过以上步骤的筛选和鉴定，获得的稳定转染株可进行大规模细胞培养。
同时，建议采用PCR、Southern blot等技术验证外源基因和宿主基因组的连接情况，并
进一步评估稳定转染株的表达特性和稳定性。
5. 结论
Vigene Biosciences 公司提供的稳转株构建流程是一套高效且经济实用的技术路线，能帮助研究者在较短的时间内获得稳定的转染株。
本文介绍了该流程的基本步骤及操作要点，供读者参考。
单克隆稳转株的构建技术原理
对感染并筛选后的混合克隆稳转株细胞进⾏稀释培养，挑取单⼀细胞⽣长⽽成的细胞克隆，再进⾏扩⼤培养，以获得性状单⼀、表达稳定的细胞株：
具体步骤如下：
1）将细胞消化后接种于96孔板中，接种的细胞密度为1个/孔（可通过有限稀释的⽅法，也可通过流式分选）；
2）标记出具有单个细胞的孔等细胞扩增后⽤puro进⾏筛选；
3）筛选完毕后，收集细胞进⾏qPCR或Western Blot鉴定，选择鉴定结果正常的单克隆细胞冻存保种
另外⼩编也整理了⼀些稀释法的⽅案给⼤家作为参考：
1）倍⽐稀释筛选
细胞计数设定⾸排的浓度，例如⾸孔设置10* cells/孔，每孔50*μl （细胞
浓度：100* cells/ml），96孔板补⾜最终培养体积100ul。
倍⽐稀释⽅法举例
注：标*体积均为参考，⼤家可以根据⾃⼰的实际情况进⾏调整
2）两步系列稀释筛选
两步系列稀释⽅法举例
稀释倍数参考：以⾸孔浓度选择1E4cell/孔*举例，标红区域出现1个细
胞的概率更⼤
3）直接稀释⾄1个/孔：以96孔板为例，将细胞消化后接种于96孔板
中，接种的细胞密度为1个/孔。
信访十问十答研讨材料一、信访的基本概念问：什么是信访？答：信访是指公民、法人或其他组织向国家机关、国家工作人员提出诉求、意见或要求解决问题的行为。
作为一种公民权利，信访具有合法性和公民参与政治的意义。
二、信访的渠道和途径问：信访的途径有哪些？答：信访主要通过书面信函、电话、网络、来访和代表等方式进行，其中书面信函和来访是最常见的信访途径。
三、信访的监督责任问：哪些机构负责监督信访工作？答：国家信访局和地方各级信访机构负责监督信访工作，同时民主法治建设部门、纪检监察机构等也都具有一定的监督职责。
四、信访的解决机制问：信访问题如何得到解决？答：信访问题的解决主要依靠政府相关部门的协调处理，同时也可以通过法律途径解决。
五、信访的法律保障问：信访者的权益受到法律怎样保护？答：《中华人民共和国信访条例》是保障信访者合法权益的基本法律依据，同时其他相关法律也会对信访者的权益进行保护。
六、信访的管理改革问：我国信访工作有何改革举措？答：近年来，我国信访工作进行了一系列改革举措，包括加强信访工作规范化、信息化、专业化以及提高信访工作效能等方面的改革。
七、信访的问题和挑战问：当前我国信访工作面临哪些问题和挑战？答：信访工作中可能存在的问题包括多头管理、反复信访、不合理申诉、简单化解决等。
而信访工作中的挑战则包括权责不清、资源不足、信息不畅等。
八、信访的社会治理问：信访工作与社会治理之间有什么关系？答：信访工作是社会治理的一部分，通过信访工作可以解决群众的合理诉求，维护社会稳定，促进社会和谐。
九、信访的宣传教育问：如何加强信访宣传教育？答：可以通过多种媒体渠道加强信访宣传教育，同时也可以在学校、社区等地开展信访知识的普及和教育活动。
十、信访的未来发展趋势问：未来我国信访工作的发展趋势是什么？答：未来，我国信访工作将更加注重规范化、专业化、信息化和人性化发展，更好地为群众解决问题、维护社会稳定。
结语通过以上问题和回答，我们对《信访十问十答》有了更深入的了解。
关于微生物肥料的十问十答11、什么是微生物肥料？微生物肥料是不同于化肥、有机肥的一种新型肥料。
它是一类以微生物生命活动及其产物导致农作物得到特定肥料效应的微生物活体制品。
也就是说，含有已知的、具有特定功能的微生物，是微生物肥料产品的本质特征。
产品中的这些功能微生物含量是它不同于其他肥料的核心技术参数和关键指标。
反之，如果产品中不含有已知的特定功能微生物，就不能称之为微生物肥料。
微生物肥料具有功效由产品中所含的微生物种类来决定。
由于微生物微生物种类很多，可依据实际需要选择不同功能的微生物菌种，生产出不同功能特点的微生物肥料产品。
有的微生物产品使用后可增加作物养分的供应量，有的产品能促进作物生长，有的产品可修复和净化土壤，有的产品能促进秸秆等有机物料的分解腐熟，有的产品可以提高作物的品质，有的产品可提高植物抗病、抗旱等抗逆能力。
也就是说，某一具体的产品以其中的1~2个功能为主，同时具备以上所有功能的产品几乎不可能。
因此，我们应该按照目标需求，选用不同功能的微生物肥料产品，才能发挥出产品的功效与特点。
基于以上对微生物肥料的认识，在农业行业标准《微生物肥料术语》（NY/T 1113-2006）中，将微生物肥料定义为含有特定微生物活体的制品，应用于农业生产，通过其中所含微生物的生命活动，增加植物养分的供应量或促进植物生长，提高产量，改善农产品品质及农业生态环境。
这一定义明确了微生物肥料的本质特征和功效范围。
2、微生物肥料产品有哪些种类？目前我国的微生物肥料产品分为：农用微生物菌剂、生物有机肥和复合微生物肥料三大类，其对应标准分别为《农用微生物菌剂》（GB 20287-2006）、《生物有机肥》（NY 884-2012）和《复合微生物肥料》（NY/T 798-2015）。
其中，农业微生物菌剂（简称菌剂、接种剂），又通称功能菌剂，按内涵的微生物种类或功能特性细分为根瘤菌菌剂、固氮菌菌剂、解磷微生物菌剂、硅酸盐微生物菌剂、光合细菌菌剂、有机物料腐熟剂、微生物浓缩制剂、促生菌剂、菌根菌剂、生物修复菌剂（土壤修复菌剂）等种类。
EPC与传统项目之别的十问十答近年来随着国家政策文件相继出台，EPC类的项目逐年趋多。
为适应公司高质量发展的需要，公司EPC项目的管理能力亟待进一步完善与提升。
那么，EPC项目到底是什么?它与传统项目之间有哪些区别在管理体系与管理内容上又有什么不同之处呢?一、问：EPC项目到底是指什么呀?与传统项目相比，有哪些新的内容呢?答：其实EPC就是Engineering(工程)Procurement(采购)Construction(施工)的缩写啦，是国际通用的工程总承包的简称。
它是指对工程建设项目的设计、报批报建、采购、施工、试运行等实行全过程或若干阶段的总承包。
在EPC模式中，项目内容不仅包括传统项目中的建设施工、安装、测试、试运行等工作(Construction)，还包括整个建设工程内容的总体策划以及全过程的设计工作(Engineering)、各类专业设备及材料的采购工作(Procurement)。
二、问：那EPC项目在管理内容上与传统项目有什么区别呢?答：EPC项目和传统模式的项目有很大区别的哦!首要表现在合同基本约定的不同，而合同上的显著差异，带来的是管理模式的变化。
首先，EPC项目的管理模式是设计、采购、施工的一体化管理，需要三者之间深度交叉，甚至有时候还需要加入财务融资管理等方面的管理内容，如F+EPC;其次，项目的管理过程由单一的建造阶段向上向下延伸至全生命周期的管理;最后，工程总承包管理核心能力的需求，应该是构成企业项目管理功能的各要素集成，包括组织架构设置、资源保障、考核评价、人才培养等。
由此可知，工程总承包企业的战略定位就应该是智力密集型和技术密集型公司，构建出与其发展战略相匹配的组织结构和人资体系，极大地支撑项目单元的集成化管理。
三、问：那么对于EPC项目，总包方一般在什么时间介入?这样的介入时间对项目管理带来了哪些优势与挑战?答：一般来说，EPC项目应包含设计、采购、施工的全过程，从项目的方案设计开始，工程总承包方就应参与其中。
稳定株构建之十问十答
1，什么是瞬时转染和稳定转染？
答：瞬时转染：顾名思义，外源片段的表达时间短暂。
这主要是因为外源导入的裸露的载体整合入基因组的几率非常低，所以以染色体外(episomal)形式存在，不能随细胞分裂而一同复制导致最后拷贝数被稀释导致的。
而且考虑到细胞分裂会稀释质粒的量，所以起初转染的质粒拷贝数极高。
这就导致瞬时转染呈现一个高拷贝到低拷贝迅速降低的过程，且无法在这个系统上实现可诱导表达。
稳定转染：是相对瞬时转染而言，进入细胞的质粒整合入细胞基因组中，并能随细胞分裂稳定传递下去。
在这个系统中，质粒表达稳定，拷贝数低，且能实现诱导表达。
稳定转染并不是一种与瞬时转染不同的方法，只是对瞬时转染的细胞进行筛选，得到稳定整合的细胞株。
稳定整合的几率因基因传递的方法而异，跨度可以从10-8到10-1。
因此，对于有的转染方法，比如化学试剂介导的转染，其整合几乎可以忽略不计。
质粒载体整合的位点并不是完全随机分布，依据不同的基因传递方法，呈现不同的靶向倾向性，所以是一种半随机整合。
2，设计稳定株构建实验需要考虑的因素有哪些？
答：稳定整合试验中需要考虑的几个关键因素有：
1)，外源插入片段的拷贝数。
多数情况下，低拷贝甚至是单拷贝可以减少人为实验因素的干扰。
2)，整合的几率，这不仅决定了稳定株筛选的难易程度，而且还可以帮助人们更容易得到混合稳定株。
3)，整合位点的转录活跃度，决定了稳定株中外源片段的表达质量。
最理想的状况是单拷贝，但转录活性比较高。
4)，整合后的稳定性。
不同的整合位点决定了外源片段在染色体中的稳定性，有些区域易发生重组或者丢失，从而导致稳定株再次丢失的情况。
5)，最好使用混合稳定株或者获得多个不同单克隆稳定株。
因为稳定整合往往伴随这插入失活宿主内源基因，所以实验时通过使用混合稳定株，或者对多个单克隆稳定株进行比较，可以帮助研究人员获得更精确的实验数据。
3，什么时候需要稳定细胞株？
答：以下实验，构建稳定细胞株而不是瞬时转染更能满足实验要求：
1)，外源片段在分裂细胞中长期(>2周)稳定表达。
虽然普通转染实验一般只能保证2-4天的转染和表达效率，但腺病毒载体在多数分裂细胞中可以维持2-4周内的高转染效率和表达周期。
而非分裂细胞，可以使用腺相关病毒载体转导外源基因，因为腺相关病毒载体在许多非分裂细胞中可以保持长达1年的高效表达。
2)，需要构建使用诱导表达系统，这主要是由于：a)，过表达基因或者干扰目的基因引起细胞毒性或者抑制细胞生长等不利因素; b)，目的基因的过表达或者干扰需要时空特异性。
3)，希望控制目的基因过表达或者干扰的拷贝数，以避免引入人为因素影响实验结果的精确性。
构建稳定株可以帮助筛选拷贝数适量的细胞进行实验研究。
4)，部分细胞种类，病毒载体亦无法达到高转导效率，通过构建稳定株，达到外源片段的高效表达。
5)，长期在少数几类细胞中研究几个基因的功能，通过构建稳定株，可以大大降低频繁转染或者病毒包装的成本，也极大方便实验研究。
6)，部分蛋白稳定性极强，瞬时RNA干扰因为作用周期短，只能抑制目的基因的表达，但无法去除已经表达的目的蛋白，所以需要通过构建稳定株实现更好的基因干扰效果。
7)，需要往动物体内注射表达有外源片段的细胞。
需要构建稳定细胞株，以防止注射入动物体内后，很快外源片段表达丢失。
8)，细胞个体差异(同一类细胞，不同个体细胞基因组存在差异)对实验结果有干扰，需要构建单克隆细胞株去除干扰。
9)，需要将外源片段插入基因组中，比如基因敲除，基因插入突变筛选等修饰基因组的实验。
4，什么时候不需要构建稳定株？
答：以下实验不需要构建稳定株：
1)，希望迅速观察目的基因过表达或者干扰效果。
例如在正式实验之前进行的小规模预实验。
2)，2-4天的瞬时表达已经可以达到具体的实验目的，比如检测两个外源转染的目的蛋白之间的相互作用，或者观察某些细胞周期抑制，凋亡或细胞存活相关基因的细胞表型。
3)，细胞个体差异对实验结果有影响。
体外培养非原代细胞，多为转化细胞系或者癌细胞，细胞个体差异大，瞬时转染或者使用腺病毒/腺相关病毒载体进行转导更可以反映细胞群体行为。
或者使用逆转录病毒载体构建混合稳定株。
5，病毒载体构建稳定细胞株有什么优势？
答：化学试剂介导的转染方法和电转，整合率低，同时整合位点不稳定，易发生再次丢失的情况，而且整合位点一般都在转录活跃区之外，所以并不是理想的稳定整合工具。
另外，整合后的拷贝数是由核内的外源DNA局部浓度，而不是转染时的DNA的量决定，而化学方法在输入质粒载体入核的效率比电转和病毒载体相比要低得多，导致其转染相同细胞所用质粒载体用量要大大高于其它方法，造成入核质粒载体量难以控制，这也解释了为什么化学转染方法和其它两种方法比，更倾向于得到串联多拷贝。
以上种种因素，导致使用非病毒载体转染方法构
建稳定株，成功率低，稳定性差，稳定克隆株易出现不均一(含有非整合细胞)等
缺点。
逆转录病毒载体由于整合率高，是非常理想的稳定株构建工具(表1)。
而且通过控制逆转录病毒载体转导的实验条件，理论上可以确保每个细胞只有单拷贝插入。
同时由于病毒载体是通过病毒重组酶将外源片段整合入染色体中，其整合特性和病毒自身整合特性非常相似：偏向于转录活跃区段，且整合后非常稳定，在传代100次后仍然保留在宿主基因组中。
最重要的是整合几率和所有其它化学，物理转染方法比，增加5至6个数量，使得稳定株构建不再成为实验研究的障碍。
由于整合几率非常高，所以很容易获得混合稳定株。
表1:不同转染方法介导的稳定整合参数比较
腺病毒载体整合率和普通转染方法差异不大，被认为是不能整合的一类病毒载体，因此相关研究数据较少，不建议用来构建稳定株。
非野生型腺相关病毒载体(Rep-)整合率较低，但因为野生型病毒载体可以定点将病毒基因组整合于人19
号染色体，所以从安全性和稳定性角度来说，潜力都非常巨大。
由于诸多因素，研究人员仍然在对其进行改造中，包括考虑到啮齿类动物不含有人19号染色体
对应的整合位点序列。
6，筛选稳定细胞株的方法主要有哪些？
答：主要有三类方法：
1)，单克隆环法：此类方法多用于整合率低的转染方法或者需要得到单克隆细胞株的实验。
其优点在于工作量小，只需将转染或者病毒载体感染后的细胞按照一定的细胞密度转移至新皿中，并使用合适的药物进行筛选，最后在克隆环的帮助下对单克隆细胞株进行挑选，并在新皿中完成扩增。
缺点在于需要对细胞密度和药物浓度绘制致死曲线并选取合适的细胞密度和药物浓度进行筛选，一些细小的密度和浓度差别都会导致难以获取均一的单克隆，结果导致获取的克隆不纯，含
有非整合的细胞。
稳定整合的细胞在这样一类混合细胞中，很快会失去生长优势，
最终导致失去稳定株。
2)，96孔单克隆稀释法：此类方法同样多用于整合率低的转染方法或者需要得到单克隆细胞株以及筛选悬浮细胞稳定株的实验。
其优点在于，理论上可以得到非常均一的单克隆，同时可以筛选悬浮细胞稳定株。
其缺点在于，工作量比较大。
3)，逆转录病毒混合克隆制备法：此类方法适用于需要制备混合稳定株。
优点在于可以在短时间内(1周)获得稳定细胞株，同时也可以随时将细胞稀释转移至新皿中获得单克隆细胞株。
缺点在于需要制备逆转录病毒载体。
7，为什么常规转染方法筛选稳定株异常困难？
答：常规化学转染或者电转方法，其整合是非同源重组随机整合，几率非常低(10-8-10-6) ，且这些转染条件下发生的整合多发生在转录非活跃区或者重复序列区，导致外源片段表达效率低，同时这些整合常常不稳定，随着传代次数的增加，即使在有压力选择的情况下也容易发生丢失。
8，为什么病毒载体介导的稳定株筛选方法效率要比常规方法高？
答：逆转录病毒载体的染色体整合依赖于病毒重组酶，是一个酶催化反应，因此效率相比随机整合要高多个数量级。
而且整合位点多位于转录活跃区，因此表达效率高。
同时其整合非常稳定，连续传代100代以上仍然保持稳定表达。
9, 如何选择适合的病毒包装类型进行稳定株筛选？
答：并非所有的病毒载体都适合用来进行稳定株筛选(表六)，首先需要挑选整合效率高，整合位点稳定的病毒载体。
至今为止，逆转录病毒载体是最有效的可以介导基因整合的病毒载体。
其次，依据具体实验要求，挑选不同整合位点倾向性的逆转录病毒载体。
倾向于整合于转录起始位点附近的，容易造成下游基因的激
活; 而整合于转录活跃基因内的，容易导致整合区基因的插入失活。
10, 病毒载体介导的稳定株筛选方法可以适用于任何靶细胞吗？
答：虽然普通的逆转录病毒载体可以用来进行稳定株的构建，然而这一类病毒载体并不能高效感染非分裂细胞，因此对于这一类分化细胞，可以使用慢病毒载体进行稳定株构建。
也可以使用腺相关病毒载体高效感染非分裂细胞，这一类病毒载体虽然整合率低于慢病毒载体，但其可以以染色体外形式长期(数月至数年)存在于非分裂细胞中，因此可以避免进行稳定株筛选。
