猪流感病毒检测卡说明书(完整版)

猪流感，是集约化养猪场普遍存在且难以根除的猪呼吸道疾病之一，也是世界上最常见的猪传染病之一，目前有10种血清亚型。

H1N1亚型SIV在中国日趋复杂和多变，与其他亚型流感病毒密切相关，并在其他谱系之间发生多重重组，其中基质蛋白位于流感病毒第7段，含有1 027个核苷酸，具有M1和M2两个相互重叠的编码区。

本试验通过对三株H1N1亚型SIV的M基因进行鉴定分析，为进一步防控猪流感病毒的流行和进化情况提供资料。

1 实验材料1.1 材料广东清远某养猪场采集的具有流感症状的猪的猪鼻腔拭子，置于－80℃冰箱保存。

SPF（无特定病原体）鸡胚购自广东新兴大华农禽蛋有限公司SPF实验动物中心。

基因工程菌为E.coil DH5α，感受态（T a KaRa，日本）；常规克隆T载体是pMD19-T Vector （T aKaRa，日本）。

1.2 实验相关试剂、试剂盒、培养基Ex T aq®（Catalog No. DRR001A）、dNTP Mix-ture（Catalog No. D4030RA）、pMD®19-T Vector （Catalog No. D102A）、E.Z.N.A.® Gel Extraction Kit （Catalog No. D2500-01），E.Z.N.A.® Plasmid Mini Kit I（Catalog No. D6943-01）：（Omega公司产品）。

RNase inhibitor（T aKaRa，日本）、DNase Ⅰ（T aKaRa，日本）、Surface RNase Erasol（北京天恩泽基因科技有限公司，中国）、FastStart SYBR Green Master (Rox)（Roche，瑞士）、RNAiso Plus RNA提取试剂（Catalog No. D9108A）、PrimeScript® One Step RT-PCR Kit Ver. 2（Catalog No. DRR055A）。

猪瘟抗体快速检测试剂盒——（胶体金法）使用说明书【名称】通用名称：猪瘟抗体快速检测试剂盒（胶体金法）英文名称：Rapid Anti-CSFV Test汉语拼音：Zhuwen Kangti Kuaisu Jiance ShijiHe(Jiaoti Jin Fa)【用途】用于检测猪血清/血浆/全血样品中猪瘟(Classical Swine Fever, CSF)抗体。

【实验原理】猪瘟抗体快速检测试剂盒（胶体金法），系采用胶体金免疫层析技术，检测样品（血清、血浆或全血）中猪瘟抗体的方法。

在玻璃纤维纸上预包被金标记灭活猪瘟抗原（Au-Agl），在硝酸纤维素膜上检测线和对照线处分别包被猪瘟抗原(Ag2)和兔抗猪瘟抗体。

当检测样品为阳性时，样品中猪瘟抗体与胶体金标记猪瘟抗原（Au-Ag1）结合形成复合物，由于层析作用复合物沿纸条向前移动，经过检测线时与预包被的猪瘟抗原(Ag2)形成“Au-Ag1-猪瘟抗体-Ag2-固相材料”免疫复合物而凝聚显色，游离金标记抗原则在对照线处与兔抗猪瘟抗体结合而富集显色。

阴性样品则仅在对照线处显色。

操作简便，快速，结果直观、准确，灵敏度高，容易判定。

【试剂盒组成】1.猪瘟抗体检测卡50头份2.说明书1份3.一次滴管50根【操作方法】1.用1.5ml样品管，采血0.5-1ml待检测血清自然析出或用离心机离心10分钟左右，使血清析出。

2.将检测卡平置于桌面上，用吸管吸取被检血清，在检测卡的椭圆形加样孔内加入2滴约80~100ul。

在室温下反应20分钟判定结果。

（检测卡如在4℃保存，必须恢复至室温后方可进行检测）【结果判定】阳性：对照线区（C）和检测线区(T)各出现一条紫红色线。

检测线(T)的颜色越深，表明猪瘟抗体的滴度越高。

阴性：只有对照线区（C）出现一条紫红色线。

无效：未出现紫红色线或只在检测区(T)出现紫红色线，对照线区(C)未出现紫红色线。

【诊断参考】被检样品加样后20分钟可与对照卡的色带滴度进行参考比较。

猪细小抗体金标快速检测卡使用说明书
【原理】
猪细小病毒抗体检测试剂盒(胶体金法)，系采用国际最先进的胶体金免疫层析技术检测样本(全血、血清、血浆)中抗猪细小病毒抗体的方法。

整个试验只需10分钟，操作简便、快速、准确，灵敏度高、结果直观、容易判定。

【操作步骤】
1．在检测卡的加样孔内加入2滴(100ul)待检血清或血液样品。

2．将检测卡平放于桌面上，在室温下静置5－10分钟内判定结果。

超过30分钟的结果只能作为参考。

【结果判定】
1. 阳性：在观察孔内，检测线区(T)及对照线区(C)同时出现紫红色线。

猪细小病毒抗体滴度越高，检测线(T)颜色越深。

2. 弱阳性：在观察孔内，检测线区(T)及对照线区(C)同时出现紫红色线，但检测线区(T)出现的颜色很浅。

3. 阴性：在观察孔内，只有对照线区(C)出现一条紫红色线。

4. 失效：在观察孔内，对照线区(C)和检测线区(T)都不出现紫红色线；或仅检测线区(T)出现紫红色线。

【注意事项】
铝箔打开后，检测卡应尽快使用；受潮后检测卡将失效。

常温保存，保质期18个月。

【特点】
敏感：阳性检出率达到98%；
特异：不与其它常见猪病如蓝耳病、伪狂犬、猪瘟发生交叉反应，特异性97%；
方便：肉眼判断、无需仪器、操作简单；
快速：5－10分钟即可以出结果，有利于疫情的快速鉴别和免疫水平监测；用途：适合于各级防检部门、猪场、兽医站广泛使用。

广西畜牧兽医2019年Vol.35(4)173措施，以免发展成为重度脱肛。

整复手术只是一个疗，调整母猪各项生理机能，才能确保母仔平安，将简单的外科手术，术后护理才是保证手术成功的关因脱肛造成的损失降到最低。

键，只有找出引起脱肛的根本原因并进行相应的治猪流感的防控及检测样品采集方法孔子荣】，李三木2,张书祥】，韩银华2,熊毅2*（1-广西大学动物科学技术学院，广西南宁530005,2.广西壮族自治区动物疫病预防控制中心，广西南宁530001）中图分类号:S858.285.3文献标识码：B 1猪流感及其防控意义猪流感（swine influenza，SB）呈世界性分布，各地均有流行，发病率高［1］（猪流感能直接引起患病猪的死亡，并使患病猪的生长或生产不良，对养猪业的危害极大，研究表明康复猪和隐形感染猪是以后猪流感的传染染，猪流感作为一种主要的免疫抑制疾病，在猪场中普遍存在且难以根除［1，2］（猪在感染猪流感病毒（SIB）后，易导致呼吸系统疾病的并发或者混合感染，加剧流感病毒危害性，加大死亡率。

猪也是流感病毒“混合器”，极易产生流感病毒基因重排带来极其严重的公共卫生安全问题，因此猪流感的防控极其重要。

2防控措施2.1综合防控适当减小饲养密度，避免猪由于拥挤造成的应激，建议保育舍每头仔猪应有0.3m2~0.4m2的生活空间，育肥猪应有0.7m2以上的生活空间。

加强猪舍通风换气能力，应采用自然通风和机械排风，避免由于空气条件恶劣损伤猪呼吸道,导致其防御能力降低而发病。

改善营养条件，良好的营养条件可提高猪对疾病的抵抗能力。

针对不同阶段的猪群要合理配制饲料，注意补充保证猪免疫功能的微量元素，有研究表明架子猪饲料中添加维生素E和硒，增加猪对猪流感的免疫反应水平叫强化生物安全，除了猪场选址布局合理以及完善的废物处理和消毒措施外，由于SIB既感染猪又感染人，因此还应特别注意人携带猪流感病毒的传入，外来人员不应带入猪场内参观⑷，避免生物性传播造成病毒传入。

猪瘟ELISA抗体检测试剂盒猪瘟病毒ELISA抗体检测试剂盒使用说明书【简介】试剂盒由抗原包被的微孔板，酶标羊抗猪IgG及其它试剂制成，应用间接ELISA原理检测猪血清中抗猪瘟病毒抗体。

【用途】猪瘟ELISA诊断试剂盒用于检测猪血清中猪瘟病毒抗体。

评估猪场猪瘟疫苗免疫状况，感染猪的血清学诊断。

【原理】本试剂盒是采用猪瘟抗原包被微孔板，在试验中，加入稀释的对照血清和待检血清，经温育后，若样品中含有抗猪瘟病毒的特异性抗体，则将与检测板上抗原结合，经洗涤除去未结合的抗体和其他成分后；再加入酶标二抗，与检测板上抗原抗体复合物发生特异性结合；再经洗涤除去未结合的酶结合物，在孔中加TM B底物液，与酶反应形成蓝色产物，加入HF溶液终止反应后，用酶标仪630nm波长测定各反应孔中的OD 值。

【试剂盒主要成分】1 包被抗原的微孔板 2块（96孔/块）2 阴、阳性对照血清各1管（0.5ml/管）3 羊抗猪酶标二抗 1瓶（20ml/瓶）4 20倍浓缩洗涤液 1瓶（30ml/瓶）5 底物A液、B液各1瓶（10ml/瓶）6 终止液 1瓶（10ml/瓶）7 样品稀释液 1瓶（50ml/瓶）8 血清稀释板 2块（96孔/块）9 说明书 1张【样品制备】取动物全血，按常规方法制备血清，要求血清清亮，无溶血。

【洗涤液配制】使用前，浓缩的洗涤液应恢复至室温（25℃左右），并摇动使沉淀的盐溶解（最好在37℃水中加热5-10m in），然后用蒸馏水或去离子水作20倍稀释（例如：每板用20 ml浓缩液加上380ml水），稀释好的洗涤液在4℃可以存放7天。

【样品稀释】在血清稀释板中按1：40的体积稀释待检血清（195μl样品稀释液中加5μl待检血清）。

注意：阳性对照和阴性对照1：40稀释，（234μl样品稀释液中加6μl对照血清）。

【注意事项】1 试剂盒使用前各试剂应平衡至室温，使用后放回2-8℃。

2 不同批号试剂盒的试剂组分不得混用，使用试剂时应防止试剂污染。

猪瘟抗原快速检测试剂盒——（胶体金法）使用说明书【名称】通用名称：猪瘟抗原快速检测试剂盒（胶体金法）英文名称：Rapid CSFV Test汉语拼音：Zhuwen Kangyuan Kuaisu Jiance Shiji He(Jiaoti Jin Fa)【用途】用于检测猪血清/血浆/全血样品中猪瘟病毒(Classical Swine fever virus, CSFV)抗原，用于猪瘟的辅助诊断。

【实验原理】猪瘟病毒抗原快速检测试剂盒（胶体金法）采用胶体金免疫层析技术，在玻璃纤维纸上预包被金标记鼠抗猪瘟病毒单克隆抗体（Au-Ab1），在硝酸纤维素膜上检测线和对照线处分别包被鼠抗猪瘟病毒单克隆抗体（Ab2）和羊抗鼠IgG，检测样品为阳性时，样品中的猪瘟病毒抗原（Ag）可与包被在试纸条前端的胶体金标记的鼠抗猪瘟病毒单克隆抗体（Au-Ab1）结合，形成免疫复合物，由于层析作用，复合物沿膜带向前移动，经过检测线时与预包被的鼠抗猪瘟病毒单克隆抗体（Ab2）形成“Au-Ab1-Ag-Ag2-固相材料”免疫复合物而凝聚显色，游离金标记抗体在对照线处与羊抗鼠IgG体结合而富集显色。

阴性样品则仅在对照线处显色。

检测时只需将血清/血浆/全血加在检测卡的加样孔内，操作简便、快速，结果直观、准确，灵敏度高，容易判定。

【试剂盒组成】1.猪瘟抗原检测卡50头份2.说明书1份3.一次滴管50根【试验方法】1、将检测卡从铝箔袋中取出，水平放置并做好标记。

2、在检测卡的加样孔内加入2滴（70-100ul）待检血清/血浆/全血标本。

3、20分钟内观察并记录实验结果。

【结果判定】阳性：对照线区（C）和检测线区（T）各出现一条紫红色线。

阴性：只有对照线区（C）出现一条紫红色线。

无效：未出现紫红色线或只在检测区(T)出现紫红色线，对照线区(C)未出现紫红色线。

【注意事项】1. 操作前请仔细阅读说明书；2. 检测样品可以是血清/血浆/全血；3. 检测卡从铝箔袋中取出后，应尽快进行试验，避免放置于空气中过长时间，试剂吸潮后将失效；4. 实验环境应保持一定湿度，避风，避免在过高温度下进行试验；5. 试剂盒在室温下保存，如在2-8℃冷藏，使用前应平衡至室温后方可打开铝箔袋进行检测操作。

附件3.人猪流感（H1N1）病例标本采集和实验室检测指南（暂行）猪流行性感冒（ H1N1病毒）病毒的检测所有猪流行性感冒（ H1N1病毒）疑似病例应该采集上呼吸道标本来检测猪流行性感冒（ H1N1病毒）的病毒。

推荐采集的呼吸道标本：疾病发病后应尽快采集如下标本：鼻咽拭子/吸取物或者鼻腔冲洗液/吸取物。

如果不能收集这些标本，可合并鼻拭子与口咽拭子。

气管插管的病人也应收集气管吸取物。

标本应置于无菌病毒运输液（ VTM ），并立即用冰块或冰排保存或置于4 ℃（冰箱），并马上运送至实验室。

临床样品收集人员及实验室人员的感染控制指导请见相关文件。

拭子理想的情况下，标本应使用头部为合成纤维的拭子（例如，聚酯纤维），用铝或塑料做杆。

不推荐棉拭子和木杆。

不能用海藻酸钙做的拭子收集标本。

标本采集管应包含3毫升病毒运输液（例如，含有蛋白质稳定剂，阻止细菌和真菌生长的抗生素，缓冲液）。

临床标本储存所有呼吸道标本应保存在4℃，并尽快放置在-70℃。

如果没有-70℃度冰箱，标本应保存在4℃，但不应超过4天。

临床标本运输临床标本应按照A类包装要求运送，并用干冰运输。

所有标本应标示清楚。

疑似病例标本运送应包含的信息请参照禽流感标本运输。

检测程序呼吸道标本应首先应用real time RT-PCR方法检测A型流感病毒的M基因、Swine （ H1N1）的HA基因和NP基因，以及质控对照RNP基因。

同时，接种MDCK细胞或SPF鸡胚进行病毒分离，并测定病毒的全基因组序列。

推荐的检测方法用Real-time RT-PCR方法检测猪流行性感冒（ H1N1病毒）病毒。

其他检测方法快速流感抗原检测一些商用快速检测可以区分A和B型流感病毒。

快速检测实验A型流感阳性的病例符合可能病例的标准（见上文）。

这些实验对检测人感染猪流行性感冒（ H1N1病毒）病毒临床标本的敏感性和特异性未知，而且检测季节性流感病毒的灵敏度不佳。

因此，快速检测阴性结果可能是假阴性，不能作为猪流感感染的最后诊断。