肺炎支原体检测方法

国际检验医学杂志２０１５年７月第３６卷第１４期Ｉｎｔ　Ｊ　Ｉｍｂ　Ｍｅｄ，Ｊｕｌｙ　２０１５，Ｖｏ１．３６，Ｎｏ．１４　・论　著・　不同方法检测肺炎支原体的比较　李海平　，杜　昆　（湖北省荆州市第一人民医院：１．核医学科；２．检验科，湖北荆州４３４０００）　摘　要：目的　研究不同方法检测肺炎支原体的灵敏度和特异性。方法　采集１９９例肺炎患者的血清和咽拭子，分别用酶联　免疫吸附试验（ＥＬｌＳＡ）和荧光定量ＰＣＲ技术检测肺炎支原体ＩｇＭ抗体和ＤＮＡ。结果　１９９例肺炎患者按照支原体肺炎诊断标　准，６１例确诊为支原体肺炎，ＥＩ　ＩＳＡ法和ＰＣＲ法检测的灵敏度分别为８６．９　和９６．７　，特异性分别为７８．３　和９７．１　。结论　ＰＣＲ法检测的灵敏度和特异性均高于ＥＬＩＳＡ法。　关键词：肺炎支原体；　荧光定量ＰＣＲ；　酶联免疫吸附试验　ＤＯＩ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１６７３—４１３０．２０１５．１４．０４８　文献标识码：Ａ　文章编号：１６７３—４１３０（２０１５）１４—２０６１－０２　Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ　ｏｆ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｏｒ　ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ　ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ　Ｌｉ　Ｈａｉｐｉｎｇ　．Ｄｕ　Ｋｕｎ　（１．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｎｕｃｌｅａｒ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ；２．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｊｉｎｇｚｈｏｕ　Ｍｕｎｉｃｉｐａｌ　Ｆｉｒｓｔ　Ｐｅｏｐｌｅ　ｓ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｊｉｎｇｚｈｏｕ，Ｈｕｂｅｉ　４３４０００，Ｃｈｉｎａ）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ　ｔｈｅ　ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ　ａｎｄ　ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ　ｏｆ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ　ｐｎｅｕ—　ｍｏｎｉａｅ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｔｈｅ　ｓｅｒｕｍ　ａｎｄ　ｔｈｒｏａｔ　ｓｗａｂ　ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ　ｗｅｒｅ　ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ　ｆｒｏｍ　１　９９　ｐｎｅｕｍｏｎｉａ　ｐａｔｉｅｎｔｓ．ＥＬＩＳＡ　ａｎｄ　ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ　ｆｌｕｏｒｅｓ—　ｃｅｎｃｅ　ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＦＱ＿ＰＣＲ）ａｓｓａｙｓ　ｗｅｒｅ　ｕｓｅｄ　ｔＯ　ｄｅｔｅｃｔ　ｔｈｅ　ｓｅｒｕｍ　ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ　ＩｇＭ　ａｎｔｉｂｏｄ—　Ｙ　ａｎｄ　ＤＮＡ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ａｍｏｎｇ　１　９９　ｐｎｅｕｍｏｎｉａ　ｐａｔｉｅｎｔｓ，６　１　ｃａｓｅｓ　ｗｅｒｅ　ｄｉａｇｎｏｓｅｄ　ａｓ　ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａ　ａｃｃｏｒｄｉｎｇ　ｔＯ　ｔｈｅ　ｄｉａｇｎｏｓｉｓ　ｓｔａｎｄａｒｄ．Ｔｈｅ　ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ　ａｎｄ　ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ　ｏｆ　ＥＬＩＳＡ　ａｎｄ　ＦＱ－ＰＣＲ　ｆｏｒ　ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ　ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ　ｗｅｒｅ　８６．９　ａｎｄ　９６．７　，ａｎｄ　７８．３％ａｎｄ　９７．１　，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　Ｔｈｅ　ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ　ａｎｄ　ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ　ｏｆ　ＦＱ－ＰＣＲ　ｆｏｒ　ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ　ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ　ａｒｅ　ｈｉｇｈｅｒ　ｔｈａｎ　ｔｈｏｓｅ　ｏｆ　ＥＩ　ＩＳＡ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ；　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ；　ｅｎｚｙｍｅ—ｌｉｎｋｅｄ　ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ　ａｓｓａＹ　肺炎支原体（ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ，ＭＰ）是儿童呼吸道　感染的常见病原体，在各个年龄组均可致病　］，其发病率近年　来有逐渐上升的趋势　］。患者感染肺炎支原体后可导致上呼　吸道感染、支气管炎、哮喘、不典型肺炎等一系列呼吸道疾病，　甚至可并发肺外多系统器官疾病　５　］。由于肺炎支原体肺炎临　床表现不典型，且存在各种肺外并发症，容易导致误诊。因此，　对肺炎支原体的检测不但有利于肺炎支原体肺炎的早期诊断　和早期治疗，而且可以降低该病引起的并发症，具有重要的临　床价值。本研究通过酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）和荧光定量　ＰＣＲ（ＦＱ—ＩＣＡ）检测１９９例临床肺炎患者的肺炎支原体ＩｇＭ抗　体和ＤＮＡ，探讨这两种方法检测肺炎支原体的临床应用价值。　１资料和方法　１．１　一般资料　２０１４年７～１ｏ月本院儿科和呼吸内科肺炎　患者共ｔ９９例，其中男１０１例，女９８例，最大年龄７３岁，最小　年龄１个月，平均年龄（９．７１－－－＋－１６．７２）岁。按照肺炎支原体肺　炎诊断标准，６１例确诊为支原体肺炎。　１．２检测方法血清肺炎支原体ＩｇＭ抗体采用德国欧蒙医　学实验诊断股份公司肺炎支原体ＩｇＭ抗体ＥＬＩＳＡ检测试剂　盒检测，咽拭子肺炎支原体ＤＮＡ采用达安基因股份有限公司　肺炎支原体核酸扩增荧光定量检测试剂盒检测。具体操作按　照试剂盒说明书进行。　１．３统计学处理　采用统计软件ＳＰＳＳ　１３．０对实验数据进行　检验，以Ｐ＜０．０５为差异有统计学意义。　２　结　果　２．１两种方法检测肺炎支原体的结果　两种方法检测肺炎支　原体均阳性６Ｏ例，均阴性１１３例；ＰＣＲ阳性，ＥＬＩＳＡ阴性３　例；ＰＣＲ阴性，ＥＬＩＳＡ阳性例２３例。二者比较差异有统计学　意义（Ｙ　一４．３２７，Ｐ＜０．０５），见表１。　表１　两种不同方法检测ＭＰ的结果比较《ｎ）　

肺炎支原体的临床检测方法研究

【摘要】目的：研究不同检测方法对肺炎支原体检出率的灵敏度和特异度，为临床快速、准确检测肺炎支原体寻找线索。方法：将我院2009年5月至2011年12月间拟诊为肺炎支原体感染的729例患者随机分配为三组，每名患者取痰标一份，血清标本两份，分别经肺炎支原体培养、肺炎支原体核酸聚合酶链反应(pcr) 扩增和血清学检测[1]（酶联免疫吸附法elisa）, 比较3 种方法的检测结果。结果：三种方法检出率分别为44.2%，84.1%和73.5%，其中痰培养法与pcr 法比较，差异具有显著性(χ2= 15. 464, p < 0.

001) ;血清学法与痰培养法比较，差异具有显著性(χ2= 6. 238, p

< 0. 01) ;而 pcr 法与血清学法比较差异无显著性(χ2= 3. 269,

p = 0. 061)。结论：pcr 法与血清学法对肺炎支原体检出率较痰培养法要高，可作为临床检测的首选方法。

【关键词】肺炎支原体；聚合酶链反应；检测技术

1资料与方法

1.1一般资料选择我院呼吸内科2009年5月至2011年12月间拟诊为肺炎支原体感染的729例患者，按照随机化原则将其分为a、b、c三组。其中a组243人，患者年龄在20~51岁之间，平均（37.02±7.21）岁；b组243人，患者年龄在21~54岁之间，平均（37.56±7.33）岁；c组243人，患者年龄在18~50岁之间，平均（36.56±7.49）岁。所有病人均签署知情同意书，为自愿参与课题研究。

1.2方法

1.2.1标本采集方法痰液标本于患者入院后拟诊为肺炎支原体感染的次日清晨收集，血液为清晨空腹血。

1.2.2肺炎支原体培养方法取痰后置于试管内，加入2ml生理盐水稀释，之后直接接种于支原体培养基（由上海信然生物培养基提供）上，置于37℃恒温箱内培养3到5天。

肺炎支原体实验室检测的方法及临床意义

肺炎支原体(mp)无细胞壁最外层为细胞膜，主要通过呼吸道传播，它不仅引起多种呼吸道疾病，还可导致肺外其他系统的多种并发症。肺炎支原体的致病首先通过其顶端结构粘附在宿主细胞表面，并伸出微管插入胞内吸取营养、损伤细胞膜，继而释放出核酸酶、过氧化氢等代谢产生引起细胞的溶解、上皮细胞的肿胀与坏死。诱发机体产生的抗体也可能参与了上述病理损伤。呼吸道分泌的si-ga对再感染有一定防御作用，但不够牢固。因mp缺乏细胞壁只对大环内酯类、四环素类等抗生素较为敏感，对常规治疗肺炎的抗生素耐受，而mp感染与病毒及细菌感染引起的呼吸道感染表现难以区别，为避免滥用抗生素，实验室诊断显得尤为重要。现将常用肺炎支原体实验室检测的方法及临床意义分述如下。

病原体的分离与培养

取疑似病人的咽分泌物、痰或胸水接种于2ml无血清液体培养基。并以培养基10倍连续稀释二管、三管同时培养，6周后培养液颜色未改变的判为阴性。不能判断的，取0.1ml接种于牛心浸液的固体平板培养基上，在5％c02环境中，37℃培养1～2周即可长出菌落。选择疑似菌落做溶血试验、生长抑制试验、氯化三苯基四氮唑还原试验、糖发酵分解试验、豚鼠红细胞吸附试验等进行鉴定。mp的分离培养是寻找病原体最可靠的方法，但耗时长(2～3周)，对标本运送及堵养基的要求高，且敏感性一般，尚不能依靠它解决临床快速诊断。故不能用于常规检测，但仍是寻找病原体及流行病学调查的可靠指标。

血清学检查

mp的抗原成分主要存在于细胞膜上，由菌体的脂肪成分所构成，为糖脂类。已知mp感染后，mp可刺激b细胞产生igm及16；抗体，在鉴定上具有重要意义。主要检测方法有对抗体、抗原及核酸的检测。

补体结合试验：人感染mp后，mp的抗原糖脂成分刺激机体产生特异性抗体，与肺炎支原体细胞膜成分致敏的绵羊红细胞结合形成固着补体使之不发生溶血反应，反之则激活补体，与后加入指示系发生溶血反应，一般补体结合抗体在感染后7～8天开始上升，3～4周达高峰，维持4～6个月，血清效价在1:64以上或恢复期比急性期有4倍或4倍以上增高有诊断意义。但补体结合试验需要一定的仪器和技术，操作较复杂，不适用于临床常规检测。

肺炎支原体检测方法的研讨

摘要】肺炎支原体是引起支原体肺炎的主要病原体。支原体肺炎约占各种肺炎的10％，已成为发病率最高的传播疾病.严重的支原体肺炎也可导致死亡。由于技术局限，目前对肺炎支原体检测仍存在不少局限性。本文就各种检测方法进行简要的分析，以其给临床检测人员实用的参考。

【关键词】肺炎支原体;支原体肺炎;检测

【中图分类号】R485【文献标识码】B【文章编号】1005-0515(2011)06-0373-02

肺炎支原体是介于病毒和细菌之间的一种微生物，是人类支原体肺炎的病原体。肺炎支原体平均直径125-150um，没有细胞壁。肺炎支原体的致病性可能与感染者对病原体或其代谢产物的过敏反应有关。肺炎支原体被呼吸道吸入后，黏附于宿主呼吸道上皮细胞表面，抑制纤毛活动与破坏上皮细胞。

支原体肺炎的临床表现和胸部X线检查并不具特征性，单凭临床表现和胸部X线检查无法做出诊断。若要明确诊断，需要进行肺炎支原体的检测。目前，国内肺炎支原体的诊断主要依靠血清学检测和病原体培养。

1主要检测方法介绍

1.1补体结合试验:补体结合试验是诊断肺炎支原体常规使用的血清学诊断方法。取急性期和恢复期双份血清，测定结果，前后检测效价呈4倍增长或单份血清效价不小于1∶32判定为阳性。补体结合试验的敏感性高，特异性很好，但检测上的缺陷是初次感染时出现阳性率高，再次感染时容易出现假阴性反应。

1.2间接血凝试验:间接血凝试验检测肺炎支原体IgM抗体。一般在感染肺炎支原体后7天出现阳性，10～30天达高峰，12～26周逐渐降低。检测缺陷在于很多感染者采血时错过急性期，难以测出4倍增高的抗体。特异性比较不理想。

1.3冷凝集试验:冷凝集试验是一种诊断肺炎支原体感染的非特异性试验，阳性率为33%～76%。效价越高该病的可能性越大，常在发病的第一周末或第二周初出现阳性反应，持续约2～4个月。检测缺陷在于婴幼儿腺病毒、副流感病毒等引起的肺炎和呼吸道感染也可出现假阳性反应。特异度和敏感度均为最低，因此其临床诊断价值不大。