革兰氏染色法(Gram's stain)是最常用的细菌染色法，本实验要求同学能正确掌握此染色方法的操作技术，理解其在鉴别细菌上的重要意义。
【原理】
细菌经结晶紫初染染成蓝色。革兰氏染色阳性菌（G+）细胞壁肽聚糖层数多，且肽聚糖为空间网状结构，再经乙醇脱水，网状结构更为致密，染料复合物不易从细胞内漏出，仍为蓝色。而革兰氏染色阴性菌（G-）细胞壁脂类含量多，肽聚糖层数少，且肽聚糖为平面片层结构，易被乙醇溶解，使细胞壁通透性增高，结合的染料复合物容易泄漏，细菌被脱色为无色，再经石炭酸复红稀释液复染成红色。
【材料】
【方法】
按涂片→干燥→固定→染色→镜检的顺序进行。准备载物玻片：用镊子从载物片缸中取出经3％盐酸酒精脱脂的载物玻片，用擦片布擦净，然后用特种铅笔在玻片背面画一个直径为1.5~2.0cm的圆圈，做为涂膜的标记范围。
1．涂片：按无菌操作取材法进行，具体步骤如下：
用肉汤培养物涂片：
① 右手拿接种环的黑色塑料柄部分，左手托持试管。
② 将接种环按15°角放在煤气灯的外焰中烧灼灭菌，直到把金属丝
烧红(图1-2)，然后将铝制的银色柄部也通过火焰略加烧灼。
③ 用右手小指和手掌的前内缘拔掉左手所持试管的棉塞，并立即将 试管口用火焰烧灼灭菌。
④ 用灭菌后已冷却的接种环伸入试管中取出材料(图1-3)，此时注
意勿使沾有材料的接种环触碰试管壁及试管口。
⑤ 将试管口再次灭菌，棉塞也要在火焰上略加烧灼（时间要短以免
点燃棉塞），塞好棉塞，放回原处。
⑥ 将接种环上之材料涂于载物片上，随后立即将接种环用火焰烧灼
灭菌。为防止细菌溅散污染环境，接种环灭菌前，须先将接种环靠近火
焰或放内焰中烤干，然后再在外焰中烧红灭菌，杀死残留的细菌。
用斜面培养物涂片：
用细菌斜面培养物涂片，需预先取一接种环生理盐水放在载物片
上，然后再按无菌操作取材法从斜面培养物上取少量菌苔，在水滴内轻
轻研磨将细菌制成菌悬液，再涂成一薄膜。无菌操作取材步骤同前。
- 1 - 实验二 微生物染色
一、实验目的
1、进一步熟悉和掌握显微镜的操作方法；
2、学习用压滴法制作标本片；
3、学习微生物染色的原理；
4、学习微生物涂片、染色的基本技术。
二、实验仪器和材料
显微镜、香柏油（或液体石蜡）、二甲苯、擦镜纸、吸水纸、接种环、载玻片、酒精灯；
美蓝染液，草酸铵结晶紫染液、革氏碘液、95%乙醇、蕃红染液；
酵母菌、大肠杆菌、枯草杆菌。
三、染色原理
微生物（尤其是细菌）的机体小且是无色透明的，在活体细菌内又含有大量的水分。因此，对光线的吸收和反射与水溶液相差不大。当把细菌悬浮在水滴内，放在显微镜下观察时，由于与周围背景没有明显的明暗差，难以看清它们的形状，更谈不上识别其细微结构。通常用染料将菌体染上颜色以增加反差，在显微镜下观察。
微生物细胞是由蛋白质、核酸等两性电解质及其它化合物组成的，所以微生物细胞表现出两性电解质的性质。两性电解质兼有碱性基和酸性基，在酸性溶液中离解出碱性基呈碱性，带正电；在碱性溶液中离解出酸性基呈酸性，带负电。经测定，细菌的等电点pI在pH=2~5之间，故细菌在中性（pH=7）、碱性（pH > 7）或偏酸性（pH=6~7）溶液中，细菌等电点均低于上述溶液的pH值，所以细菌带负电荷，容易与带正电荷的碱性染料结合，故用碱性染料染色的居多。碱性染料并不是碱而是一种盐，电解时染料离子带正电，易与带负电荷的细菌结合，而使细菌着色。
碱性染料有美蓝、甲基紫、结晶紫、龙胆紫、碱性品红、中性红、孔雀绿和蕃红（沙黄）等。
微生物体内各结构与染料结合力不同，故可用各种染料分别染微生物的各结构以便观察。
四、染色方法
1、简单染色法 - 2 - 简单染色法是利用单一染料对细菌进行染色的一种方法。此法操作简便，适用于菌体一般形态的观察。常用的简单染色染料有美蓝、结晶紫、碱性复红、番红（沙黄）等。
2、革兰氏染色法
革兰氏染色反应是细菌分类和鉴定的重要性状。它是1884年由丹麦医师Gram创立的。革兰氏染色法不仅能观察到细菌的形态而且还可将所有细菌区分为两大类：革兰氏阴性细菌（G－）和革兰氏阳性细菌（G+）。细菌对于革兰氏染色的不同反应，是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由肽聚糖形成的网状结构组成，在染色过程中，当用乙醇处理时，由于脱水而引起的网状结构中的孔径变小，通透性降低，使结晶紫和碘的复合物被保留在细胞内而不易脱色，因此呈紫色；革兰氏阴性菌的细胞壁中肽聚糖含量低，而脂类物质含量高，当用乙醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫和碘的复合物易被乙醇抽出而脱色，经复染后呈现红色。
实验一 微生物的简单染色、革兰氏染色和芽胞染色
赵奕玲 121180169
一．实验目的
1．掌握细菌涂片标本的制备方法和普通染色的步骤；
2．掌握革兰氏染色法的步骤和关键点；
3．掌握芽胞染色的步骤要点；
4．识别细菌的革兰氏染色和芽胞染色的结果；
5．学习无菌操作技术。
二．实验原理
一般认为革兰阳性细菌的肽聚糖层较厚，经乙醇处理后使之发生脱水作用而使孔径缩小，结晶紫与碘的复合物保留在细胞内而不被脱色；而革兰阴性细菌的肽聚糖层很薄，脂肪含量高，经乙醇处理后部份细胞壁可能被溶解并改变其组织状态，细胞壁孔径大，不能阻止溶剂透入，因而将结晶紫与碘的复合物洗去而被脱色。
虽然如此，革兰染色的差异并不能完全认为是化学的差别，也有物理结构不同的结果，因为酵母菌细胞壁的成份完全和细菌不同，但具有革兰染色阳性反应。
芽孢是芽孢杆菌属和梭菌属生长到一定阶段形成的一种抗逆性很强的休眠体结构，通常为圆形或椭圆形。
芽孢壁厚、透性低，着色、脱色均较困难。因此，用着色力强的染色剂（如孔雀石绿）在加热条件下进行染色时，染料不仅可以进入菌体，而且也可以进入芽孢，进入菌体的染料可经水洗脱色，而进入芽孢的染色的染料则难以透出，若再用复染液（如沙黄水溶液）染色后，芽孢仍然保留初染剂的颜色，而菌体被染成复染剂的颜色，即菌体和芽孢分别染成红色和绿色易于区分。
三．实验器材
载玻片，盖玻片，接种环，酒精灯，显微镜、擦镜纸、镜油、擦镜液；
结晶紫、革氏碘染液、95%酒精、番红染液；
枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和未知菌的18小时的液体培养液，酵母菌
平板，大肠杆菌平板，牙垢。
四．实验步骤
（一）革兰氏染色
1.涂片
左手持菌液EP管，右手持接种环，在火上对接种环灭菌后，从EP管中取一环培养液，于载玻片中央涂成薄层（事先在背面做好标记圆圈），将接种环在火焰上烧灼灭菌。若是从平板上取材，则事先在载玻片上滴一小滴水，在火焰附近把平板打开一小口，用接种环调取菌落边缘的物质涂于水滴上。
实验二 细菌的革兰氏染色与芽孢染色
一、目的要求
1. 学习微生物涂片、染色的基本技术，学习并初步掌握细菌的革兰氏染色法。
2. 了解革兰氏染色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性。
二、实验材料
1. 菌种：金黄色葡萄球菌（StapHylococcus aureus）大肠杆菌（E.coli）
2. 试剂：草酸铵结晶紫、路哥氏碘液、95%乙醇、番红液
3. 其他：显微镜、载玻片、接种环、酒精灯、无菌水、香柏油、二甲苯等。
三、实验原理
革兰氏染色法是细菌学中最重要的鉴别染色法。是1884年由丹麦病理学家Christain
Gram创立的。通过革兰氏染色可把细菌区分为两大类。
革兰氏染色的基本步骤：先用结晶紫初染、次经碘液媒染、再用95%乙醇脱色、最后用蕃红复染。经过此法染色后，细胞保留初染剂蓝紫色的细菌为革兰氏阳性菌；如果细胞染上复染的红色的细菌为革兰氏阴性菌。大肠杆菌是标准的革兰氏阴性菌，金黄色葡萄球菌是标准的革兰氏阳性菌。
革兰氏染色的机理，与细菌细胞壁的化学组成和结构有关。经结晶紫初染以后，所有的细菌都被染成蓝紫色。碘作为媒染剂，它能与结晶紫结合形成复合物，从而增强了染料与细菌的结合力。当用乙醇脱色时，两类细菌的脱色效果是不同的，革兰氏阳性细菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成、壁厚、类脂含量低，用乙醇脱色处理时细胞壁脱水、使肽聚糖层的网状结构孔径缩小，透性降低，从而使结晶紫-碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内；革兰氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖层在内层且较薄、类脂含量高，所以当脱色处理时，类脂被乙醇溶解、细胞壁透性增加，使结晶紫-碘的复合物被洗脱出来。用蕃红复染时染上红色。
四、操作步骤
基本流程：涂片→干燥→固定→染色（初染→媒染→脱色→复染）→镜检。
1. 制片：取菌种培养物常规涂片、干燥、固定。
常规涂片法 ：
取一洁净的载玻片，用特种笔在载玻片的左右两侧标上菌号，并在两端各滴一小滴蒸馏水，以无菌接种环分别挑取少量菌体涂片，干燥、固定。玻片要洁净无油，否则菌液涂不开。
