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第40卷第3期西南大学学报(自然科学版)2018年3月V o l.40 N o.3J o u r n a l o f S o u t h w e s tU n i v e r s i t y(N a t u r a l S c i e n c eE d i t i o n)M a r. 2018D O I:10.13718/j.c n k i.x d z k.2018.03.001藿芪灌注液质量标准研究①杨洪早1,2,王东升1,苗小楼1,张世栋1,董书伟1,闫宝琪1,桑梦琪1,那立冬1,2,严作廷11.中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所/中国农业部兽用药物创制重点实验室,兰州730050;2.甘肃农业大学动物医学院,兰州730070摘要:目的建立藿芪灌注液质量标准.方法采用薄层色谱法对处方中淫羊藿㊁红花㊁丹参与益母草进行T L C定性鉴别;使用W o n d a S i l C18柱(4.6m mˑ250m m,5μm),流动相ʒ乙腈水(28ʒ72),柱温40ħ,检测波长270n m,进样量10μL,流速1.0m L/m i n测定淫羊藿苷的含量;使用Z O R B A XS B-C18柱(4.6m mˑ150m m,5μm),漂移管温度为90ħ,载气流速为2.5L/m i n,流动相ʒ甲醇水(65ʒ35),柱温40ħ,流速1m L/m i n,用蒸发光散射检测器测定黄芪甲苷的含量.结果T L C鉴别色谱图分离效果好,阴性对照无干扰,专属性强,重复性好;测定淫羊藿苷与黄芪甲苷含量表明,分别在2.336~58.4μg/m L(r=0.9999)和0.0478~0.478m g/m L(r=0.9996)范围内与峰面积成较好的线性关系;其平均加样回收率分别为100.2%,R S D=0.45%和99.26%,R S D=1.46%.结论所建立的特征图谱专属性强㊁准确可行㊁简便㊁可快速用于定性鉴别㊁定量检测,可有效地用于该制剂的质量控制方法.关键词:藿芪灌注液;薄层色谱法;高效液相色谱法;红花;丹参;益母草;淫羊藿苷;黄芪甲苷中图分类号:S853.7文献标志码:A文章编号:16739868(2018)03000109藿芪灌注液是由淫羊藿㊁丹参㊁益母草等中药组成的子宫灌注剂,其功能为催情助孕㊁益气壮阳㊁补血养阴,在临床中运用于奶牛持久性黄体不孕症和卵巢静止[1].已有研究表明,该制剂工艺稳定可行[2],无刺激性[3],能增强动物发情调节作用,提高雌孕激素受体基因的表达量和雌性小鼠机体雌激素水平[4].为了控制本品的质量,便于药效学研究,本课题组采用薄层色谱法(T L C)对藿芪灌注液中的淫羊藿㊁丹参㊁红花和益母草等进行了鉴别,用高效液相色谱法(H P L C)对本品中主要成分淫羊藿苷和黄芪甲苷进行了含量测定.1仪器与试剂1.1仪器岛津L C-20A D H P L C,S P D-20A紫外检测器:L a b S o l u t i o n s工作站,W o n d a S i lC18柱(4.6mmˑ250mm,5μm)ʌ岛津(中国)有限公司ɔ;A g i l e n t1260H P L C,A l l t e c hE L S D2000E S检测器:C h e m S t a t i o n 工作站和C S C h r o m P l u s工作站,Z O R B A XS B-C18柱(4.6mmˑ150mm,5μm)(安捷伦科技有限公司).1.2试剂淫羊藿苷㊁黄芪甲苷(均购自中国药品生物制品检定所,供含量测定用,批号分别为110737-200415,①收稿日期:20170602基金项目:中国农业科学院科技创新工程项目(C A A S A S T I P2014L I H P S03); 十二五 国家科技支撑计划重点课题(2012B A D12B03).作者简介:杨洪早(1992),男,云南临沧人,硕士研究生,主要从事中兽药研究.通信作者:严作廷,博士,研究员,博士研究生导师.110781-200613);藿芪灌注液(中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所研制,批号20120801,20120802, 20120803,20120804,20120805,20120901,20120902,20120903,20120904,20120905);乙腈㊁甲醇均为色谱纯(购自天津市四友精细化学品有限公司);正丁醇㊁乙酸乙酯㊁丁酮㊁甲酸㊁乙醚㊁盐酸㊁硫氰酸铬铵和丙酮等试剂均为分析纯,水为超纯水.2方法与结果2.1T L C鉴别2.1.1淫羊藿量取本品10m L,蒸干;残渣加70%乙醇30m L,用1h进行超声,过滤,滤液蒸干;用30m L水溶解残渣,振摇萃取3次(水饱和的正丁醇溶液作为溶剂),每次20m L,合并正丁醇萃取液;洗涤3次(1%氢氧化钠溶液),每次20m L,弃去洗液;再洗涤2次(正丁醇饱和的水溶液),每次15m L,蒸干正丁醇洗涤液,用甲醇1m L使残渣溶解,作为供试液;另取淫羊藿对照药材1g,加30m L70%乙醇,用1h进行超声,过滤,同样方法制成对照药材溶液;再取对照品淫羊藿苷,加甲醇制成0.3m g/m L的溶液,作为对照品溶液.按照0502薄层色谱法试验,吸取上述3种溶液各2μL,分别点于同一硅胶G薄层板上,展开剂为乙酸乙酯丁酮甲酸水(10ʒ1ʒ1ʒ1),展开,取出,晾干,喷显色剂(5%三氯化铝乙醇溶液),加热3分钟(105ħ),置紫外光灯(365n m)下检视.供试品㊁对照药材和对照品色谱在相应的位置上,具有同种颜色的荧光斑点(图1).2.1.2丹参量取本品20m L,振摇提取1次(20m L水饱和的正丁醇溶液作为溶剂),有机层弃去,用稀盐酸调水层p H值至2.0;水层振摇提取2次(乙醚溶液),每次20m L,合并有机层,挥干;用2m L甲醇使残渣溶解,作为供试液.取对照药材丹参1g,加水20m L并加热回流1h,滤过,滤液加水至20m L,用同样方法制成对照液.按照0502薄层色谱法试验,吸取供试液1μL㊁对照液2μL,分别点于同一硅胶G薄层板上,展开剂为甲苯三氯甲烷乙酸乙酯甲醇甲酸(2ʒ3ʒ4ʒ0.5ʒ2),展开,取出,晾干,喷显色剂(含5%香草醛的10%硫酸乙醇溶液),105ħ加热显色至斑点清晰.供试品与对照药材色谱在相应的位置上,显同种颜色的斑点(图2).1.阴性对照溶液;2.淫羊藿药材溶液;3.供试品溶液;4.对照品溶液.图1淫羊藿T L C色谱图1.供试液;2.丹参药材溶液;3.对照液.图2丹参T L C色谱图2.1.3红花量取本品20m L,振摇提取3次(水饱和正丁醇溶液作为溶剂),每次20m L,合并正丁醇液,蒸干;加甲醇5m L使残渣溶解,将溶解液加入中性氧化铝柱(100~200目,4g,内径1.5c m),用20m L甲醇进行洗脱,收集洗脱液,蒸干;加甲醇4m L使残渣溶解,作为供试液.取不含红花药材的本品阴性对照2西南大学学报(自然科学版)h t t p://x b b j b.s w u.e d u.c n第40卷液,按供试液同样方法制得阴性对照品溶液.另取对照药材红花1g ,加水200m L ,加热回流1h,过滤,滤液浓缩至20m L ,同样方法制成对照液.按照0502薄层色谱法试验,吸取供试液5μL ,对照液10μL ,分别点于同一硅胶G 薄层板上,展开剂为环己烷乙酸乙酯(5ʒ3),展开,取出,晾干,喷显色剂(含5%香草醛的10%硫酸乙醇溶液),105ħ加热至斑点显色清晰.供试品与对照药材色谱在相应的位置上,显同种颜色的斑点(图3).2.1.4 益母草量取本品10m L ,加浓盐酸调p H 值至2.0,离心除去沉淀,少量水洗涤沉淀,洗液合并入上清液;上清液中加入新鲜配制的2%硫氰酸铬铵溶液10m L ,冰浴中放置l h 后离心10m i n ,弃去上清液,沉淀用少量冰水洗涤后,加入2m L 丙酮溶解;丙酮液中滴加0.5%硫酸银溶液6m L ,离心10m i n ,倾出上清液,沉淀用少量丙酮洗涤;合并洗液与上清液并浓缩至约lm L ,滴加1%氯化钡溶液2m L ,离心10m i n ,倾出上清液,沉淀用50%乙醇洗涤;合并上清液与洗液并蒸干,残渣加甲醇2m L 溶解,作为供试液.另取盐酸水苏碱对照品,加无水乙醇制成1m L /m g 的溶液,作为对照液.取不含益母草药材的本品阴性对照液,按供试液同样制得阴性对照品溶液.按照0502薄层色谱法试验,吸取上述3种溶液各5μL ,分别点于同一硅胶G 薄层板上,展开剂为丙酮无水乙醇盐酸(10ʒ6ʒ1),展开,取出,晾干,105ħ加热15m i n ,放冷,喷显色剂(稀碘化铋钾试液三氯化铁试液(10ʒ1))至斑点显色清晰.供试品与对照药材色谱在相应的位置上,显同种颜色的斑点(图4).1.供试液;2.红花药材溶液;3.对照液;4.阴性对照液.图3 红花T L C色谱图1㊁2㊁3.三批供试液;4.对照液;5.阴性对照液.图4 益母草T L C 色谱图2.2 含量测定2.2.1 淫羊藿苷(1)色谱条件色谱柱:W o n d a S i l C 18柱(4.6m mˑ250m m ,5μm ),流动相ʒ乙腈水(28ʒ72),流速:1.0m L /m i n ,检测波长:270n m ,柱温:40ħ,进样量:10μL ,以淫羊藿苷计理论塔板数不低于1500.(2)样品溶液的制备对照品溶液:精密称取对照品淫羊藿苷11.68m g ,置50m L 容量瓶中,用色谱甲醇定容至刻度,摇匀,制得233.6μg /m L 的对照品储备溶液.精密移取储备液5m L 于10m L 容量瓶中,用甲醇定容至刻度,制得116.8μg /m L 的对照液①,吸取对照液①1m L 于10m L 容量瓶中,用甲醇定容至刻度,得质量浓度为11.68μg /m L 的对照液②.供试品溶液:精密量取本品1m L 于25m L 容量瓶中,加水定容至刻度,摇匀,滤过,取续滤液,即得供试液.阴性对照溶液:取按处方比例并以相同工艺制备的缺淫羊藿药材的阴性对照供试品,按供试品溶液制备法制得阴性对照溶液.3第3期 杨洪早,等:藿芪灌注液质量标准研究(3)专属性试验取2.2.1(2)项下对照品㊁供试品和阴性对照溶液,过0.22μ有机微孔滤头于1m L进样瓶中,密封,按照H P L C测定法并按2.2.1(1)项色谱条件自动进样测定,每个样品进样2次,记录色谱图.在与淫羊藿苷对照品溶液色谱峰对应的位置上,供试品与其对照品保留时间一致,且与其他组分分离度大于1.5;阴性对照溶液在对照品与供试液相应的保留时间内未检出色谱峰,表明样品中其他成分不干扰淫羊藿苷的测定.(4)线性关系考察吸取对照液①1m L分别于50m L,25m L,10m L,5m L,2m L容量瓶中,用甲醇稀释至刻度,制成质量浓度分别为2.336μg/m L,4.672μg/m L,11.68μg/m L,23.36μg/m L,58.4μg/m L的对照品溶液.按上述色谱条件,对照品溶液依次进样10μL,记录峰面积.纵坐标为峰面积,横坐标为对照品质量浓度,绘制标准曲线,得y=23054.98x+1386.77,r=0.9999,表明淫羊藿苷对照品在2.336~58.4μg/m L范围内与峰面积积分值呈良好的线性关系.(5)定量限与检测限确定精取对照品溶液,用甲醇逐级稀释定容,按上述色谱条件进样10μL,记录色谱图.信噪比为10ʒ1时测得淫羊藿苷定量限为2.026n g/m L,信噪比为3ʒ1时测得检测限为0.5065n g/m L.(6)重复性试验按2.2.1(2)项下供试品液制备法制备同一批次(批号:20120802)的供试品溶液6份,按上述色谱条件进样,记录峰面积并计算含量㊁R S D值.得淫羊藿苷的含量均值为0.232m g/m L,R S D=0.521%,表明本方法重复性良好.(7)精密度试验(a)日内精密度试验取对照液②,按上述色谱条件重复进样6次,得淫羊藿苷平均峰面积为277594,R S D=0.287%,结果表明日内精密度良好.(b)日间精密度试验取对照液②10μL,按上述色谱条件连续3d进样,每天重复进样2次.得淫羊藿苷平均峰面积为275099,R S D=0.777%,结果表明日间精密度良好.(8)稳定性试验精密量取供试液,在室温放置0,1,2,3,6,9,12h后分次按上述色谱条件测定淫羊藿苷含量,计算R S D.计算结果7次进样的淫羊藿苷含量平均值为0.236m g/m L,R S D=0.969%(n=7),表明供试液中淫羊藿苷的含量在12h内保持稳定.(9)加样回收率试验精密吸取同批次(批号:20120802)6份已知含量的藿芪灌注液样品1.0m L,各精密加入0.2806m g/m L 淫羊藿苷对照品溶液1.0m L于25m L容量瓶中,加水稀释至刻度,摇匀,滤过,取续滤液,即得加样回收供试液.按上述色谱条件测定淫羊藿苷含量并计算回收率和R S D.其平均回收率为100.2%,R S D=0.45%,表明回收率良好(表1).表1淫羊藿苷加样回收率试验结果序号供试品量/m g对照品加入量/m g实测值/m g回收率/%平均回收率/%R S D/%10.23840.28060.5198100.3100.20.4520.23840.28060.5196100.230.23840.28060.5201100.440.23840.28060.5190100.050.23840.28060.5216100.960.23840.28060.517799.54注:m=cˑv;其中m为对照品加入量(m g);c为对照品储备液质量浓度;v为加入体积(m L).下同.4西南大学学报(自然科学版)h t t p://x b b j b.s w u.e d u.c n第40卷(10)样品含量测定分别取10批藿芪灌注液(批号20120801,20120802,20120803,20120804,20120805,20120901,20120902,20120903,20120904,20120905),按2.2.1(2)项供试液法每批次各平行制备2份供试液,按色谱条件自动进样测定,记录色谱图和峰面积,并计算淫羊藿苷含量和R S D 值.得淫羊藿苷的的平均含量为0.242m g /m L ,R S D =7.49%.考虑到大规模生产中的各种损失和测量误差,取其平均值的80%作为其含量限度,即得0.1936m g /m L ,故暂定本品含淫羊藿按淫羊藿苷计不少于0.20m g /m L .2.2.2 黄芪甲苷(1)色谱条件色谱柱:Z O R B A XS B -C 18柱(4.6m mˑ150m m ,5μm ),漂移管温度为90ħ,载气流速为2.5L /m i n ,流动相ʒ甲醇水(65ʒ35),流速:1m L /m i n ,柱温:40ħ,检测用蒸发光散射检测器.理论板数按黄芪甲苷峰计算应不低于3000.(2)样品溶液的制备对照品溶液:精密称取对照品黄芪甲苷11.95m g 于10m L 容量瓶中,加甲醇溶解并定容至刻度,摇匀,制得1.195m g /m L 的对照品储备液,精密量取对照品储备液1m L 于5m L 容量瓶中,加甲醇定容至刻度,摇匀,制成质量浓度为0.239m g/m L 的对照液.供试品溶液:精密量取本品25m L ,振摇提取4次(水饱和的正丁醇溶液作为溶剂),每次40m L ,弃去水层,合并正丁醇提取液;洗涤2次(氨试液),每次25m L ,弃去氨液,取正丁醇液,挥干溶剂,用甲醇使残渣溶解并移至5m L 容量瓶中,加甲醇定容至刻度,摇匀,滤过,取续滤液,即得.阴性对照溶液:取按处方比例并以相同工艺制备的缺黄芪的阴性对照供试品,按供试品溶液制备法制得阴性对照液.(3)专属性试验取2.2.2(2)项下对照品㊁供试品和阴性对照溶液,过0.22μ有机微孔滤头于1m L 进样瓶中,密封,按照H P L C 测定法并按2.2.2(1)项色谱条件自动进样测定,每个样品进样2次,记录色谱图.在与黄芪甲苷对照品溶液色谱峰对应的位置上,供试品与其对照品保留时间一致,且与其他组分分离度大于1.5;阴性对照溶液在对照品与供试液相应的保留时间内未检出色谱峰,表明样品中其他成分不干扰黄芪甲苷的测定.(4)线性关系考察精密量取对照品储备溶液1m L ,1m L ,1m L ,2m L ,分别于25m L ,10m L ,5m L ,5m L 容量瓶中加甲醇稀释至刻度,摇匀,滤过,制成质量浓度分别为0.0478m g /m L ,0.1195m g /m L ,0.239m g/m L ,0.478m g /m L 的对照品溶液.按上述色谱条件,对照品溶液依次进样10μL ,测定峰面积.纵坐标用峰面积表示,横坐标用对照品质量浓度表示,绘制标准曲线.得y =1.470039x +2.340902,r =0.9996,结果样品质量浓度在0.0478~0.478m g/m L 范围内,峰面积线性关系良好.(5)定量限与检测限确定精取对照品溶液,用甲醇逐级稀释,按上述色谱条件进样10μL ,记录色图谱.信噪比为10ʒ1时测得黄芪甲苷定量限为442n g /m L ,信噪比为3ʒ1时测得检测限为119.5n g /m L .(6)重复性试验按2.2.2(2)项下供试品溶液制备法制备6份同批次样品(批号:20120802),按上述色谱条件进样,记录峰面积,并计算含量与R S D 值.测定得黄芪甲苷平均含量为84.31μg /m L ,R S D =1.97%,表明该方法重复性良好.(7)精密度试验(a )日内精密度试验取对照液,按上述色谱条件重复进样6次.结果供试液峰面积均值为516892.3,R S D =0.638%(n =6),表明仪器日内精密度良好.(b)日间精密度试验5第3期 杨洪早,等:藿芪灌注液质量标准研究取黄芪甲苷对照液和供试液,按上述色谱条件连续3d进样,每天重复进样2次,记录峰面积并计算R S D.计算结果峰面积均值分别为512752.3,547107.5,R S D分别为1.18%和1.80%(n=6),表明仪器精密度良好.(8)稳定性试验按2.2.2项下制备一份供试液(批号:20120802),将供试液分别于室温放置0,1,2,3,5,8h,精密吸取供试品溶液按上述色谱条件进样,测定黄芪甲苷含量并计算R S D.结果6次进样的黄芪甲苷含量平均为56.52μg/m L,R S D=0.926%(n=6),试验表明供试品溶液中黄芪甲苷的含量在8h内保持稳定.(9)加样回收率试验加样回收对照品液的制备:精密称定黄芪甲苷对照品18.38m g于10m L容量瓶中,加甲醇定容至刻度,制成1.838m g/m L黄芪甲苷对照品储备液.精密量取藿芪灌注液25m L,1.838m g/m L黄芪甲苷对照品储备液1m L,混匀,按2.2.2项供试液制备法制备同批次6份(批号:20120802)供试液.按上述色谱条件进样,测定黄芪甲苷含量并计算回收率和R S D.黄芪甲苷平均回收率为99.26%,R S D=1.46%,表明其回收率良好(表2).表2黄芪甲苷加样回收率试验结果序号供试品量/μg对照品加入量/μg实测值/μg回收率/%平均回收率/%R S D/%12099.7518383925.42799.3399.261.4622099.7518383927.83799.4632099.7518383883.95497.0742099.7518383917.87898.9252099.7518383962.757101.462099.7518383922.40099.16注:m1=c1ˑv1;其中m1为供试品量,c1为供试溶液质量浓度(μg/m L),v1为供试品取样量(m L).(10)样品含量测定分别取10批藿芪灌注液样品(批号20120801,20120802,20120803,20120804,20120805,20120901, 20120902,20120903,20120904,20120905),按2.2.2(2)项下供试品溶液的制备方法制备样品,按以上色谱条件测定含量.结果10批样品中黄芪甲苷的的平均含量为64.653μg/m L,R S D=8.68%.考虑到大规模生产中的各种损失,取其平均值的80%作为其含量限度,即得45.55μg/m L,故暂定本品黄芪按黄芪甲苷计不少于45.0μg/m L.3讨论3.1待测含量组分选择淫羊藿和黄芪被广泛应用于多种制剂之中,在本制剂中也是作为君药发挥其药效药理作用.淫羊藿苷与黄芪甲苷分别为淫羊藿和黄芪的主要成分[5],都发挥主要药理活性作用,同时中国药典对其含量标准也有规定,故对其进行方法学研究,对完善本品的质量标准具有十分重要的作用,也进一步控制了本品的内在质量,对临床药效的发挥具有更重要的意义.3.2色谱条件选择淫羊藿与黄芪作为传统中医保健用药,定量检测方法已比较成熟,众多报道采用H P L C对淫羊藿苷和黄芪甲苷的检测方法基本一致[6-10],但在此试验上,本课题组用新方法进行研究并得到了良好的结果.本品参考中国兽药典淫羊藿苷含量测定方法进行研究,考察了柱温㊁流速㊁流动相比例及波长的选择.改变柱温,供试品溶液中淫羊藿苷含量的R S D为8.18%,说明柱温对淫羊藿苷含量测定有一定的影响;在柱温40ħ条件下,改变流速,供试品溶液中淫羊藿苷含量的R S D为1.04%,说明在柱温40ħ条件下,改变流速对样品中淫羊藿苷的测定无影响.因此,试验证明以流动相乙腈水(28ʒ72)㊁检测波长270n m㊁柱温40ħ㊁流速1.0m L/m i n的色谱条件对淫羊藿苷的测定具有较强的专属性,能达到基线平衡㊁分离度较高㊁具有对称的峰形㊁阴性对照无干扰且缩短了分析时间,便于作为指纹图谱鉴别[11].6西南大学学报(自然科学版)h t t p://x b b j b.s w u.e d u.c n第40卷黄芪甲苷作为黄芪的主要成分之一,仅在200n m 左右有弱的紫外末端吸收,因而用紫外检测器(VWD )操作比较困难,且噪音对结果影响较大,灵敏度也较低,故H P L C -VWD 法一直未能广泛用于黄芪甲苷的测定[12-13].蒸发光散射检测(E L S D )由被分析物质颗粒的数量和大小决定光散射检测器的响应大小,而不受流动相溶剂的干扰,此种检测器可用于非挥发性成分的检测[14].本研究采用H P L C -E L S D 法对黄芪甲苷进行含量测定,考察了流动相比例㊁流速及温度的变化,两个供试液中黄芪甲苷含量的R S D 分别为1.77%,1.40%,说明测定条件小范围变动,对样品中黄芪甲苷含量的测定无影响.综合考虑,最终确定色谱条件为漂移管温度90ħ,载气流速2.5L /m i n ,柱温:40ħ,流动相:甲醇水(65ʒ35),流速:1m L /m i n ,其所测得结果灵敏度高㊁分离度良好㊁重现性好,是一种良好的黄芪甲苷测定方法[15-16].3.3 优化供试液前处理法中药化学成分复杂多样,加之本制剂是由多种中药混煎而得,因此供试液前处理是目前中药制剂主要组分含量测定必不可缺的步骤.从本试验研究可以看出,供试液的前处理可能显著影响其成分含量测定的结果及薄层色谱的鉴别.因此,在研究中药制剂质量标准时,不仅要考虑待测指标的含量,还应考察前处理方法对测定结果的影响[17-18].含淫羊藿制剂的前处理方法一般使用超声㊁回流及溶剂直接定容[19].由于本制剂为液体剂型,不存在被检成分能否完全溶出的问题,因此在供试液制备时首选操作简便的直接溶剂稀释法,使用了甲醇㊁乙腈及超纯水定容稀释[20].研究表明,取1m L 样品进行适当稀释后,在线性范围内可对该制剂中的淫羊藿苷进行准确检测,且用超纯水与甲醇㊁乙腈相比较,其淫羊藿苷含量无明显差距.故建立淫羊藿苷的含量测定方法,可直接用超纯水定容,其方法具有高效省时㊁成本低廉㊁结果准确㊁重现性好的优点.在T L C 鉴别时同样采用了原液点板的方法,但置紫外灯下检查干扰性大,均无结果,故采取了有机溶剂萃取法,且在喷显色剂后再置紫外灯下观察,其结果均无干扰,重复性好,图谱分离度高.黄芪有效成分的提取多采用高速离心㊁超声波微波㊁超临界C O 2萃取㊁高速逆流等技术[21],但在H P L C 法中测定黄芪甲苷含量时,使用这些方法使其提取的成分太多,干扰性太大,故选取萃取的方法处理[22].使用多种萃取剂后,最后选择了水饱和的正丁醇,较其他萃取剂相比其出峰效果良好,含量稳定.在其他相同条件下进行了提取次数的优选,分别振摇提取3,4,5次,试验表明用供试品提取3次与4次㊁5次有较大差异,而4次㊁5次时黄芪甲苷含量无明显差异,故选择用水饱和的正丁醇溶液振摇提取4次.所用氨试液,主要为了除去制剂中的极性成分,减少杂质干扰,进而增加系统分离能力[23].将提取液蒸干再用甲醇溶解进样,对系统E L S D 分解度较好,能更好地分离黄芪甲苷,所得到的黄芪甲苷含量也更加可观,故使用该方法能够有效控制本制剂中黄芪甲苷的含量,对制定其质量标准提供了一定的指导作用[24].作为复方中药制剂的鉴别,应根据其药材化学成分,寻找简便快速并具有专属性较强的方法,才能起到有效控制质量的目的[25].鉴别本品处方中丹参时,经过与之前研究比较得出样品与药材采用正丁醇除杂,乙醚提取后,斑点更为明显,更适合丹参有效成分的提取,但斑点分散,故进行展开剂比例调整,其后发现供试品色谱中与药材色谱相对应的斑点会随着展开剂的变化同步移动,药材色谱中比供试品色谱上方多一个斑点,疑似在样品的制备过程中采用了醇沉和灭菌工艺致使有效成分被破坏,故改用样品的制备工艺处理丹参药材,以确定供试品溶液与药材溶液斑点是否为同一成分,并比较硅胶G F 254薄层板与硅胶G 薄层板展开效果.结果表明醇沉㊁灭菌对丹参药材成分影响较大,供试品色谱中只能与药材色谱有一个相应斑点对应,原因是经醇沉㊁灭菌后所致,故最终选定与药材色谱下方斑点相对应即可达到鉴别效果.鉴别本品处方中红花时,比较不同提取方法制备的药材溶液,结果表明药材溶液需通过中性氧化铝柱或D 101型大孔吸附树脂柱方可出现粉红色斑点[26],但中性氧化铝柱的操作方法比大孔树脂柱简单㊁省时,显色效果也更清晰,故选择中性氧化铝柱方法为本试验最终方法.鉴别本品处方中益母草时,参考中国药典㊁中国兽药典方法处理供试液,且尝试用了732型强酸性阳离子交换树脂柱[27-28],其供试品溶液㊁对照药材溶液在与对照品溶液相同位置上出现相应斑点,但是背景7第3期 杨洪早,等:藿芪灌注液质量标准研究8西南大学学报(自然科学版)h t t p://x b b j b.s w u.e d u.c n第40卷有点干扰,其色谱图分离度不高,有拖尾现象,经查阅文献及多次试验筛选最终确定将其药液调整p H值后用硫氰酸铬铵试液进行处理,再用丙酮㊁硫酸银及氯化钡溶液依次进行洗涤溶解等,其显色效果更加清晰,分离度高,阴性对照无干扰[29-30].4结论通过以上方法研究的验证结果表明:所建立的特征图谱专属性强㊁准确可行㊁简便,可快速用于定性鉴别及定量检测,可广泛用于该制剂的质量控制方法之中.参考文献:[1]李世宏,严作廷,王东升,等.纯中药催情助孕液治疗奶牛卵巢性不孕症试验[J].中兽医医药杂志,2010,25(6):52-53.[2]王东升,张世栋,李世宏,等.正交试验法优化催情助孕液制备工艺[J].中国农学通报,2012,28(29):75-78.[3]王东升,张世栋,苗小楼,等.藿芪灌注液局部刺激性试验[J].江苏农业科学,2016,44(4):303-305.[4]张世栋,王旭荣,杨峰,等.催情助孕液对小鼠雌㊁孕激素水平及其受体m R N A表达的影响[J].中国兽医学报,2013,33(7):1127-1131.[5]国家药典委员会.中国药典2015版一部[M].北京:中国医药科技出版社,2015.[6] HA N S,X I E Y Y,WA N G Y M,e t a l.C o m p a r a t i v eS t u d y o nC h e m i c a lQ u a l i t y o fM a i nS p e c i e so fE p i m e d i u m[J].Y a o X u eX u e B a o,2012,47(4):502-507.[7]俞吉,朱瑞,董妍君,等.骨疏灵颗粒不同配伍对淫羊藿苷含量的影响[J].中国药房,2016,27(1):79-81.[8]张军,林传俊.淫羊藿苷的高效液相色谱检测方法探讨[J].时珍国医国药,2011,22(12):3027-3028.[9] D I N GFF,D E N G Y R,Z HA N G XJ,e t a l.S i m u l t a n e o u sD e t e r m i n a t i o no fF i v eA s t r a g a l o s i d e s i nA s t r a g a l iR a d i xa n dJ i n q i J i a n g t a n g T a b l e t b y H P L C-E L S D[J].J 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RP-HPLC法测定蜀葵花中槲皮素含量
宋秋烨
【期刊名称】《现代中药研究与实践》
【年(卷),期】2013(027)006
【摘要】目的建立RP-HPLC法测定蜀葵花中槲皮素含量的方法.方法采用Cosmosil C18色谱柱(5 μm,250×4.6mm);以乙腈-0.4％磷酸水(32:68)为流动相;流速为1.0 mL·min-1;检测波长为360 nm;柱温:30℃.结果槲皮素在2.6 ～ 41.6 μg·mL-1浓度范围内线性关系良好(r=0.9996),平均加样回收率(n=9)为
98.5％,RSD为2.6％.结论所建立的方法准确、快速,操作简便,可用于蜀葵花的质量控制.
【总页数】3页(P22-24)
【作者】宋秋烨
【作者单位】张家港市第一人民医院,江苏张家港215600
【正文语种】中文
【中图分类】R927.2
【相关文献】
1.HPLC法测定不同产地黄蜀葵花药材中槲皮素的含量 [J], 高雷;张平;程钢
2.HPLC法测定不同产地黄蜀葵花中金丝桃苷异槲皮苷及槲皮素-3'-葡萄糖苷含量[J], 杨志芳;王维娜;杨坤;王先荣;杨新波;黄正明
3.RP-HPLC法同时测定鸡冠花中槲皮素、木犀草素和山柰酚的含量 [J], 王锦军;张秀梅;黄兆文
4.薄层扫描法测定黄蜀葵花及其制剂中槲皮素的含量 [J], 徐柏颐
5.高效液相色谱法测定维药蜀葵花中芦丁和紫云英苷含量 [J], 勉强辉;郑大成;孙莲因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
小金胶囊中麝香酮含量测定方法研究作者：万佳丽明凯利向阳林凤杰王丫头熊莉周翔余敏黄志军来源：《世界中医药》2020年第04期摘要目的：建立準确可靠的小金胶囊中麝香酮含量测定方法。
方法：采用（5%-苯基）-甲基聚硅氧烷为固定相的色谱柱（30 m×0.32 mm×1.8 μm），FID检测器温度为300 ℃，载气为氮气，流速为1.5 mL/min，未分流，柱温为程序升温，进样量为1 μL。
以正十八烷为内标物，采用内标法以峰面积比进行检验计算。
结果：阴性对照品溶液在与内标溶液、对照品溶液和供试品溶液色谱图相同时间处未见相同色谱峰，麝香酮在进样量为0.120 1～1.200 6 ng的范围内线性关系良好（R2=0.999 7），精密度、稳定性、重复性试验的RSD均<3%，平均回收率为99.93%，RSD为1.30%（ n =6）。
结论：该方法操作简便，与本品现行药典方法相比，检测结果更准确重复性更好，检测时间大大缩短，可用于小金胶囊中麝香酮的含量测定。
关键词小金胶囊;麝香酮;含量测定;气相色谱法;内标法Study on Determination Method of Musk Ketone Content in Xiaojin CapsulesWAN Jiali1，MING Kaili2，XIANG Yang2，LIN Fengjie1，WANG Yatou2，XIONG Li2，ZHOU Xiang2，YU Min2，HUANG Zhijun1，2（1 Wuhan University of Technology，Wuhan 430070，China; 2 Jianmin Pharmaceutical Group Co.，Ltd.，Wuhan 430052，China）Abstract Objective： To establish an accurate and reliable method for determination of musk ketone in Xiaojin Capsules. Methods：（5%-phenyl）-methylpolysilicone was used as the stationary phase column（30 m × 0.32 mm × 1.8 μm）.FID detector temperature was 300 ℃.Carrier gas was nitrogen.The flow rate was 1.5 mL/min，with no shunt.Column temperature was programmed temperature.And injection volume was 1 μL.N-octadecane was used as internal standard，and internal standard method was used to perform test and calculation according to the peak area ratio. Results：The same chromatographic peak was not seen at the same time in chromatograms of negative reference solution，internal standard solution，reference solution and test solution.Musk ketone had a good linear relationship in the range of 0.1201～1.2006 ng injection volume（R2 = 0.999 7）.RSD for precision，stability，and repeatability tests was < 3%.The average recovery was 99.93% and the RSD was 1.30%（n = 6）. Conclusion： The method is simple and convenient to pared with the current pharmacopoeia method for the product，its detection result is more accurate and repeatable，with detection time greatly shortened，and it can be used for determining the content of musk ketone in Xiaojin Capsules.Keywords Xiaojin Capsules; Musk ketone; Content determination; Gas chromatography; Internal standard method中图分类号：R284 文献标识码：A doi： 10.3969/j.issn.1673-7202.2020.04.011小金胶囊主要由人工麝香、木鳖子、制草乌、枫香脂、乳香、没药、当归、五灵脂、地龙、香墨等10味中药材组成，其处方来源于中医经典名方“小金丹”[1-2]，具有散结消肿，化瘀止痛的功效，用于阴疽初起，皮色不变，肿硬作痛，多发性脓肿，瘿瘤，瘰疬，乳岩，乳癖[3]。
中国合格评定国家认可委员会认 可 证 书 附 件（注册号：CNAS L1484）名称: 司法部司法鉴定科学技术研究所 地址：上海市光复西路1347号签发日期：2009年08月21日 有效期至：2012年08月20日 更新日期：2011年01月25日附件1 认可的检测能力范围CHINA NA TIONAL ACCREDITA TION SERVICE FOR CONFORMITY ASSESSMENTAPPENDIX OF ACCREDITA TION CERTIFICA TE(Registration No. CNAS L1484)NAME: Institute of Forensic Science, Ministry of Justice, PRC RESS ：No.1347, Guangfu West Road, Shanghai, ChinaDate of Issue: 2009-08-21 Date of Expiry: 2012-08-20 Date of Update ：2011-01-25中国合格评定国家认可委员会认 可 证 书 附 件（注册号：CNAS L1484）名称: 司法部司法鉴定科学技术研究所 地址：上海市光复西路1347号签发日期：2009年08月21日 有效期至：2012年08月20日 更新日期：2011年05月20日附件3 认可的授权签字人及领域CHINA NA TIONAL ACCREDITA TION SERVICE FOR CONFORMITY ASSESSMENTAPPENDIX OF ACCREDITA TION CERTIFICA TE(Registration No. CNAS L1484)NAME: Institute of Forensic Science, Ministry of Justice, PRC RESS ：No.1347, Guangfu West Road, Shanghai, ChinaDate of Issue: 2009-08-21 Date of Expiry: 2012-08-20 Date of Update ：2011-05-20。
食品中那非类物质的测定（BJS 201805）1 范围本标准规定了食品（含保健食品）基质中90种那非类物质的超高效液相色谱-串联质谱测定方法。
标准中方法一超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱法，适用于饮料、果冻、蛋白粉、牡蛎粉、饼干、糖果、酒类及咖啡等食品（含与上述基质相同的保健食品及片剂、胶囊、软胶囊等剂型）中90种那非类物质的定性和定量测定。
标准中方法二超高效液相色谱-串联高分辨质谱法，适用于饮料、果冻、蛋白粉、牡蛎粉、饼干、糖果、酒类及咖啡等食品（含与上述基质相同的保健食品及片剂、胶囊、软胶囊等剂型）中90种那非类物质的筛查和定性确证。
方法一超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱法2原理试样经甲醇超声提取，过滤后，滤液供超高效液相色谱—三重四极杆串联质谱仪测定，外标法定量。
3试剂和材料注：水为GB/T 6682规定的一级水。
3.1 试剂3.1.1 甲醇（CH3OH）：质谱级。
3.1.2 甲酸（HCOOH）：质谱级。
3.1.3 乙酸乙酯（C4H8O2）：分析纯。
3.1.4 盐酸（HCl）：分析纯。
3.2 试剂配制3.2.1 0.1%甲酸水溶液：取甲酸1mL用水稀释至1000mL，用滤膜（4.3）过滤后备用。
3.2.2 盐酸甲醇溶液（1+99）：取盐酸1mL用甲醇稀释至100mL。
3.2.3 甲醇水溶液（1+1）：将甲醇与水等体积混合。
3.3 标准品西地那非等90种物质标准品的中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、相对分子量见附录A表A.1，纯度≥98%。
3.4 标准溶液配制3.4.1标准储备液（200 μg/mL）：分别精密称取Lodenafil carbonate（46罗地那非碳酸酯）、Sildenafil—1—dimer impurity（63西地那非二聚体杂质）、Vardenafil dimer（69伐地那非二聚体）标准品（3.3）各10mg，用盐酸甲醇溶液（1+99）溶解并稀释至50mL，摇匀；分别精密称取其余87种标准品（3.3）各10 mg，用甲醇溶解并稀释至50mL，摇匀，制成浓度为200 μg/mL标准储备液。
高效液相色谱法检测中药制剂中非法添加的抗真菌药物卢奕;张雁;李东【摘要】Objective To establish a HPLC method for the detection of 8 kinds of antifungal chemical drugs probably illegally added into the traditional Chinese medicine preparations.Methods The HPLC method was developed.The separation was performed on the Luna ODS C18column(250 mm ×4.6 mm,5 μm).The mobile phase consisted of methanol-0.2％potassium dihydrogen phosphate aqueous solution with the gradient elution.The flow rate was 1 mL/min.The detection wavelength was 200-400 nm and the column temperature was kept at 35 ℃.Results Under this developed chromatographic conditions,8 kinds of antifungal chemical drugs includingfluconazole,griseofulvin,ketoconazole,clotrimazole,itraconazole,econazole, miconazole nitrate,terbinafine hydrochloride were able to be separated and detected effectively.The average recovery rates were93.92％,90.63％,95.88％,99.34％,97.82％,97.16％,97.91％ and 85.12％,RSD were0.30％,0.21％,0.41％,0.36％,1.39％,0.39％,0.52％,0.19％,respectively.Conclusi on The established method is simple,accurate and better reproducible,and can be used for screening detection of illegally added antifungal chemical drugs in the traditional Chinese medicine preparations and the Chinese patent medicine preparations.%目的建立检测中药制剂中可能非法添加的8种化学抗真菌药物的高效液相色谱法.方法色谱柱为Luna ODS C18柱(250mm×4.6 mm,5μm),流动相为甲醇-0.2％磷酸二氢钾水溶液梯度洗脱,流速为1mL/min,检测波长为200～ 400 nm;柱温为35℃.结果在该色谱条件下,氟康唑、灰黄霉素、酮康唑、克霉唑、伊曲康唑、硝酸益康唑、硝酸咪康唑、盐酸特比萘芬8种抗真菌化学药物可得到有效分离、检测,平均回收率分别为93.92％,90.63％,95.88％,99.34％,97.82％,97.16％,97.91％,85.12％,RSD分别为0.30％,0.21％,0.41％,0.36％,1.39％,0.39％,0.52％,0.19％.结论该方法简便、准确,重现性好,可用于中药制剂及中成药中抗真菌化学药物的筛查.【期刊名称】《中国药业》【年(卷),期】2013(022)013【总页数】3页(P7-9)【关键词】抗真菌药物;非法添加;中药制剂;筛查;高效液相色谱法【作者】卢奕;张雁;李东【作者单位】广东省深圳市孙逸仙心血管医院,广东深圳 518020;广东省深圳市孙逸仙心血管医院,广东深圳 518020;暨南大学第二临床医学院·深圳市人民医院,广东深圳 518020【正文语种】中文【中图分类】R284.1;R286.0;R927.2一些制假者利用中成药所含成分复杂、质量标准不完善、添加西药不易被识别及隐蔽性强的缺点，在中成药生产过程中非法添加化学药品，夸大宣传疗效，高价销售，牟取不义之财，给用药者的身体健康造成了严重危害。
