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·短篇论著·L⁃选择素及其配体足萼糖蛋白在结肠癌发生、发展中的表达和意义刘 斌1 陈杏林1 王哲民1 陈柳勇1 蒋云飞1 李善高2*杭州市临安区第一人民医院消化内科1（311300） 浙江中医药大学附属第一医院消化内科2背景：结肠癌的早期诊治能有效改善患者的预后，简单有效且敏感的筛查指标对及早识别早期癌症及其癌前病变具有重要意义。
L⁃选择素是细胞黏附分子，足萼糖蛋白（PODXL）是其配体，两者在癌症的发生、发展中发挥关键作用。
目的：探讨L⁃选择素及其配体PODXL在结肠癌中的表达和意义。
方法：收集2020年11月—2022年11月杭州市临安区第一人民医院和浙江中医药大学附属第一医院的病理标本120例（增生性息肉、结肠腺瘤、结肠癌各40例），另取正常肠黏膜组织20例作为对照。
采用qRT⁃PCR和免疫组化法分别检测L⁃选择素、PODXL mRNA和蛋白表达。
采用蛋白质印迹法测定L⁃选择素和PODXL蛋白表达，并分析其与结肠癌临床病理参数的关系。
此外，收集60例结肠癌患者血清标本。
以ELISA法检测血清L⁃选择素和PODXL浓度。
结果：结肠腺瘤组L⁃选择素和PODXL mRNA和蛋白表达明显高于正常对照组、增生性息肉组（P<0.05），而结肠癌组又显著高于正常对照组、增生性息肉组和结肠腺瘤组（P<0.05）。
不同病理类型、淋巴结转移、Dukes分期的结肠癌患者中L⁃选择素和PODXL 蛋白表达相比差异有统计学意义（P<0.05）。
结肠癌组织中L⁃选择素表达与PODXL表达具有显著正相关性（r=0.855，P<0.001）。
初发组血清L⁃选择素和PODXL浓度显著低于复发组，未转移组亦显著低于转移组（P<0.05）。
术后3个月血清L⁃选择素和PODXL浓度显著低于术后3 d和术前（P<0.05）。
结论：L⁃选择素和PODXL可能参与了结肠癌发生、发展的病理过程，属于致癌蛋白，可为结肠癌的预防和早期诊治提供参考价值，通过早期筛查病变可在一定程度上改善结肠癌患者的预后。
上皮细胞转化大肠发展当前,大肠癌已是欧洲排名第2位的肿瘤致死性疾病,占肿瘤致死性疾病的10%左右.引起大肠癌发生的原因众多,如基因突变引起的家族性腺瘤性息肉病(familialadenomatouspolyposis,FAP)、DNA错配修复基因(MMR)突变引起的遗传性非息肉性结肠癌(herediarynonpolyposiscol-orectalcancer,HNPCC)、Crohn''''s病、溃疡性结炎、上皮细胞内癌基因激活和抑癌基因失活等均与大肠癌的发生发展密切相关1.上皮细胞间质转化(epithelial-mesenchymaltransition,EMT)是指在生理或病理情况下发生细胞上皮-间质转变,同时伴随细胞形态与相关基因表达的改变.EMT在胚胎形成以及组织器官发育过程中也起着重要作用(如中胚层和神经冠结构形成以及心脏形态发生过程2),但也可引起器官纤维化和参与肿瘤形成过程,在此过程中上皮细胞顶-底极性改变、桥粒等紧密连接结构消失、细胞骨架重组,波形蛋白表达上调、角蛋白表达下调,从而使细胞离体、获得迁移水平,并能抵抗细胞凋亡3.近来研究发现EMT在大肠癌发生发展过程中起着重要作用,并与肿瘤细胞的浸润和转移有着非常密切的关系.1EMT在炎症促动大肠癌发生发展中的作用慢性炎症被认为是包括大肠癌在内的很多种人类肿瘤疾病的原因之一,流行病学和临床研究均证实两种主要的炎症性肠病(inflammatoryboweldisease,IBD)：溃疡性结肠炎和Crohn''''s病4发展成大肠癌的风险明显升高.慢性炎症能够通过诱导细胞DNA修饰导致肠上皮细胞发育不良,此外还可通过DNA甲基化和组蛋白修饰等作用影响肠上皮发育过程5.Bataille等6在Crohn''''s病瘘管形成过程中发现肠道上皮标志物E-cadherin和?-catenin表达降低(?-catenin 在EMT的起始阶段合成增加,而在EMT最终阶段合成明显减少7);间质标志物?-integrin表达增多(TGF-?激活EMT的过程依赖于?-integrin,然后通过Smad3依赖性的转录过程或者非Smad3依赖性、p38MAPK激活和GTP酶调节的信号传导途径8),而该蛋白随着EMT的进展逐渐由胞膜向胞质、胞核转移,?-catenin移位被认为是Crohn''''s病发展过程中EMT的关键分子步骤.在肿瘤相关炎症(cancerrelatedinflammation,CRI)相关分子中发现一些重要的始动因子,包括NF-?B、STAT39、IL-1?、IL-6、IL-10和TNF-?等.NF-?B是一种关键的内源性炎症/免疫调节因子10.Douglas等在大肠癌细胞中发现了异常的NF-?B调节,且证实在结肠肿瘤起始和发展中NF-?B和CRI之间存有密切联系,通过靶向灭活IkappaB使肿瘤浸润白细胞中NF-?B失活抑制了炎症相关大肠癌的发生,从而为结肠肿瘤中NF-?B和炎症细胞的作用提供了基因水平证据.IL-6是NF-?B激活的一个主要效应分子,并且与STAT3存有密切关系,他具有促动生长和抗凋亡水平11.研究发现IL-6能保护正常肠上皮细胞和癌前细胞免受凋亡,并促动肿瘤起始细胞增殖,在此过程中NF-?B-IL-6-STAT3通路起着重要作用.Lee等12发现大肠癌中NF-?B的活化状态需要STAT3维持,提示STAT3是肿瘤细胞增殖和存活的关键因子,并调控了c-Myc、Mcl-1、CyclinD和Bcl-2表达13.抑制因子从不同水平上调控NF-?B信号通路,Tir8是表达于肠黏膜上IL-1R家族的一员,他能够通过阻止IRAK-1和TRAF-6,抑制信号从IL-1R/TLR复合物传导14.在小鼠大肠癌肿瘤模型中发现NF-?B下游分子CCL2、CCL3、IL-1和IL-6能够促动炎症相关的肿瘤形成,并发现NF-?B激活过程中Tir8的缺失直接导致了大肠癌形成15.肿瘤相关巨噬细胞(tumorassociatedmacrophages,TAM)分泌的TNF通过抑制GSK-3?促动了Wnt/?-catenin信号传导,促动了结肠上皮细胞向间质转化,此过程在大肠癌发展中起着重要作用16.此外,炎症细胞中NF-?B激活也造成了COX-2和ROS水平升高,ROS能诱导DNA损伤、DNA甲基化、转录后修饰和肿瘤抑制基因突变等7;控制炎症反应和诱导肿瘤细胞凋亡的TGF-?和低氧诱导因子-1(hypoxia-induciblefac-tor-1,HIF-1)同样是炎症微环境中促使上皮细胞发生间质转化的潜在诱导因子17.Grivennikov等17证实IL-6与其受体sIL-6?结合后停留在细胞表面并能借助胞内TGF-?通路促动结肠上皮向恶性转化;IL-10激活STAT3(信号传导蛋白-转录激活物)后通过与IL-6相似的途径介导细胞恶性转变18.TGF-?作为炎症因子可造成包括肠道在内的多器官自身免疫性疾病,且可激活多种信号通路如Erk、c-Jun、JNK、PI3K和RhoA等19,也能诱导某些转录因子和转录调节因子在EMT 中的表达,包括?EF1、SIP1和Snail等,从而有利于结肠上皮EMT的发生20.TNF-?在IBD发病机制中是一种重要的炎症因子,在炎症相关大肠癌(colitisas-sociatedcolorectalcancer,CAC)中也起着重要作用21,TNF-?在CAC中主要依赖激活胞内转录因子NF-?B实行信号传导,通过NF-?B的多向性转录激活作用(NF-?B能够结合至靶基因MMP-9、IL-8、uPA、VEGF、CXCR4、骨桥蛋白等的启动子或增强子之上实行调控22)诱导结肠上皮细胞向肿瘤细胞分化、增殖,并抑制细胞凋亡、促动肿瘤侵袭和转移23.此外,其他炎症因子如IL-12、IL-13和INF-?等在慢性大肠炎发展过程中也参与了肿瘤形成过程,而TGF-?、IL-10则能在此过程中发挥协同作用24.当前已证实上述参与炎症发生和发展的各种细胞因子如,TGF-?、TNF-?和NF-?B等均是EMT信号通路的关键因子,可见EMT参与了炎症促动大肠癌发生和发展的相关过程,但是EMT在此过程中的详尽机制尚待进一步研究.2EMT在腺瘤性息肉病相关的大肠癌发生发展中的作用FAP在结肠腺瘤性息肉疾病中占有主要地位,相关研究证实位于染色体5q21的APC突变失活是FAP的主要原因25,APC突变被认为启动了大肠癌发生的多步骤过程,最终FAP往往发展成为大肠癌26.与FAP相同的是绝绝大多数散发大肠癌病例起源于结肠腺瘤且同时伴有APC突变.Vécsey-Semjén等27证实小鼠敲除APC外显子exon14后可导致结肠腺瘤发生,免疫组织化学检测该模型结肠上皮细胞中可见Wnt信号通路的关键因子?-catenin在胞质和胞核中积累,且编码C-Myc和CyclinD1的mRNA也显著增加.APC是一种肿瘤抑制基因,能够作为Wnt/?-catenin的负性调控因子,在正常结肠上皮细胞APC/?-catenin复合物被丝氨酸-苏氨酸激酶(GSK3?)磷酸化,导致?-catenin降解,而在APC突变失活及Wnt信号转导通路开启时GSK3?的磷酸化作用被抑制28,使其不能诱发?-catenin降解,从而造成胞质内的?-catenin持续累积,后者作用于靶基因C-Myc和CyclinD1等,最终导致Wnt通路介导的EMT 发生,正常结肠黏膜上皮向间质转化,最终结肠上皮细胞发生恶性转化29,30.Lochter等31利用COGA-8结肠上皮细胞培养发现CyclinD1与CDK4、CDK6结合,诱导生成CyclinA和CyclinE,再与CDK2结合从而使结肠上皮细胞从G1期进入S期.C-Myc启动子区域有?-catenin结合位点,所以C-Myc表达能够被Wnt通路上调,C-Myc过表达使其结合至CyclinD2启动子特定的DNA序列并促动CyclinD2的转录过程32.Wnt通路还能直接上调CyclinD1,因为CyclinD1启动子区域包含LEF-1结合位点,而该位点被认为是Wnt通路的直接作用靶点33.?-catenin在胞核内与淋巴细胞增强子结合因子1(LEF-1)和T细胞因子-4(Tcf-4)结合并作为转录共激活子启动下游基因(Slug、Cdx-1、Id2和ENC1等)表达.APC上?-catenin结合位点的减少水准与Wnt通路中?-catenin/LEF-1/Tcf-4复合物增加的水准呈负相关34,而?-catenin/LEF-1/Tcf-4的增加导致了结肠上皮细胞间紧密连接蛋白ZO-1减少、胞间桥粒等连接蛋白降解、细胞骨架重组、细胞离体和获得迁移水平35,还能够直接作用于AP-1转录因子复合物中c-jun和fra-1的启动子部位使该转录复合物增多、上调uPAR转录36.此外,该复合物还能上调ZEB1表达(高表达于FAP腺瘤、结肠腺癌上皮细胞,且与胞核?-catenin水平呈正相关37),而ZEB1能抑制E-cadherin生成38,且该转录激活复合物参与了腺瘤转变为腺癌甚至肿瘤转移的全过程39.以上过程最终使结肠上皮细胞经历EMT过程(如细胞间连接蛋白降解、细胞迁移水平增强和获得间质表型等)并向恶性转化.另外,CK2?是一种高度保守的丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶,能够磷酸化多种底物并在多种生理病理过程中起重要作用40.正常结肠上皮细胞逐渐演变成腺瘤或腺癌的过程被认为与EMT及E-cadherin、Vimentin和?-catenin等基因表达改变紧密相关.Zou等40发现CK2?表达于正常结直肠上皮细胞和结直肠腺瘤/腺癌细胞,通过调节参与细胞周期的癌基因c-myc和抑癌基因p53和p21等影响了大肠癌的演变过程.CK2?敲除或转染CK2?SiRNA后上皮标志物E-cadherin表达显著升高、间质标志物vimentin表达降低,还能造成细胞中转录因子Snail1、Smad2/3和癌基因c-myc的表达下降,以上结果说明CK2?能够对上皮间质转变起到某种水准的抑制作用,但是CK2?影响结肠腺瘤向大肠癌转变的具体机制尚未完全明确.3microRNAs介导的EMT在大肠癌发生发展中的作用microRNAs是一类长度在18-25nt的单链寡核糖核苷酸的非编码RNA,具有高度的保守性、组织特异性和发育时序性41,在转录后水平通过负向调节mRNA发挥其功能,与mRNA的靶向识别以与3''''末端UTR互补性结合为基础42.mi-croRNAs翻译水平的抑制作用常伴随由poly(A)尾加速脱腺苷化和后续核酸外切消化导致的靶mRNA水平减少43,而且microRNAs控制其靶点特异性的关键区域在5''''末端2-7个碱基对的种子序列44,能够在细胞增殖、分化、凋亡、新陈代谢及胚胎发育等过程中起调控作用45,部分microRNAs通过调控癌基因和肿瘤抑制基因的表达;部分通过直接作为癌基因或肿瘤抑制基因参与了大肠癌的病理过程46.虽然microRNAs参与大肠癌发生发展的相关研究较多,但相关microRNAs在大肠癌中介导EMT的研究仍较少.研究证实在很多原发肿瘤及相对应转移瘤中存有不同水准的microRNA表达,在蛋白络氨酸磷酸酶(PTP)Pez诱导MDCK的细胞系中发现了TGF-?参与EMT的过程,因为在该细胞系中发现了细胞间连接缺失和间质表型过表达.此外通过RT-PCR还发现miR-200家族(miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-141和249)及miR-205表达的下调,而稳定的miR-200s过表达能够阻止TGF-?诱导的EMT,提示miR-200s是EMT的关键调控因子,且miR-200s是通过抑制ZEB1和SIP1的翻译来调控EMT的47.关于miR-200家族、ZEB1和SIP1,我们推测上皮细胞和间质细胞表型之间的转化是由ZEB1和SIP1的水平决定的.ZEB1和SIP1结合至目的基因如上皮细胞关键基因E-cadherin启动子成对的ZEB样E-Boxs(CACCTG)上从而抑制这些基因的转录48.以上证据提示miR-200s的丢失可能导致肿瘤的侵袭性增强,甚至造成远处转移.TGF?、TNF?由浸润的炎症细胞或肿瘤细胞产生,已被证实能够诱导结肠癌细胞发生EMT,在结肠癌SW480细胞系中通过miRNA表达分析发现稳定敲除ZEB1能够导致胞间连接蛋白E-cadherin表达上调、细胞迁移和侵袭的水平下降,而miR-141、miR-200b和miR-200c的表达水平明显升高,且miR-141、miR-200c的表达上调最为明显.此结果也被RT-PCR检测所证实,提示这两种miRNA参与了结肠癌EMT过程49.而Colwell50利用TGF?/TNF?诱导LIM1863大肠癌细胞发生EMT的过程中发现miR-21和miR-31表达水平明显升高;蛋白定量分析发现miR-21和miR-31促动了TGF?诱导的EMT的过程,与miR-200抑制EMT上游调控因子ZEB1/2不同,miR-21和miR-31主要作用于EMT下游因子T淋巴瘤侵袭转移蛋白1(TIAM1),后者是一种RacGTPase交换因子51.此外,miR-9和miR-335通过直接抑制E-cadherin和SOX4合成促动了大肠癌细胞转移.以上结果说明某些microRNA能够在TGF-?信号通路的下游发挥作用从而促动结直肠癌的发生和转移.启动子超甲基化和肿瘤抑制基因沉默是肿瘤形成的重要分子标志.Davalos等52通过大肠癌原发肿瘤微切除证实5''''-CpG岛超甲基化相关的miR-200b/200a/429和miR-200c/141多顺反子转录沉默是调节EMT和MET转变的重要步骤,也是大肠癌肿瘤进展的关键,并发现miR-200超甲基化和ZEB1/ZEB2上调与CDH1、CRB3和LGL2表达下调相关;TGF?诱导的EMT中miR-200超甲基化失活伴随着E-cadherin丢失和Vimentin增加53;Twist基因启动子获得CpG岛超甲基化后即可诱导结肠上皮细胞发生间质转化.此外,其他组蛋白修饰基因,如LSD1、CREB结合蛋白、SIRT1等也参与了EMT过程.deKrijger等46发现36%的大肠癌原发肿瘤中miR-34a表达下降,部分归因于TP53的突变,部分是因为启动子甲基化;EMT激活因子TGF?上调也促动了miR-21和miR-31表达,后两者在大肠癌中促动了TGF?诱导的EMT过程.此外,miR-373、miR-126和miR-196a转染的大肠癌细胞则显示出明显肺转移潜能.Sreekumar等54证实E-cadherin表达受miR-9直接调控而转录抑制,miR-199和miR-218则是间质特征性蛋白N-cadherin的潜在直接调控mi-croRNA.miR-138、miR-488和miR-151能够在EMT过程中调节FAK的表达水平从而影响大肠癌肿瘤细胞的迁移水平.4大肠癌中EMT的相关信号通路在EMT介导大肠癌发生发展过程中伴随着众多信号通路的激活,将胞外信号传导入胞内引起E-cadherin、Vimentin等异常、表型改变、基底膜降解、上皮细胞向间质转变和细胞迁移等一系列变化,最终导致正常结肠上皮细胞转变为大肠癌细胞.4.1Wnt/?-catenin和FGF信号传导通路Wnt信号需要通过标准和非标准的信号通路传导,FGF信号通过PI3K-AKT、MAPK和PLC?通路传导.GSK3?是Wnt标准信号传导通路和FGF依赖性PI3K-AKT信号传导通路的关键分子.标准的Wnt信号通路决定细胞的分化方向,非标准的信号通路控制细胞的极性和运动潜能,前者通过卷曲家族受体(Frizzled)和LRP5/LRP6受体实行信号转导,后者通过Frizzled和ROR1/2共同受体实行信号传导.LRP5和LRP6是LDL家族的蛋白分子,胞外有Wnt结合位点,胞内有Axin模体结构.除Wnt信号外,?-catenin为实现在蛋白化及蛋白酶体介导的降解而与GSK3?结合并被后者磷酸化55,标准的Wnt信号诱导Friz-zled-Dishevelled复合物与LRP5/LRP6-AXIN-FRAT结合,使?-catenin从GSK3?释放,最终在胞核中稳定的累积.?-catenin与TCF/LEF、BCL9/9L结合成TCF/LEF-?-catenin-Legless-PYGO复合物,作为Wnt信号通路的效应物56.非标准Wnt信号通路中ROR1和ROR2是受体型络氨酸激酶,胞外为Wnt结合位点,胞内为CKI?结合结构域,RhoA、c-JUN、N末端激酶(JNK)、Nemo样激酶(NLK)是非标准Wnt信号通路的效应物.FGF与受体结合后诱导受体二聚化、络氨酸激酶活化及受体自身磷酸化,FRS2、FRS3和PLC?与磷酸络氨酸残基相互作用被募集至FGF 受体,然后FRS2/3招募GRB2、SHP2,FRS2/SHP2/GRB2复合物募集GAB1激活PI3K,导致GSK3?活性下降、Snail-EMT级联反应激活、E-cadherin/?-catenin表达下调、结肠上皮细胞恶性转化,最终参与了大肠癌的发生发展过程57.基因分析发现Dishevelled是Wnt通路的正向调控蛋白,它发挥作用时处于受体下游、?-catenin的上游,能导致c-Myc和cyclinD基因在结肠癌细胞中出现扩增58.4.2Ras信号传导通路Ras蛋白在调节大肠癌发生发展的信号通路中起着重要作用.生长因子活化的受体激活后,活化的Ras通过Raf激酶激活MAPK激酶(MEK1、MEK2),导致胞外ERK1、ERK2激活59.ERKs位移至细胞核并激活核转录因子,如Elk-1、ATF-2、ETS1/2,使癌基因转录迅速开启.首先,BRAF是Raf家族的一员,他的突变与增强了的激酶活性相关,且在9%-11%的结直肠癌中发现此现象;其次,在30%-40%的腺瘤和76%的结直肠癌肿瘤中证实MEK磷酸化及激活;再次,结直肠癌中表现ERK的高度激活,且证实ERK1、ERK2活性在肠道肿瘤中明显升高;最后,试验证实阻断MEK/ERK抑制了结肠癌细胞的生长,表明ERK参与了结肠癌细胞的增殖.MEK1通过Egr-1、Fra-1增强Snail1/2表达而下调E-cadherin60.另有研究证实结肠上皮细胞表达活化的MEK1获得了向肿瘤细胞转变及转移的潜质.除MAPK途径外,Ras还可通过PI3K和RhoGTPase或与TGF-?协同诱导大肠癌EMT.PI3K激活后影响EMT过程的机制如前所述;此外,PI3K/Akt能够使RhoGTPase激活,也能与TGF?通路相互作用从而影响大肠癌EMT过程61.4.3PI3K信号传导通路磷酸酰肌醇3激酶(PI3K)通路对正常细胞代谢、生长及肿瘤进展起着重要作用.PI3K的抑制因子PTEN缺失(10号染色体上磷酸酶和张力蛋白同源敲除)与结肠肿瘤相关,证实PI3K信号通路在大肠癌发生过程中起着重要作用.近年来研究提示66%-70%的大肠癌中PTEN表达下调,且与微卫星不稳定紧密相关.此外还证实TNF?造成了PTEN下调.IEC-6和HIE细胞敲除PTEN后?-catenin表达水平明显升高,大肠癌SW480细胞中V-catenin表达也有轻度升高,提示?-catenin的表达受PTEN调控.利用LY294002或Wortmannin抑制PI3K降低了c-Myc和cyclinD1表达,而在RIE-1细胞中敲除PTEN则显著上调了上述蛋白的表达;同样在IEC-6和HIE细胞中使PTEN沉默增加了c-Myc和cyclinD1的表达,说明PTEN丢失能够通过促动细胞增殖、抑制凋亡而影响大肠癌的发生62.Bowen等63发现在野生型PTEN结肠肿瘤细胞中Akt2过表达导致了肿瘤微转移的形成,提示Akt可能是作为TGF-?1下游调控因子发挥作用的.PI3K/Akt通路下游的效应分子mTOR激酶调控着CRC肿瘤的发生,且证实mTORC1和mTORC2通过RhoA和Rac1通路调控着结肠癌细胞的迁移水平.4.4Notch和Hedgehog信号传导通路Notch通路在胚胎发育和内环境稳定中发挥着重要作用,其异常激活参与了多种肿瘤的发展过程.该通路激活是由Notch配体(Jag1、Jag2、DLL1、DLL3和DLL4)结合至相对应受体上引起的.配体在细胞外被蛋白酶裂解、在胞内被?-分泌酶裂解64,使得Notch胞内结构域(NICD)转至细胞核,在胞核中与CSL和其他共刺激因子如Maml1、2、3构成转录激活复合物,最终激活Notch通路的靶基因Hes和Hey1,使上皮细胞恶性转化.研究显示大肠癌EMT的诱导因子ZEB1可通过抑制miR-200表达而稳定Notch通路的Jag1、Maml2和Maml3,并证实ZEB1通过提升Jag1的表达而增强Notch通路激活通路存有交互作用66.虽有研究67证实Hedgehog通路能诱导Snaill表达上调,但是尚未证实Hedgehog对Snaill有直接转录激活作用.另外Hedgehog能诱导JAG2表达上调、促动TGF?分泌68,TGF-?1激活使胞核内NF-?B调控的ZEB1和ZEB2表达上调,同样使Smad-Sp1调控的间质标志物Vimentin等表达上调从而促动大肠癌细胞迁移及侵袭.5结论在胚胎发育中EMT是必需的生理过程,而肿瘤组织诱导产生的EMT则是肿瘤浸润和转移的重要机制之一.当前,越来越多的证据表明EMT在与肿瘤发生、发展机制中起着重要的作用,随着对EMT作用机制的研究持续深入以及对其信号通路和关键分子的逐步了解,相关的研究结果为临床治疗肿瘤提供了重要的靶点与途径.因为EMT主要是由E-cadherin 的转录抑制因子诱发的,所以借助靶向抑制Snail等的治疗方法为防止肿瘤进展提供了可能.此外,EMT信号传导通路中的关键分子GSK-3?、PAK和TGF?等将来也有可能成为阻断EMT的重要靶点.虽然当前对EMT 发生机制的研究尚未完全清楚,但是随着相关研究的持续深入,人们对EMT的了解将会变得更加清晰.上皮细胞转化大肠发展。
第 49 卷第 4 期2023年 7 月吉林大学学报（医学版）Journal of Jilin University（Medicine Edition）Vol.49 No.4Jul.2023DOI：10.13481/j.1671‐587X.20230414PMS2通过ERK/ERCC1通路对结肠癌SW480细胞生物学行为的影响黄雪茹1, 丁绪浩1, 陈素贤2, 谭琦2, 吴月明3, 牛晓敏1, 王亚帝4, 佟青1（1. 锦州医科大学附属第三医院临床检验诊断学教研室，辽宁锦州121000；2. 锦州医科大学附属第三医院病理科，辽宁锦州121000；3. 锦州医科大学附属第三医院肿瘤二科，辽宁锦州121000；4. 锦州医科大学附属第三医院精准医学中心，辽宁锦州121000）［摘要］目的目的：探讨减数分裂后分离蛋白2（PMS2）表达对结肠癌SW480细胞生物学行为的影响，阐明PMS2与切除修复交叉互补组1（ERCC1）和细胞外调节蛋白激酶（ERK）信号转导通路的关系。
方法方法：将PMS2 siRNA质粒和PMS2过表达质粒分别转染入结肠癌SW480细胞（分别为PMS2敲减组和PMS2过表达组），同时设PMS2敲减对照组（siRNA-NC组）和PMS2过表达对照组（PMS2 control组）。
采用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）法检测各组细胞中PMS2 mRNA表达水平，Western blotting法检测各组细胞中PMS2蛋白表达水平，CCK-8法检测各组细胞增殖活性，细胞划痕实验检测各组细胞迁移率，Transwell小室实验检测各组细胞中侵袭细胞数，流式细胞术检测顺铂作用后各组细胞凋亡率。
通过String数据库，对PMS2、ERCC1和ERK上下游蛋白的关系进行生物信息学分析。
SW480细胞分别采用3条siRNA进行PMS2和ERCC1敲减，采用RT-qPCR法验证PMS2与ERCC1的相互作用，采用Western blotting法检测各组细胞中PMS2、细胞外调节蛋白激酶1/2（ERK1/2）和磷酸化ERK1/2 （p-ERK1/2）蛋白表达水平。
中国药理学通报Chinese Pharmacological Bulletin2022Doe；33((2)：1679~83-1679•网络出版时间：2220-12-314：37网络出版地址：htt p s：//kns.cakh net/kcms/demil/34.1086.r.22201222.1516；222.html抑制线粒体丙酮酸载体通过激活AMPK-ACC通路改善棕榈酸诱导的HenG2细胞脂肪变性李世英2汪艳J，(南方医科大学1.药学院、21中心实验室,3.南方医院感染內科暨肝病中心，广东广州514515)doi：23969//Osn.1021-1978.2222.12.212文献标志码：A文章编号：1421-1978(2222)12-1679-25中国图书分类号：R379；24；R344.0；R345.07；R475.0；R977.3；R977.0摘要：目的探究抑制线粒体丙酮酸载体(mitochondrial pyruvate carrier,MPC)是否通过激活腺苷酸激活蛋白激酶(AMP-activated proteio kinase,AMPK--乙酰辅酶A羧化酶(acetyl CoA carboxylase,ACC)通路，改善棕榈酸(palmitic ocid.PA)所致HepG2细胞脂肪变性情况。
方法利用PA 处理HepG2细胞作为高脂负荷模型组，实验分为正常对照组、模型组和MPC抑制组。
油红O染色分析细胞的油脂蓄积情况。
RT-CCR检测AMPK、ACC、CPT1A、SREBP1mRNA 表达水平。
全自动蛋白分析仪检测AMPK、pAMPK、ACC、p-ACC、SREBP1蛋白表达水平。
结果PA可以诱导HepG2细胞胞质内聚集大量环状脂滴，降低pAMPK、pACC蛋白表达水平，提高SREBP1基因以及蛋白表达水平。
MPC抑制剂UK5099可以减少PA所致HepG2细胞胞质内脂滴数量，提高pAMPK、pACC蛋白表达水平，降低SREBP1基因以及蛋白表达水平。
NDRG2截断肽对胶质瘤细胞系U87MG和U251的抗肿瘤作用李柏樟;李力;秦晓琴;邓艳春【期刊名称】《中华神经外科疾病研究杂志》【年(卷),期】2014(13)2【摘要】目的探讨源于N-myc下游调节基因2(NDRG2)蛋白的截短肽对胶质瘤细胞系U87MG和U251的抗肿瘤作用.方法设计、构建人类NDRG2蛋白若干截短肽片段的真核表达载体,转染至上述两种肿瘤细胞中,通过流式细胞术(FCM)观察肿瘤细胞的凋亡和周期阻滞情况.结果流式细胞术结果显示,包含NDRG2蛋白C 末端的片段均能不同程度的诱导两种肿瘤细胞系的周期阻滞.结论 NDRG2的C末端是其抗肿瘤作用的关键,很有可能从中筛选出具有治疗意义的抗肿瘤肽.【总页数】5页(P118-122)【作者】李柏樟;李力;秦晓琴;邓艳春【作者单位】第四军医大学口腔医学系,陕西西安710032;第四军医大学西京医院神经内科,陕西西安710032;西安市东方医院神经内科,陕西西安710002;第四军医大学西京医院神经内科,陕西西安710032【正文语种】中文【中图分类】R739.4【相关文献】1.脑胶质瘤干细胞和U251人胶质瘤细胞系X线辐射敏感性研究 [J], 樊锐太;刘俊启;张洪志;葛辰蕾;胡勇;关方霞;杨波2.面包海星皂苷-1对恶性胶质瘤细胞系U87MG增殖抑制的体外研究 [J], 程光;张赟n;章翔;汤海峰;费舟;李兵;曹卫东;高大宽3.免疫球蛋白G促进胶质瘤细胞系U87MG中PCNA P-ERK及P-SRC的表达 [J], 王丽;滕晓梅;权翠侠;霍美凤;胡书群4.重组人ndrg2腺病毒对胶质瘤细胞U251抑制作用的研究 [J], 李明霞;丁伯君;邓艳春5.miR-93在脑胶质瘤的表达及其对胶质瘤细胞系U87、U251细胞增殖的影响[J], 朱潇鹏;陈泽波;范宏军;李甘;黄永凯;韩德清因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
线粒体融合蛋白2诱导肝癌细胞凋亡的分子机制的研究近年来，肝癌发病率高，治疗办法也很有限，因此，迫切需要研究肝癌的分子机制，识别有效的治疗靶点，以改善患者的预后。
线粒体融合蛋白2（MFN2）是一种重要的信号分子，参与各种细胞凋亡的调节，在肿瘤发生过程中发挥至关重要的作用。
本文旨在研究MFN2对肝癌细胞凋亡的分子机制。
首先，我们采用实时定量聚合酶链式反应技术研究了MFN2在多种肝癌细胞中的表达水平。
结果显示，MFN2在HepG2，MHCC97H和HCCLM3等肝癌细胞中的表达水平明显要高于正常肝细胞中的表达水平。
其次，我们采用RNA干扰和小分子抑制剂抑制MFN2的表达，发现RNA干扰及小分子抑制剂抑制MFN2后，可以明显降低肝癌细胞的存活率，增加其凋亡率。
此外，细胞凋亡试验结果显示，MFN2抑制后，细胞凋亡发生明显提高。
进一步，我们研究了MFN2对乳酸脱氢酶（LDH）和水溶性及油溶性脂质过氧化物酶（SOD和POD）表达水平的影响。
结果显示，MFN2抑制后，LDH表达水平显著降低，而SOD和POD表达水平明显升高。
最后，我们使用染色体免疫沉淀结果证明MFN2的相关蛋白可以诱导SOD激活，从而促进肝癌细胞的凋亡。
综上所述，MFN2对肝癌细胞凋亡发挥重要作用，研究表明MFN2的抑制可以通过抑制乳酸脱氢酶表达，激活水溶性及油溶性脂质过氧化物酶和诱导染色体免疫沉淀而促进肝癌细胞凋亡。
这些研究结果为肝癌的治疗提供了新的靶点和治疗途径。
本研究为肝癌的治疗提供了重要的理论基础，它为将来制定有效的治疗策略提供了参考和指导意义。
然而，本研究仍有有些局限性，例如，未做转染实验验证MFN2的抑制对肝癌的抑制效果，以及缺乏从更长时间尺度上观察凋亡过程的研究。
因此，未来还需要更深入和广泛的研究，以确认MFN2在肝癌发生发展中的作用，从而为肝癌的预防与治疗提供理论基础。
MEK通路抑制剂对人胰腺癌细胞生长及细胞周期相关抑癌基因表达背景：胰腺癌是一种高度恶性的肿瘤，常常在发现时已经处于晚期，导致治疗效果不佳。
研究胰腺癌的发病机制以及潜在的治疗靶点就显得尤为重要。
MEK通路是一个重要的信号传导通路，在多种癌症中发挥着重要作用。
近年来，对MEK通路抑制剂在肿瘤治疗中的应用进行了深入的研究，但其在胰腺癌治疗中的作用还有待进一步探讨。
细胞周期是细胞生长和增殖的基本调控之一，其异常调控与肿瘤发生密切相关。
而抑癌基因是一种对癌细胞增殖具有负调控作用的基因，其表达水平的变化往往与肿瘤的发生和发展密切相关。
本研究旨在探究MEK通路抑制剂对人胰腺癌细胞生长、细胞周期相关蛋白的表达以及抑癌基因的调控作用，以期为胰腺癌治疗提供新的思路和方法。
材料与方法：1.实验细胞株的培养和处理：选取几种典型的胰腺癌细胞株作为实验材料，在含有不同浓度MEK通路抑制剂的培养基中进行培养处理。
2.细胞生长曲线测定：采用MTT法测定细胞在MEK通路抑制剂处理下的生长曲线。
3.细胞周期蛋白的免疫印迹分析：通过免疫印迹法检测细胞周期蛋白在MEK通路抑制剂处理下的表达变化。
4.抑癌基因表达的实时荧光定量PCR分析：采用实时荧光定量PCR技术检测抑癌基因在MEK通路抑制剂处理下的表达水平变化。
结果：1. MEK通路抑制剂可以显著抑制人胰腺癌细胞的生长，且抑制效果呈浓度依赖性。
2. MEK通路抑制剂处理可导致细胞周期相关蛋白如Cyclin D1、Cyclin E的表达水平下调，细胞周期蛋白激酶抑制剂p21、p27的表达水平上调。
3. MEK通路抑制剂处理可以显著提高抑癌基因，如P53、PTEN等的表达水平。
讨论与结论：MEK通路抑制剂对人胰腺癌细胞具有明显的抑制作用，其机制可能涉及到细胞周期的调控及抑癌基因的表达调节。
MEK通路抑制剂可能成为胰腺癌治疗的潜在靶点之一。
进一步的研究可以通过体内实验验证其治疗效果，并探讨其在临床上的应用前景。
MEK通路抑制剂对人胰腺癌细胞生长及细胞周期相关抑癌基因表达胰腺癌是一种恶性肿瘤，由于其缺乏早期症状，难以被及早发现，导致了其高度恶性和低存活率。
目前，对于胰腺癌的治疗方法主要是手术切除、放疗和化疗，但效果并不理想。
寻找新的治疗方法和药物对抗胰腺癌，成为了当前医学研究的热点之一。
MEK（Mitogen-activated protein kinase kinase）通路是细胞内一个重要的信号传导通路，通过激活ERK（extracellular signal-regulated kinase）蛋白激酶，参与了多种细胞的生长、分化和凋亡等生理过程。
而正常情况下，MEK通路的异常激活会导致癌细胞的异常增殖和生长，抑制MEK通路已经成为了抗癌治疗的重要策略之一。
本研究旨在探究MEK通路抑制剂对人胰腺癌细胞生长及细胞周期相关抑癌基因表达的影响，为寻找新的胰腺癌治疗方法提供实验基础。
我们选择了常见的MEK通路抑制剂进行实验，通过细胞培养和分子生物学方法，研究了MEK通路抑制剂对胰腺癌细胞生长的影响，并进一步分析了相关的细胞周期调控基因的表达情况。
我们选择了几种广泛应用的MEK通路抑制剂，包括PD0325901、AZD6244等，分别加入到人胰腺癌细胞培养基中，通过细胞计数和荧光显微镜观察，发现这些抑制剂可以显著地抑制胰腺癌细胞的增殖和生长，而且随着药物浓度的增加，抑制效果也呈现出剂量依赖性。
这表明MEK通路抑制剂对于胰腺癌细胞的抑制作用是明显的，这为我们继续研究其抗癌机制提供了基础。
接着，我们将焦点转向了细胞周期相关的抑癌基因表达情况。
我们选择了几个已知的细胞周期调控基因，包括p21、p27等，通过实时荧光定量PCR技术检测其在MEK通路抑制剂作用下的表达变化。
结果显示，这些抑癌基因在MEK通路抑制剂处理后，其表达水平普遍上调，尤其是p21和p27，在抑制剂浓度较高时，表达水平上调更为明显，这可能是导致胰腺癌细胞生长抑制的分子机制之一。
现代肿瘤医学２０１５年ｏ３月第２３卷第５期 ＭＯＤＥＲＮ ＯＮＣＯＬＯＧＹ，Ｍａｒ．２０１５，ＶＯＬ．２３，ＮＯ．０５ ·５８１· 囹论 著囹 每基础研究夺
抑癌基因ＮＤＲＧ２对人结肠癌细胞系ＤＬＤ一１丙酮酸脱氢酶（ＰＤＨ）的表 达和有氧氧化代谢的调节 徐欣元 ，雷世雄 ，沈岚 Ｔｕｍｏｒ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｇｅｎｅ ＮＤＲＧ２ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｔｈｅ （ＰＤＨ）ａｎｄ ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｐｙｒｕｖａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｌｌｉｎｅ ＤＬＤ一１
Ｘｕ Ｘｉｎｙｕａｎ 。Ｌｅｉ Ｓｈｉｘｉｏｎｇ ，Ｓｈｅｎ Ｌａｎ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆＢｉｏｃｈｅｍ￣ｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｔｈｅ Ｆｏｕｒｔｈ Ｍｉｌｉｔａｒｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈａａｎｘｉ Ｘｉ＂ａｎ ７１００３２，Ｃｈｉｎａ； Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｓｕｒｇｅｒｙ，Ｔａｎｇｄｕ Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｔｈｅ Ｆｏｕｒｔｈ Ｍｉｌｉｔａｒｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｍｉｔｙ，Ｓｈａａｎｘｉ Ｘｉ＇ａｎ ７１００３８，Ｃｈｉｎａ． 【Ａｂｓｔｒａｃｔ】 Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｏｖｅｒ—ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ ｏｆ ＮＤＲＧ２（Ｎ—Ｍｙｅ ｄｏｗｎ— ｓｔｒｅａｍ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｇｅｎｅ ２）ｇｅｎｅ ｏｎ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｐｙｒｕｖａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（ＰＤＨ）ａｎｄ ｏｘｙｇｅｎ ｃｏｎｓｕｍｐｔｉｏｎ ｒａｔｅ （ＯＣＲ）ｏｆ ｈｕｍａｎ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ＤＬＤ一１ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ＮＤＲＧ２ ｏｒ ＮＤＲＧ２ ｓｈＲＮＡ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｔｈｅ ｌｅｎｔｉｖｉｒｎｓｅｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ＮＤＲＧ２ ｏｒ ＮＤＲＧ２ ｓｈＲＮＡ，ｐｒｅｐａｒｅｄ ｓｅｐａｒａｔｅｌｙ ｆｒｏｍ ＮＤＲＧ２ ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ｐＬｅｎｔｉ６一ＮＤＲＧ２ ｏｒ ＮＤＲＧ２ ｓｈＲＮＡ ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ｐＬＫＯ．１一ｓｈＮＤＲＧ２， ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ｔｏ ｉｎｆｅｃｔ ｈｕｍａｎ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ ＤＬＤ一１．Ｔｈｅ ｓｔａｂｌｅ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ｗｅｒｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｂｙ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｂｌａｓｔｉｃｉｄｉｎ ｏｒ ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ ｆｏｒ ２ ｗｅｅｋｓ．Ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ ＰＣＲ ａｎｄ Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ ｗｅｒｅ ｅｍｐｌｏｙｅｄ ｔｏ ｅｘａｍｉｎｅ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＮＤＲＧ２ ａｎｄ ＰＤＨ ｉｎ ｔｈｅｓｅ ｓｔａｂｌｅ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ．Ｓｅａｈｏｒｓｅ Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｆｌｕｘ（ＸＦ２４ ）ａｎａｌｙｚｅｒ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ ｂａｓａｌ ｏｘｙｇｅｎ ｃｏｎｓｕｍｐｔｉｏｎ ｒａｔｅ（ＯＣＲ）ｏｆ ｔｈｅｓｅ ｓｔａｂｌｅ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：Ｔｈｅ ｍＲＮＡ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ＮＤＲＧ２ ｗｅｒｅ ｕｐ— ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｉｎ ＤＬＤ一１ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ｐＬｅｎｔｉ６一ＮＤＲＧ２．ａｎｄ ｄｏｗｎ～ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｉｎ ｔｈｏｓｅ ｗｉｔｈ ｐＬＫＯ．１一 ｓｈＮＤＲＧ２．Ｔｈｅ ＰＤＨ ａｎｄ ＯＣＲ ｗｅｒｅ ｕｐ—ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｉｎ ＤＬＤ一１ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ｓｔａｂｌｙ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ｐＬｅｎｔｉ６一ＮＤＲＧ２，ａｎｄ ｄｏｗｎ—ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｉｎ ｔｈｏｓｅ ｗｉｔｈ ｐＬＫＯ．１一ｓｈＮＤＲＧ２．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：ＮＤＲＧ２，ａｓ ａ ｃａｎｄｉｄａｔｅ ｔｕｍｏｒ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｇｅｎｅ， ｃｏｕｌｄ ｐｒｏｍｏｔｅ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＰＤＨ ａｎｄ ｂｏｏｓｔ ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ． 【Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ】ＮＤＲＧ２；ｃａｎｃｅｒ；ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ；ＰＤＨ；ＯＣＲ Ｍｏｄｅｒｎ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ２０１５，２３（０５）：０５８１—０５８５
【摘要】 目的：采用重组慢病毒系统，通过过表达和ＲＮＡ干涉的方法分别增加和降低ＮＤＲＧ２（Ｎ—Ｍｙｃ ｄｏｗｎ— ｓｔｒｅａｍ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｇｅｎｅ ２）基因后，检测人结肠癌细胞系ＤＬＤ一１中丙酮酸脱氢酶（ＰＤＨ）的表达水平及氧消耗率 （ＯＣＲ）。方法：分别采用表达ＮＤＲＧ２慢病毒载体ｐＬｅｎｔｉ６一ＮＤＲＧ２和ＮＤＲＧ２ ｓｈＲＮＡ慢病毒载体ｐＬＫＯ．１一 ｓｈＮＤＲＧ２制备病毒载体并感染ＤＬＤ一１细胞，经两周耐药筛选，获得稳定感染的细胞株。采用Ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ ＰＣＲ和Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ的方法明确ＮＤＲＧ２在稳定感染细胞株中的表达情况，再使用上述方法检测稳定感染细 胞株中ＰＤＨ的表达水平，最后，通过Ｓｅａｈｏｒｓｅ能量呼吸代谢仪，检测稳定感染细胞株中的ＯＣＲ。结果：Ｒｅａｌ— ｔｉｍｅ ＰＣＲ和Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ结果表明，在慢病毒ｐＬｅｎｔｉ６一ＮＤＲＧ２稳定感染的ＤＬＤ一１细胞中，ＮＤＲＧ２表达上 调，ＰＤＨ表达上调；ｐＬＫＯ．１一ｓｈＮＤＲＧ２稳定感染的ＤＬＤ一１细胞中，ＮＤＲＧ２的表达下调，ＰＤＨ表达下调。 Ｓｅａｈｏｒｓｅ结果表明，ＮＤＲＧ２过表达细胞株中细胞的ＯＣＲ上升，而ＮＤＲＧ２ ＲＮＡ干涉细胞株中细胞的ＯＣＲ明 显下降。结论：通过过表达和抑制ＮＤＲＧ２基因，证实了ＮＤＲＧ２作为抑癌候选基因能够有效促进结肠癌细胞 系ＤＬＤ一１中丙酮酸脱氢酶ＰＤＨ的表达，并促进有氧氧化。 【关键词】ＮＤＲＧ２；肿瘤；慢病毒；ＰＤＨ；ＯＣＲ
【收稿日期】 【修回日期】 【基金项目】 【作者单位】
【作者简介】 【通讯作者】
２Ｏｌ４—０９—２７ ２０１４——１０—．２７ 国家自然科学基金资助项目（编号：３１１７１１１２，８１２３００４３） 第四军医大学生物化学和分子生物学教研室，陕西西安７１００３２ 第四军医大学唐都医院普外科，陕西西安７１００３８ 徐欣元（１９８８一），男，甘肃兰州人，硕士研究生，主要从事肿瘤代谢重编程研究。Ｅ—ｍａｉｌ：ｘｙｘｕ００１０＠２１ｃｎ．ｓｏｎ 沈岚（１９７７一），女，湖北武汉人，副教授，博士，研究生导师，主要从事肿瘤代谢研究。Ｅ—ｍａｉｌ：ｌａｎｓｈｅｎ＠ｆｍｍｕ．ｅｄｕ．ｃｎ ５８２· 徐欣元，等 抑癌基因ＮＤＲＧ２对人结肠癌细胞系ＤＬＤ一１丙酮酸脱氢酶（ＰＤＨ）的表达和有氧氧化代谢的调节 【中图分类号】１１７３０．２３；１１７３５．３ ５ 【文献标识码】Ａ ＤＯＩ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１６７２—４９９２．２０１５．０５．０１ 【文章编号】１６７２—４９９２一（２０１５）０５—０５８１—０５
恶性肿瘤是目前危害人类健康最严重的一类疾病。肿 瘤细胞快速无序地增殖，使细胞常处于一种缺氧状态，于是 肿瘤细胞关闭了需要线粒体的有氧氧化，偏向于糖酵解供 能。即使有氧存在，肿瘤细胞也会偏向使用糖酵解作用取代 般正常细胞的有氧氧化，即Ｗａｒｂｕｒｇ效应” 。Ｗａｒｂｕｒｇ效 应指出，肿瘤细胞通过增强无氧酵解提供能量，即，葡萄糖代 谢至丙酮酸（ｐｙｒｕｖａｔｅ）后，不再通过丙酮酸脱氢酶（ＰＤＨ）转 化为乙酰辅酶Ａ进入三羧酸循环，而是通过乳酸脱氢酶 （ＬＤＨ），转变成乳酸。Ｗａｒｂｕｒｇ效应引出了新的治疗策略，即 是否能通过导引细胞恢复正常有氧循环，切断肿瘤细胞的能 量供应来阻止肿瘤细胞生长。 ＮＤＲＧ（Ｎ—Ｍｙｃ ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｇｅｎｅ）一２属于 ＮＤＲＧ家族，是本研究组用锚定引物ＰＣＲ方法从正常人脑 ｃＤＮＡ文库中克隆得到的一个新基因 ‘” 。目前研究发现， ＮＤＲＧ２ ｍＲＮＡ和蛋白水平在多种肿瘤细胞系（乳腺癌 Ｊ、 结肠癌 和肺癌 等）及原发肿瘤（脑膜瘤 ］、恶性胶质 瘤 、胃癌… 和结直肠癌 等）中显著下调。对于原发肿 瘤，如结肠癌，随着Ｄｕｋｅｓ分期的增高，ＮＤＲＧ２表达有下降趋 势，同时ＮＤＲＧ２的表达水平与结直肠癌的复发呈负相 关 …。另有研究发现，ＮＤＲＧ２可以抑制肿瘤细胞增殖 Ｊ、 侵袭及转移 Ｊ。可认为ＮＤＲＧ２发挥着抑癌基因的作用 ”Ｊ。 为了深入研究ＮＤＲＧ２基因的功能，我们利用慢病毒体 系ｐＬｅｎｔｉ６一ＮＤＲＧ２和ｐＬＫＯ．１一ｓｈＮＤＲＧ２获得了ＮＤＲＧ２ 的稳定感染的过表达和ＲＮＡ干涉细胞株ＤＬＤ一１，通过检测 稳定感染的结肠癌细胞中丙酮酸脱氢酶（ＰＤＨ）的表达水平 和氧消耗率（ＯＣＲ），分析ＮＤＲＧ２基因对ＰＤＨ及有氧氧化的 影响，为肿瘤的基因治疗提供实验依据。 １材料与方法 １．１材料 １．１ １试剂ＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ １６４０培养基购自Ｇｉｂｃｏ公司；胎 牛血清购自杭州四季青公司；转染试剂Ｔｕｒｂｏｆｅｅｔ Ｔｒａｎｓｆｅｅｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ购自Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；ＲＮＡ提取试剂Ｔｒｉｚｏｌ购自Ｉｎ． ｖｉｔｒｏｇｅｎ公司；ＲＴ—ＰＣＲ试剂盒及Ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ ＰＣＲ试剂盒购 自大连宝生物工程有限公司；ＮＤＲＧ２鼠单抗购自Ａｂｎｏｖａ公 司；Ｂ—ａｃｔｉｎ兔单抗购自北京博奥森公司；ＰＤＨ兔单抗购自 Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ公司；ＭＩＴＯ Ｓｔｒｅｓｓ Ｔｅｓｔ Ｋｉｔ购自Ｓｅａ— ｈｏｒｓｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ；其他常用试剂为本室所有。 １．１．２细胞培养ＤＬＤ一１细胞和ＨＥＫ２９３Ｔ细胞系为本实 验室保存，培养于３７℃、含５％ＣＯ，的细胞培养箱，培养基分 别为含１０％胎牛血清的ＲＰＭＩ １６４０和ＤＭＥＭ，０．２５％胰蛋白 酶消化传代，倒置显微镜下观察细胞生长状态。 １．２稳定转染细胞系的建立 １．２．１药物浓度筛选ｐＬｅｎｔｉ６慢病毒载体含有杀稻瘟菌素 （ｂｌａｓｔｉｃｉｄｉｎ）抗性基因，而ｐＬＫＯ．１载体含有嘌呤霉素（ｐｕｒｏ— ｍｙｃｉｎ）抗性基因。在建立稳定感染细胞系之前，需要确定能 够在３—１０天杀死细胞的最优杀稻瘟菌素以及嘌呤霉素浓 度。具体方法如下：２４孔板接种ＤＬＤ一１亲本细胞，约１× １０ 个／孔，待细胞密度达到６０％左右，开始添加药物进行筛 选（杀稻瘟菌素按照从１ ｍｌ到２０￣ｇ／ｍｌ，间隔１ ｍｌ；嘌 呤霉素按照从０．２５ ｇ／ｍｌ到５ ｍｌ，间隔０．２５ ｇ／ｍ１），隔天 换液，以全部细胞被杀死的前一孔所对应浓度作为筛选出的 最优浓度。 １．２．２慢病毒载体的制备接种ＨＥＫ２９３Ｔ细胞于１００ｍｍ 细胞培养皿，培养过夜，待密度达到８０％左右进行转染。包 装体系包括：１０１．￣ｇ载体质粒（ｐＬｅｎｔｉ６一ｃｈｅｒｒｙ质粒、ｐＬｅｎｔｉ６一 ＮＤＲＧ２质粒、ｐＬＫＯ．１一ｓｃｒａｍｂｌｅ质粒、ｐＬＫＯ．１一ｓｈＮＤＲＧ２质 粒），７．５ ｇ包装质粒（ｐｓＰＡＸ２质粒），２．５ ｇ包膜质粒 （ｐＭＤ２．Ｇ质粒）以及４０ 转染试剂。将上述体系混匀，按 照转染试剂说明书进行转染。转染结束后将细胞培养皿放 入５％ＣＯ 培养箱继续培养，２４ｈ后更换新的培养液，４８ｈ后 用０．４５ ｍ滤器过滤收集含有病毒颗粒的培养液。标记，保 存于一８０￣Ｃ冰箱，用于感染细胞。 １．２．３病毒感染感染前一天将ＤＬＤ～１细胞以低密度接 种于６孔细胞培养板中，置于含１０％胎牛血清的ＲＰＭＩ １６４０ 培养基中培养。将收集的病毒液和新鲜的细胞培养液按ｌ：ｌ 混合加入培养板中，并加入聚凝胺（ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ，终浓度８ｒａｇ／ ｍ１）促进病毒感染。慢病毒组分为ｐＬｅｎｔｉ６一ｃｈｅｒｒｙ、ｐＬｅｎｔｉ６一 ＮＤＲＧ２、ｐＬＫＯ．１一ｓｃｒａｍｂｌｅ、ｐＬＫＯ．１一ｓｈＮＤＲＧ２ ４组，其中 ｐＬｅｎｔｉ６一ｃｈｅｒｒｙ、ｐＬｅｎｔｉ６一ＮＤＲＧ２慢病毒带有杀稻瘟菌素抗 性基因，而ｐＬＫＯ．１一ｓｃｒａｍｂｌｅ、ｐＬＫＯ．１一ｓｈＮＤＲＧ２含有嘌呤 霉素抗性基因。病毒感染２４ｈ后，分别更换含有杀稻瘟菌素 和嘌呤霉素的新鲜培养液，隔天换液，经过两周左右时间的 压力筛选获得稳定感染的细胞株。 １．３稳定转染细胞系的鉴定 １．３．１ Ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ ＰＣＲ检测实验分为两组，其中一组为 ｐＬｅｎｔｉ６一ＮＤＲＧ２（ＮＤＲＧ２）和对照ｐＬｅｎｔｉ６一ｃｈｅｒｒｙ（Ｃｏｎｔｒｏ１）； 另一组为ｐＬＫＯ．１一ｓｈＮＤＲＧ２（ＮＤＲＧ２ ｓｈＲＮＡ）和对照ｐＬ— ＫＯ．１一ｓｃｒａｍｂｌｅ（Ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｈＲＮＡ）。使用Ｔｒｉｚｏｌ提取细胞 ＲＮＡ，再用反转录试剂盒将ＲＮＡ反转录获得ｃＤＮＡ，然后以 各组ｃＤＮＡ为模板，进行Ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ ＰＣＲ检测，每个检测设３ 个复孔，Ｂ—ａｃｔｉｎ作为内参。具体的引物序列如下： Ｂ—ａｃｔｉｎ为５ 一ＣＧＣＧＡＧＡＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＡＴ一３，（Ｆ）和 ５ 一ＧＴＡＣＧＧＣＣＡＧＡＧＧＣＧＴＡＣＡＧ一３ （Ｒ）；ＮＤＲＧ２为５ 一 ＧＡＧＡＴＡＴＧＣＴＣＴｒＡＡＣＣＡＣＣＣＧ－３（Ｆ）和５ 一ＧＣＴＧＣＣＣＡＡＴＣ— ＣＡＴＣＣＡＡ一３ Ｒ）：ＰＤＨ—Ｅ１ ０【为５ 一ＣＴＦＡＣＣＧＣＴＡＣＣＡＴＧ— ＧＡＣＡＣＡＧＣＡＴＧ－３（Ｆ）和５ 一ＣＴＣＣＴＩＴＡＡＴＹＣＴＩ＇ＣＡＡＣＡＣｑＴ— ＧＣＡＡＧＡ一３＜Ｒ）；ＰＤＨ—Ｅ１Ｂ为５ 一ＡＴＣＡＴＣＴＣＧＴＧＡＣＴＧＴ— ＧＧＡＡＧＧＡＧＧＣ一３ （Ｆ）和５ 一ｒ兀’ＧＣＧ ｒＡＡＧＧＣＡＴＡＧＧＧＡ— ＣＡＴＣＡＧＣＡ一３，（Ｒ）；ＰＤＨ—Ｅ２为５ 一ＧＡＡＴＣＡＴＣＡＡＧＡＡＧ— ＧＡＣＡＴＴＧＡＣＴＣＴＴ一３ Ｆ）和５ 一ＡＴＣＧＡＣＡＧＡＡＡＧＧＴＡＡＴＡ— ＡＴＧＡＧＧＴＡＴＡ一３ Ｒ）；ＰＤＨ—Ｅ３为５ 一ＡＡＴＧＴＩ＇ＧＧＣＴＣＡ． ＣＡＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＴＧＡ一３ Ｆ）和５，－ＣＴＩ＇ＣＡＣＣＡＴＧＣＣＡＴＣＴ— ＧＴＧＴＣＡＧＣＡＴ一３ Ｒ）。ＰＣＲ反应条件：（ ５℃３ｍｉｎ；￣）９５ｏｃ １０ｓ；③６Ｏ℃３０ｓ＋ｐｌａｔｅ ｒｅａｄ；④Ｇｏ ｔｏ②，３９ ｍｏｒｅ ｔｉｍｅｓ；＠Ｍｅｌｔ ｃｕｒｖｅ ６５．０℃ｔｏ ９５．Ｏ℃，ｉｎｃｒｅｍｅｎｔ ０．５￣Ｃ ５ｓ＋ｐｌａｔｅ ｒｅａｄ；⑥ ＥＮＤ（Ｂｉｏ—Ｒａｄ ＣＦＸ Ｍａｎａｇｅｒ３．１）。反应结束根据ｃｔ值，计 算分析各组之间靶基因ｍＲＮＡ表达水平的差异。 １．３．２ Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ检测实验分组同上，将收集的细胞用 ＲＩＰＡ（强）充分裂解，进行ＢＣＡ蛋白定量，常规制备蛋白样 品。取５０ｐ￣ｇ处理好的蛋白样品进行ＳＤＳ一聚丙烯酰胺凝胶
