细胞核中的丙酮酸脱氢酶复合体在高糖引起的胰岛素分泌障碍中的作用机制
【摘要】目的探讨细胞核中的丙酮酸脱氢酶复合体（PDC）在高糖引起的β细胞胰岛素分泌障碍中的作用机制。
方法设立空白组、对照组（5.5mmol/L）和高糖组（33.3mmol/L）培养β-TC6细胞72h。
采用丙酮酸脱氢酶（E1）活性检测试剂盒检测各组β-TC6细胞中E1活性。
E1-siRNA转染细胞后，采用ELISA法检测各组核内乙酰辅酶A的变化情况；ChIP-qPCR法检测各组Islet1、Ins、Pdx1基因表达水平；Western blot法检测各组ISLET1、INS、PDX1蛋白表达水平。
结果与对照组相比，高糖组β-TC6细胞E1活性降低，间接表明PDC 受损（P <0.05）；采用E1-siRNA处理后，核内乙酰辅酶A的生成量明显减少（P < 0.05）；细胞内的Islet1、Ins和Pdx1基因表达和蛋白水平均降低（P< 0.05）。
结论高糖会引起PDC损伤，造成核内乙酰辅酶A生成减少，胰岛素及其分泌相关基因和蛋白水平降低，导致胰岛素分泌障碍。
【关键词】丙酮酸脱氢酶复合体；高糖；乙酰辅酶A；乙酰化；胰岛素分泌障碍
Mechanism of pyruvate dehydrogenase complex in nucleus in insulin secretion disorder caused by high
glucose
【Abstract】Objective: To investigate effect of pyruvate dehydrogenase complex (PDC) in the nucleus on insulin secretion deficiency of β-TC6 cells induced by high glucose condition. Methods:β-TC6 cell was cultured with blank group, control group (5.5mmol/L) and high glucose
group (33.3mmol/L) for 72 hours. Pyruvate dehydrogenase (E1) activity was analyzed by its kit. Acetyl-CoA in the nucleus of β-TC6 cell transfected with E1-siRNA was measured by ELISA kit. The expressions of Islet1, Ins and Pdx1 gene were detected by ChIP-qPCR. Their levels of proteins were analyzed by Western blot. Results:E1 of β-TC6 cell reduced under high glucose load (P <0.05). The amount of acetyl-CoA decreased after β-TC6 cell was transfected with EI-siRNA (P < 0.05). The gene expression and their protein levels of Islet, Ins and Pdx1 were significantly inhibited (P < 0.05).Conclusion:High glucose condition will cause damaging of PDC, decreasing production of acetyl-CoA, suppressing expression of Islet, Ins and Pdx1 gene and their proteins, which lead to insulin secretion deficiency.
【Key words】Pyruvate dehydrogenase complex; Acetyl-CoA; High glucose; Insulin secretion disorder
丙酮酸脱氢酶复合体（Pyruvate Dehydrogenase Complex, PDC）是一种催化丙酮酸脱羧反应的多酶复合物，由丙酮酸脱氢酶（E1）、二氢硫辛酸转乙酰基酶（E2）、二氢硫辛酸脱氢酶（E3）和六种辅助因子组成[1]。
其活性的调控主要通过E1的磷酸化和去磷酸化来实现[2]。
过去认为PDC在哺乳动物体内仅存在于线粒体中，作为线粒体基质内的重要的多酶复合物，利用饮食中的碳水化合物生成乙酰辅酶A产生能量[3]。
但有研究发现PDC同样参与了细胞核内乙酰辅酶A的
生成，而在细胞核中，PDC参与生成乙酰辅酶A是为了实现组蛋白乙酰化[4, 5]。
Chakrabarti[6]等研究阐述了组蛋白乙酰化在调控胰岛素基因的表达中的重要作用，并发现胰岛β细胞胰岛素基因启动子邻近区域的组蛋白H3乙酰化水平明显升，与糖尿病的发生关系密切[7]。
同时Bajotto[8]和Wu[9]等发现2型糖尿病的发生发展伴随着PDC活性下降，并与胰岛素抵抗呈平行性改变[9]。
由此我们猜测PDC可能参与了胰岛β细胞核中乙酰辅酶A的生成及其组蛋白的乙酰化，进而影响胰岛素分泌及其相关基因和蛋白的表达。
目前还没有相关研究能够证明高糖引起的胰岛素分泌障碍[11, 12]与上述过程有关。
因此，本研究以PDC为切入点，探讨核内的PDC在高糖引起的胰岛素分泌障碍中的作用机制，为二型糖尿病的预防与治疗找到新的视角。
1 材料与方法
1.1 材料、试剂和仪器
小鼠β-TC6胰岛β细胞系（购买于中国科学院上海细胞库）；DMEM 高糖培养基、PBS（以色列Biological Industries公司）、FBS和胰蛋白酶（Gibco公司）；Lipofectamine2000转染剂（Invitrogen公司）；RT-PCR试剂盒、引物（上海生工）；E1活性检测试剂盒（苏州科铭生物技术有限公司）；ELISA试剂盒（美国eBioscience公司）；CHIP Assay Kit（Millipore 17-245RF）；快速DNA产物纯化试剂盒和UltraSYBR Mixture（Low ROX）（康为世纪）；Anti-Histone H3 (acetyl K27)、ISLET1、INS、PDX-1抗体（英国Abcam公司）；HRP标记的山羊抗兔抗体ΙgG二抗（美国Proteintech公司）；苯甲基磺酰氟
（PMSF，德国Merck公司）、RIPA裂解液和BCA蛋白定量试剂盒（北京普利莱）。
二氧化碳培养箱（HF90上海力申科学仪器有限公司），实时荧光定量PCR仪（CFX96）、小型垂直电泳槽、小型蛋白转运槽、电泳仪（美国Bio-Rad公司产品）；细胞破碎仪（VCX800）（SONICS公司产品）；倒置显微镜（德国徕卡）。
1.2 方法
1.2.1 β-TC6细胞培养与干预
β-TC6细胞培养于含有15%FBS的高糖DMEM培养基中，于37℃，5%CO2饱和湿度培养箱中培养，当细胞汇合率达80%左右时，用0.05%胰酶消化细胞，一分为二进行细胞传代。
将处于对数生长期的β-TC6细胞同等密度分别接种于60nm培养皿中，37℃、5%CO2饱和湿度细胞培养箱中培养24h，弃上清。
设定空白组（培养基不额外添加葡萄糖），对照组（添加5.5mmol/L葡萄糖），高糖组（添加33.3mmol/L葡萄糖）培养72h。
收集细胞，采用E1活性检测试剂盒检测E1活性。
根据样品的蛋白浓度Cpr，按照公式E1活性=1904*△A/Cpr计算各实验组的E1活性。
1.2.2 β-TC6细胞的转染
将处于对数生长期的β-TC6细胞接种于六孔板，采用新鲜不含抗生素的培养基培养（800μL/孔），待细胞长至90%融合时，预备转染。
将200μL无血清DMEM 高糖培养基和5μL 20μmol/L siRNA （siRNA序列见表1），800μL无血清DMEM 高糖培养基和20μL 1mg/mL的lip2000转染试剂分别混合。
室温静置5min，将两种混合液等体积混合，静置20min。
将上述混合好的siRNA-lip2000复合物
加入到六孔板对应培养孔中，于37℃，5%CO2饱和湿度培养箱中培养5h，去除含siRNA培养基，更换完全新鲜的培养基，继续培养48h。
表1 各基因位点siRNA序列
名称siRNA序列
E1-siRNA序列
Sense GGUCAGAUCUUUGAAGCUUTT
Antisense AAGCUUCAAAGAUCUGACCTT
Scrambled siRNA Sense UUCUCCGAACGUGUCACGUTT Antisense ACGUGACACGUUCGGAGAATT
1.2.3细胞核内乙酰辅酶A的检测
将E1-siRNA或Scrambled siRNA处理的β-TC6细胞，采用无葡萄糖培养基培养24h后，分离提取细胞核。
加入丙酮酸（10mmol/L）培养8h后，ELISA试剂盒检测细胞核内乙酰辅酶A的水平。
1.2.4染色质免疫共沉淀实时荧光定量核酸扩增技术（ChIP-qPCR）检测Islet1、Ins、Pdx1的基因表达
将E1-siRNA或Scrambled siRNA处理后的β-TC6细胞，利用染色质免疫共沉淀（ChIP）技术特应性地富集目的蛋白结合的DNA片段，并采用DNA产物纯化试剂盒对其进行纯化，得到纯化DNA产物。
用q-PCR法检测纯化产物Islet1、Ins、Pdx1基因表达（引物序列见表2）。
表2 引物序列表
名称序列
Islet1 Sense TTACCTTTTCGTTTGACCTTTGC Antisense ACCCTGTTACTCCCCAATCTGAG
Ins Sense TCAGGCCATCTGGTCCCTTA Antisense CCTGGACTTTGCTGTTTGGC
Pdx1 Sense AAACAAGTGCAGGTGTTCGC Antisense CCCCAGATCGCTTTGACAGT
1.2.5 Western Blot法检测各组ISLET1、INS和PDX1蛋白的水平
将E1-siRNA或Scrambled siRNA处理后的β-TC6细胞加入80μL 含PMSF的RIPA裂解液，裂解细胞提取蛋白，用BCA蛋白定量试剂盒检测蛋白浓度。
Western Blot法测定各组ISLET1、INS和PDX1蛋白的表达水平。
2 统计学分析
采用SPSS 21.0软件进行统计处理，正态分布的计量资料采用均数±标准差（⎺X±S）表示，各组数据采用单因素方差分析，组间多重比较用LSD-t 法。
p<0.05时差异有统计学意义。
3 结果
3.1高糖培养对胰岛β细胞PDC活性的影响
方差分析显示空白组、对照组和高糖组中E1活性差异有统计学意义（F=27.775，P<0.05）。
与对空白组相比，高糖组的E1活性下降（P<0.05）；与对照组相比，高糖组E1活性明显降低（P<0.05）（表3）。
由此表明，高糖刺激能够抑制E1的活性，进而引起胰岛β细胞内PDC损伤。
表3高糖培养对PDC活性的影响
分组样品例数⎺X±S (μg/mL)
空白组 4 13.9028±2.0445
对照组 4 21.6227±2.1827
高糖组 4 10.2096±2.3894 *#
3.2 PDC受损对乙酰辅酶A生成量的影响
采用siRNA技术沉默E1后，方差分析显示空白组、Scrambled
siRNA组及E1-siRNA组细胞核中乙酰辅酶A的生成量差异有统计学意义（F=159.703，P<0.05）。
LDS-t法两两比较显示，空白组与Scrambled siRNA组，差异无统计学意义（P>0.05）；空白组与E1-siRNA组、Scrambled siRNA组与E1-siRNA组间，差异均有统计学意义（P <0.05）（表4）。
由此表明，细胞转染后引起PDC损伤，影响了细胞核内乙酰辅酶A的生成。
表4 ELISA法中各样品中乙酰辅酶A含量
分组样品例数⎺X±S (μg/mL)
空白组12 1.7247±0.0309
Scrambled siRNA组10 1.7289±0.0301
E1-siRNA组10 1.0205±0.0340*#
与空白组比较p<0.05；与Scrambled siRNA组比较p<0.05
3.3染色质免疫共沉淀实时荧光定量核酸扩增技术（ChIP-qPCR）检测Islet1、Ins、Pdx1基因表达
由图1可见，细胞转染后E1-siRNA组的Islet1、Ins和Pdx1基因表达与Scrambled siRNA组相比，差异均有统计学意义（P<0.05）。
PDC受损后Islet1、Ins和Pdx1基因表达较未受损的细胞相比明显受到抑制。
由此可以表明PDC与β-TC6细胞的Islet1、Ins和Pdx1基因的组蛋白乙酰化有关。
图2 PDC受损对Islet1、Ins和Pdx1基因表达的影响
3.4 PDC受损对ISLET1、INS和PDX1蛋白的影响
Western Blot法检测细胞转染前后ISLET1、INS和PDX1蛋白水平，方差分析显示三组的ISLET1（F=112.786，P<0.05）、INS （F=372.091，P<0.05）、PDX1（F=170.793，P<0.05）的蛋白表达水平，差异均有统计学意义（表5）。
LDS法两两比较显示，E1-siRNA 组与Scrambled siRNA组和空白组相比，三组蛋白的表达水平均降低（P<0.05）（图2）。
由此说明，PDC受损细胞内的ISLET1、INS、PDX1的蛋白水平较PDC未受损时降低。
表5 PDC受损对胰岛素分泌相关基因蛋白相对表达量的影响（n=4⎺X±S ）蛋白种类空白组Scrambled siRNA组E1-siRNA组ISLET1/Actin 0.2267±0.0115 0.2100±0.0100 0.0867±0.0153*#
INS/Actin 0.4767±0.0153 0.4467±0.0058 0.2500±0.0100*# PDX1/ 0.4733±0.0153 0.4200±0.0173 0.2167±0.0120*#与空白组比较p<0.05；与Scrambled siRNA组比较p<0.05
ISLET1:胰岛素增强结合因子-1（Insulin gene enhancer binding protein 1）
INS:胰岛素（Insulin）
PDX1:胰岛素启动子因子-1（Pancreatic duodenal homeobox-1）
图2 各组胰岛β细胞中PDX1、ISLET1和INS蛋白表达电泳图
4 讨论
胰岛β细胞具有合成及分泌胰岛素的功能，是机体调节糖、蛋白质及脂肪代谢的重要保障[13]，其损伤程度是胰岛素分泌障碍发生发展的一个重要因素[14]。
长期高糖会损伤胰岛β细胞，使胰岛素分泌障碍[15, 16]，本次研究发现长期高糖状态还会引起β-TC6细胞E1活性下降，
间接表明长期高糖状态会使PDC功能受损。
PDC作为丙酮酸转化为乙酰辅酶A的关键酶，与乙酰辅酶A关系密切，其损伤会直接影响乙酰辅酶A的生成[17, 18]。
本研究采用siRNA技术沉默PDC后，检测β-TC6细胞核内乙酰辅酶A的生成量，发现E1-siRNA组的乙酰辅酶A的含量明显低于未处理组和Scrambled siRNA组。
进一步证实PDC不但存在于线粒体中，它还存在于细胞核中，参与核内乙酰辅酶A的生成。
该研究结果与Sutendra G等的研究结论一致[4]。
核内的乙酰辅酶A又与组蛋白乙酰化密切相关，组蛋白乙酰化直接参与基因活化组蛋白翻译后修饰所引起的染色质结构重塑，在真核生物基因表达调控中发挥着十分重要的[19, 20]。
进一步检测Islet1、Ins和Pdx1的基因表达发现PDC受损后细胞中Islet1、Ins和Pdx1的基因表达较未受损的细胞相比明显受到抑制。
ISLET1是最早的胰岛素增强结合蛋白，对于促进胰岛内分泌细胞发育、成熟和存活具有重要作用，可在胰腺内分泌细胞中高水平表达，并可通过与不同因子之间的相互作用，激活多种内分泌激素相关基因的转录[21]。
INS是一种由胰腺β细胞分泌的蛋白质激素，也是机体内唯一降低血糖的激素。
PDX1是胰岛β细胞分化中至关重要的转录因子，其主要功能是促进胰岛β细胞增殖，抑制胰岛β细胞凋亡，调节胰岛素基因等相关特异性基因的转录[22]。
这几种蛋白都对于胰岛β细胞功能的稳定及糖尿病的发生、发展均具有重要意义。
继续采用Western Blot法检测细胞转染前后ISLET1、INS和PDX1的蛋白水平发现PDC受损后细胞中的ISLET1、INS和PDX1蛋白表达水平明显较未受损者降低，并与基因表达结果相一致。
综上所述，高糖引起的β胰岛细胞内胰岛素分泌障碍与其细胞核内PDC损伤有关。
PDC损伤抑制了核内乙酰辅酶A的生成，阻碍了组
蛋白的乙酰化，进而抑制了Ins基因转录起始，同时对其相关的调节基因也产生了抑制，最终引起INS分泌障碍。
因此，维持PDC的活性可以直接或间接促进胰岛素及其分泌相关基因的转录，促进其相关蛋白的表达。
该结论不仅为进一步探寻糖尿病的发病机制找的新的切入点，也为糖尿病的预防和治疗提供了新的靶点。
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