引物设计Premier Primer 5

生物软件应用论文

引物设计软件Premier Primer 5

姓名 宋瑞雪 __

学号 20107610833

引物设计软件Premier Primer 5

生物信息处理班 宋瑞雪 20107610833

PCR引物设计引物设计的目的是为了找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。

PCR反应中有两条引物，即5′端引物和3′引物。设计引物时以一条DNA单链为基准（常以信息链为基准），5′端引物与位于待扩增片段5′端上的一小段DNA序列相同；3′端引物与位于待扩增片段3′端的一小段DNA序列互补。

引物设计的基本原则：

1、引物Tm：引物所对应模板序列的Tm 值最好72℃左右。至少要在55－80℃之间。Tm=2(A+T)+4(C+G)。

2、引物长度：大多数应用的最短引物长度为18个核苷酸。如果期待的产物长度等于或小于500 bp，选用短的(16～18)的引物；若产物长5 kb，则用24个核苷酸的引物。有人用20～23个核苷酸引物得到40 kb的产物。

3、引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C 过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。

4、ΔG(自由能)值：ΔG值反映了引物与模板结合的强弱程度。引物的ΔG值最好呈正弦曲线形状，即5’端和中间ΔG值较高，而3’端ΔG值相对较低，且不要超过9（ΔG值为负值，这里取绝对值），如此则有利于正确引发反应而可防止错误引发。

5、两个引物之间不应存在互补序列，尤其是避免3 ′端的互补重叠,引物内部不应出现互补序列。

6、引物与非特异扩增区的序列的同源性不要超过70%，引物3′末端连续8个碱基在待扩增以外不能有完全互补序列，否则易导致非特异性扩增。

7、引物3‘端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，最佳选择是G和C。

8、引物的5 ′端可以修饰。如附加限制酶位点，引入突变位点，用生物素、荧光物质、地高辛标记，加入其它短序列，包括起始密码子、终止密码子等。

引物应具有特异性

引物设计完成以后，应对其进行检测。如果与其它基因不具有互补性，就可以进行下一步的实验了。

以具有解暑止渴、消食止泻之功，为夏令医食兼优的时令佳果的菠萝为例，

选取具有OPAE 14标记，长度为1005bp的基因组序列： 图1

打开其FASTA格式的序列，保存至1.txt文件中。打开Primer Premier5，点击file--->open --->DNA Sequence.(如图2所示)

图2

在之后在出现的页面中，在Drive中选取存放序列信息的磁盘位置，选取文件类型为“*.txt”，在all file选中存放序列信息的文件1.txt，点击,再点击，如图3所示：

图3 (序列比较)窗口可以将已经打开的序列进行比较，序列选择框显示所有将要比较的序列使用Add 和Delete 按钮可以增加一个序列或移除一个序列，使用Options 按钮可以打开序列比较的参数设置窗口。此处就不再进行比较了。

此时就进入引物设计阶段（图4 ）

图4

点击，Primer Premier会在引物窗口显示序列比较，这样很容易知道引物与每一特定序列有哪些错配位点，点击序列任一地方将根据保守序列产生一条引物并加以分析引。分析是否产生发夹结构（Hairpin）、二聚体（Dimer）错配（False Priming）以及交叉二聚体（Cross Dimer ） 等二级结构。

表示没有产生这些结构，表示产生这类的结构。

当将鼠标指针移至Direct Select（ 即点即选框）中指针将变为铅笔型,点击框中任何一处会产生一条起始位置最接近点选位置并与原序列互补的引物,所有引物性状将即时更新,引物5 和3 末端也会标记上以区分引物的扩增方向。如图5：

图5

性状列表能自动更新正反引物的长度、起始位置、融链温度（Tm ）、GC含量（GC% ）多义性、比吸光度（Optical Activity ，单位ug/OD） 对于引物对来说长度条显示了PCR产物的长度而Ta Opt项显示了PCR反应适宜的退火温度。

图5中显示出现错配和交叉二聚体结构的信息，点击或者我们会看到出现这些结构的具体信息，比如开始的位置，产生的自由能。按照稳定性大小自动排序，最稳定的一种排在最前。如图6：

图6

设计用于定点突变的引物或分析一条已有引物序列可以用，他可以改变引物中任何一个氨基酸，从而对引物进行修改。此外它也提供了限制性酶分析功能，可以通过点击Enzyme 按钮通过手动或软件提供的筛选方案来选择一组限制性酶如图7：

图7

点击，显示Search Criteria （搜索标准）窗口，在显示的窗口中可以对设计的引物参数进行改，比如搜索的类型、上（下）游引物开始位置，PCR的长度、引物的长度等等。最后可以设定Search Mode （搜索模式）为自动或手动，如果有很特殊的要求或想完全控制特定的搜索参数则最好使用自动搜索。如图8

图8 点击（搜索参数）窗口可以查看和修改参数信息如图9

图9

如果是搜索测序引物则相应参数会有所不同，具体列表如图10

图10

如果是搜索杂交探针,则相应参数如下图

图11

可以在激活False Priming选项，从而使搜索的引物不会与其它存在与反应中序列发生错配，可以利用按钮选择这些序列文件。

引物设计的最优设计是不出现发夹结构、二聚体、错配以及交叉二聚体。可以对设计的引物参数进行修改得到最优设计。修改范围如图12所示

图12 点击显示搜索结果，显示结果按照评估分数从高到低向下排列，一般选取评估分数较高的结果。打分是衡量引物质量的综合性参数，利用打分系统可以对引物进行有效评估和引物间进行对比选择提供有效的证据。

图13

选取评估分数较高的结果，点击就可显示引物的详细信息如图14：

图14

点击Graph——>GC%会显示此引物的GC含量（图15）

图15 也可以点击或查看相应的Tm值和引物内部的稳定性。

使用Reports菜单可以提供多种分析报告，它可以直接打开的二级结构报告也可以提供当前引物的内部稳定性图表和比吸光度。

选择Reports——>Optical Activity选项能打开一个报告窗口显示当前引物对的分子量和比吸光度(activity 单位nmoles/OD和ug/OD)。

选择Reports——>Hybridization Time 杂交时间选项可以输入引物的长度和浓度点击Analyze 按钮可以得到杂交时间。如图16

图16

点击Funtion——>Save to Database

再在引物数据库窗口中使用（Get Marked Primers）按钮将标记的引物全部输入到数据库“boluo”中，也可以直接选择一条或一对引物,再利用Current

Primer Pair (当前引物)对图框将其输入数据库,从下拉菜单里选择一个引物数据库，使用按钮输入以往保存的引物。引物数据库可以保存引物的起始位置序列、对应链和引物名称。蓝色为上游引物，红色下游引物。（图16）

使用（Add Primer） 按钮可以添加一条新引物同时激活一个窗口用来填写引物名称、起始位点、对应链和引物序列，如果不指定起始位置则默认为5 末端第一个碱基。此即为关于菠萝的引物(图17):

图17

还可以进行简并引物设计即从已知蛋白质到相关核酸分子的研究及用一组引物扩增一类分子

Translated DNA 从原始的蛋白序列推导DNA序列或由原始DNA翻译出蛋白序列再由蛋白序列反推出的DNA序列

Translated Protein 从原始DNA翻译而成蛋白序列或原始蛋白序列翻译出DNA序列再由DNA序列反推出蛋白序列

推导DNA按钮 当前序列为原始或推导DNA时,该按钮不可用。当前序列为蛋白序列时,点击该按钮将会激活一个Codon Table Selection窗口您可以选择密码子列表和阅读框。

总结与体会:

1、在整个引物设计过程中，最难找的就是第一步基因组序列的寻找，有些DNA序列直接复制或者从文件中打开后会出现错误的序列，如下图所示，我同学说可能是因为这个序列中含有叶绿体基因所导致的，也专门找了一些叶绿体基因运行，确实会出现这种状况，但是我还是不太明白，也没有得到证实。

此外，有时对随机挑选的某个个体的基因序列来说是不容易找不到最优的引物的，这就需要对大量的序列进行逐个的测试,就如本文中的例子，我经过一次又一次的寻找，终于找到了能得到引物的序列，其实这个引物设计的也不算太好，因为它没有达到最优，所以说这个引物设计的还是有点失败的。

2、在引物设计过程中，前几十个碱基都是不可信的，设计的引物最好离阅读框稍微远一点，可以根据不同实验的具体的要求输入合适的引物长度范围。

3、Search Mode （搜索模式）最好使用自动搜索。这样我们可以完成特殊的要求或完全控制特定的搜索参数。

4、默认情况下Automatic Search(自动搜索)会自动设置了一些数值，但是我们可以根据具体实验选择在自动搜索中需要使用哪些参数，点击“レ”可以去掉相应参数，此时该参数在搜索中不会被考虑。

5、自动搜索开始的标准很严格，但如果没有找到合适的引物，则标准会自动降低直到找到合适的引物，Tm值范围是根据指定搜索范围中所有可能引物的Tm平均值确定的。

6、二聚体是相同或不同的两条引物之间形成的二级结构，它造成引物二聚体扩增并减少目的扩增产物，二聚体可以在序列相同的两条引物或正反向引物之间形成，3 ’末端配对很容易引起引物二聚体扩增，可以使用Dimer Report功能预测二聚体的形成。

7、此外，该软件还有限制性内切酶分析和基序分析的功能，利用它的高级引物搜索，引物数据库，巢式引物设计，引物编辑和分析等功能，可以设计出有高效扩增能力的理想引物，也可以设计出用于扩增长达50kb以上的PCR产物的引物序列。可以说是帮助人们设计最适合引物的不可多得的应用软件。