SPF级鸡胚成纤维细胞(CEF)的制备

鸡胚成纤维细胞（CEF）的制作及细胞培养（一）CEF的制备1. 实验试剂1×DMEM（不含丙酮酸钠）、小牛血清、高压过的PBS、胰酶、双抗。

2. 实验设备和材料酒精灯、酒精喷壶、酒精棉、打火机、计时器、一次性手套废液缸、镊子、细胞瓶、50 mL试管架、50 mL离心管、1000ul 移液枪及枪头、100 uL移液枪及枪头、塑料吸管、一次性培养皿、SPF鸡胚（9-11日龄均可）将3把小镊子、1把剪刀、1个50 mL离心管、1个玻璃培养皿放入一个大号饭盒内；取一中号锥形瓶，瓶口由内到外分别盖上6层纱布、锡箔纸、报纸包好，高压30 min备用。

3. 实验步骤（1）将所用材料放入超净工作台（小牛血清及胰酶除外），紫外照射30 min。

（2）用镊子取出高压过的平皿、镊子，倒入PBS液；（3）酒精消毒气室处蛋壳，去除蛋壳，撕开壳膜、尿囊膜和羊膜，取出鸡胚，置于培养皿中用镊子去除头、四肢和内脏，并将胚体置于另一个培养皿中冲洗干净；（4）将胚体置于高压过的50 mL离心管内，略水平放置，用剪刀充分剪碎，越碎越好；（5）加入胰酶（5 mL/个），37℃水浴锅内消化5-8 min，待胚体呈绒毛状即可，吸除消化液；（6）加入30 mL含10%血清的DMEM，充分吹打，静置片刻，过滤至锥形瓶内；（7）重复第六步；（8）分装至培养瓶或将细胞按1.2×106 cells/well传到6孔板中，每孔 2 mL。

（二）细胞冻存（1）倒去细胞上清液，加入PBS洗去残留的培养基，洗两次。

（2）加入0.25%的胰酶，消化10-20 s后倒去。

（3）1瓶细胞加入1 mL培养基吹打均匀，吸入到离心管中。

（4）将细胞离心，1000 rpm，2-3 min。

（5）根据计数结果加入细胞冻存液（70%完全培养基+20% FBS+10% DMSO）重悬细胞，一般两瓶细胞冻存三管（FBS越高，细胞复苏时活力越大）。

DMSO一定要配成10%。

消化法制备CEF
1.取9-10日龄的SPF鸡胚，将鸡胚气室部依次用碘酊、酒精棉球消毒。

用镊
子将蛋壳击破，划破内膜，拉出鸡胚，放在已被干烤过的平皿中，去眼、脑、喙、翅、爪和内脏。

2.用PBS反复洗胚体2-3遍，用镊子加入一个小锥形瓶内。

3.向锥形瓶内加入适量胰酶（8ml/胚）和电磁搅拌棒，封口，轻轻混匀后置37℃
温箱中电磁搅拌15 min（快速搅拌30s打碎胚体，然后以大约15-30 rpm的速度搅拌15min）。

4.准备100mL或200mL盐水瓶，加入适量小牛血清（用以中和胰酶，胰酶体
积的1/20，例：1个胚，共用胰酶8mL+4mL+4mL，因此加入血清≥0.8mL)，无菌操作。

5.取出锥形瓶，稍作静置，将一半左右的上清倒入（吸入）盐水瓶中。

于锥形
瓶内补加入适量胰酶（4ml/胚），轻轻混匀后置37℃温箱中以大约15-30 rpm 的速度搅拌15min。

6.（可选）取出锥形瓶，稍作静置，将一半左右的上清倒入（吸入）盐水瓶中。

于锥形瓶内补加入适量胰酶（4ml/胚），轻轻混匀后置37℃温箱中电磁搅拌10min。

7.取出锥形瓶，静置5min，将大部分的上清倒入（吸入）盐水瓶中。

离心1000rpm 15min。

8.吸弃上清，按10ml/胚的量加入生长液（G），吹打混匀，（大于100次）。

9.8-16 层纱布过滤。

10.台盼蓝计数。

细胞浓度=大方格（即4x4个小格）细胞数x10万/mL
11.分装小方瓶：600-700 万（3-4ml 生长液培养基），转瓶：2亿/瓶。

用鸡胚成纤维细胞生产传染性喉气管炎活疫苗的工艺探索摘？要：《兽医生物制品规程》中规定鸡传染性喉气管炎活疫苗的生产及生产用种毒的繁殖都是接种spf鸡胚，收获绒毛尿囊膜来进行的。

spf鸡胚价格昂贵，绒毛尿囊膜产量少，挑膜工艺容易污染，造成损失和浪费。

用鸡胚成纤维（cef）二代细胞代替鸡胚绒毛尿囊膜制备生产用种毒及疫苗，所制备的种毒及疫苗各项指标均符合《规程》规定的标准，提高了疫苗的批产量，降低了生产成本。

关健词：spf鸡胚；绒毛尿囊膜；cef传代细胞；疫苗批产量鸡传染性喉气管炎（k317株）活疫苗的传统生产方法是接种spf 胚，收获感染的鸡胚绒毛尿囊膜制备而成，绒毛尿囊膜接种法工艺繁琐，制备人工气室不仅耗费时间长，而且合格率达不到100%，收获时污染率高，尤其是气候炎热的季节污染率更高，造成不必要的损失和浪费，加大了生产成本。

用鸡胚成纤维传代细胞代替鸡胚绒毛尿囊膜生产该疫苗，生产工艺容易掌握和控制，可批量生产，节约了鸡胚的使用量，降低了生产成本。

1 材料1.1 鸡传染性喉气管炎（k317株）基础种毒（膜毒），由本公司质管部提供。

1.2 spf鸡胚，购自北京梅里亚维通实验动物有限公司，25日龄、40日龄spf鸡，由生产车间孵化。

1.3 cef由细胞组制备。

2 方法2.1 细胞制备2.1.1 cef原代细胞制备按《规程》方法进行，所不同的是用冷消化方法，消化过程在4℃进行。

2.1.2 cef二代细胞制备 cef原代细胞长成致密单层后，按常规方法进行传代，可连续传3代，二代细胞和原代细胞相比，杂细胞和细胞碎片少，细胞更加纯净，细胞活力好，产毒效价高。

细胞产量大，减少鸡胚使用数量，降低成本。

2.2 生产用种毒制备基础种毒按0.5～1%接种cef二代细胞，37℃吸附1小时，补足细胞维持液，37℃培养，96～120小时收获，如此方法连续盲传，直至出现典型有规律的细胞病变（cpe）为止，病毒液冻融两次，-20℃保存备用。

鸡胚成纤维细胞的制备一、材料和试剂1、鸡胚：9-10日龄发育良好的SPF胚2、试剂：0.25％胰酶，MEM培养基，新生牛血清，1万IU双抗，3%谷氨酰胺，7.5%碳酸氢钠3、仪器和器材：，带6-8层纱布的100ml烧杯两个，直径9cm的平皿两个，中号镊子四把，倒置显微镜，培养箱，50ml细胞培养瓶，10ml刻度吸管两根、5ml刻度吸管，250ml生理盐水瓶两个，无菌的细胞培养瓶，灭菌好的PBS，酒精棉球，废液缸等二、操作步骤1、操作前的准备：○1预热培养用液：把已经配制好的装有培养液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴锅内预热。

○2用75％酒精擦拭经过紫外线照射的超净工作台和双手。

○3正确摆放使用的器械：保证足够的操作空间，不仅便于操作而且可减少污染。

○4点燃酒精灯：注意火焰不能太小。

○5准备好将要使用的消毒后的培养瓶。

○6取出预热好的培养用液：取出已经预热好的培养用液，用酒精棉球擦拭好后方能放入超净台内。

2、成纤维细胞制备：①将选好的9-10日龄的发育良好的SPF胚用5%的碘棉消毒蛋壳气室部位，再用酒精棉脱碘。

②无菌取出鸡胚，放入灭菌的玻璃皿内，用PH7.2的PBS冲洗一次，去头，四肢和内脏。

③再用PH7.2的PBS冲洗两次。

④用镊子捏成小块（2-3mm3）, 用PH7.2的PBS冲洗两次。

⑤鸡胚约加4ml0.25%胰酶溶液，38℃消化30min，期间15min轻摇一次。

⑥期间配制细胞培养液：培养基：MEM双抗：2%7.5% 碳酸氢钠：2%牛血清：6%3% 谷氨酰胺：1%⑦消化结束，弃掉胰酶消化液，用PH7.2的PBS冲洗两次，再用细胞生长液冲洗一次。

⑧加入适量的细胞生长液，用刻度吸管反复吹打（使细胞充分分散）。

⑨将细胞分散液倒入带6-8层纱布的100ml烧杯中（过滤之前先用少许细胞培养液润湿纱布），加入适量培养液（40ml/胚），过滤。

⑩重复步骤⑨的操作重虑一遍。

11计数，要求每1ml滤液中约含活细胞100万-150万个。

CEF的制备一．实验材料1．试剂：0.5M EDTA，D-Hanks/PBS，1.25M 胰酶，犊牛血清，双抗/两性霉素2. 工具：恒温磁力搅拌器，酒精灯，锥形瓶，普通镊子，眼科剪，眼科镊，平皿，灭菌铜网，蛋托，碘酒棉，酒精棉二．实验步骤1. 胰酶工作浓度的配制要求浓度：Trysin 0.025%，EDTA 0.0015M3. 挑选鸡胚选取9-11日龄鸡胚，把照蛋器放在气室位置于暗室内观察，看是否是白蛋或死胚，挑取活性较好的鸡胚备用。

4．处理鸡胚将鸡胚气室朝上置于蛋托上，用镊子夹取碘酒棉消毒气室部位，然后用酒精棉擦拭消毒，用普通镊子轻敲碎气室上的蛋壳，小心去除，不要触及尿囊膜。

然后换用眼科镊从开口一端向另一端撕下尿囊膜，此时露出蠕动的鸡胚，用眼科镊准确夹住鸡胚转移至灭菌平皿中，用眼科剪去除头四肢和内脏后，用适量PBS冲洗一下鸡胚，转移至小烧杯中用PBS冲洗后转移至锥形瓶中。

5．消化在锥形瓶中加入15 ml工作浓度的胰酶，将锥形瓶置于电恒温磁力搅拌器上的水浴锅中，调整温度为37度，计时消化10分钟。

此时准备铜网，将铜网放在锥形瓶口，现在锥形瓶中加入3ml犊牛血清。

10分钟后，将上清细胞悬液通过铜网过滤至锥形瓶中，轻微混匀。

再加入10ml胰酶于锥形瓶中消化10分钟，10分钟重复以上操作（一般消化3-4次，直到消化完全为止）。

6. 离心将悬液平均分于10ml离心管中，1000 rpm 离心 6 min，倾去上清，用3-5 ml5%DMEM重悬细胞后合并于一支10ml离心管中，再加1 ml的犊牛血清吹打混匀。

7．计数用灭菌吸头取50微升细胞悬液加920微升PBS，再加30微升的台盼蓝，吹打混匀（稀释20倍）计数。

每毫升的细胞量：数四个大格总数/4×20×104。

一种鸡胚成纤维细胞快速制备与保存方法的研究作者：赵海棋高庆芳张泽恺苗立中刘建钗苑文娴唐娜来源：《家禽科学》2023年第11期摘要：为了进一步提高鸡胚成纤维细胞（Chicken embryo fibroblast，CEF）的制备效率和活力，试验以短时多次消化法缩短胰酶消化时间，提高细胞活力。

同时，通过优化血清、胰酶、培养基等保存条件，增加细胞4 ℃保存时间。

经CCK-8细胞活性检测、活细胞计数、传代培养等方法比较验证，结果表明，所建立的制备方法简易、快速、细胞活力高；细胞在4 ℃、不添加血清和胰酶的DMEM培养基中保存96 h内仍保有良好的贴壁生长能力。

该方法的建立为实验室内快速制备CEF细胞提供候选方案，可有效减少鸡胚的使用。

关键词：鸡胚成纤维细胞；细胞制备；细胞保存; 原代细胞；细胞培养作为细胞生物学试验研究中的一个重要环节，细胞培养技术被广泛应用于现代生物工程、生命科学和药物研发等领域，原代细胞也已成为基本的细胞生物学试验研究样品，在生理学、细胞生物化学、药学、毒理学等研究领域广泛应用。

其中，鸡胚成纤维细胞（Chicken embryo fibroblast，CEF）因具有适应性强、繁殖速度快、来源广、成本低等优势，被大量应用于生物工程研究与疫苗生产中，多种常见的病毒如禽马立克病毒（Marek’s disease virus，MDV）[1]、传染性法氏囊病毒（Infectious bursal disease，IBDV）[2]、火鸡疱疹病毒（Herpesvirus of turkey，HVT）[3]等的研究都以CEF为重要材料。

目前，实验室制备CEF需要现用现制，大量使用鸡胚，既增加受污染的风险，也不利于动物福利，还给试验研究带来额外的工作量。

因此，通过多次试验，本研究尝试建立一种快速、小量制备鸡胚成纤维细胞的候选方案，在保障细胞活力、提高制备效率的同时，能够降低受污染风险，且可短期保存细胞，从而减少制备次数和鸡胚使用量。

鸡胚成纤维细胞（CEF）、鸭胚成纤维细胞(DEF)培养一、材料9¬10日龄鸡胚13¬14日龄鸭胚眼科剪、镊、外科镊、巴氏吸管、蛋架、灭菌平皿 25ml小三角瓶Hanks＇液 0.25%胰酶液 Versene液灭菌纱布、玻璃漏斗、0.1% 结晶柠檬酸（0.1M）或0.4%台盼兰,血球计数板、60ML培养瓶或60ML培养皿、灭菌盖玻片、营养液。

二方法（CEF为例）鸡胚理：取9¬10日龄鸡胚直于蛋架，在气室部用于5%碘酊棉消毒，再用洒精棉脱色，用外科镊击破蛋壳用眼科镊取出胚体放于平皿内，去喙瓜眼和内脏，用Hank＇s液洗两次，用弯头眼科剪剪胚剪成1-2mm的碎块，加Hank’s液20ml,略加摇振，静置使组织块下沉，将混有红血球及碎片的上悬液吸去，重复洗2—3次，直至上悬液不混浊为止。

2、消化：将0.25%胰蛋白酶溶液用5、6%NaHCO2滴定至PH7、6—7、8，加热至37度，按组织块量3—5倍加于装有鸡胚碎块的三角瓶中，每个鸡胚约需胰酶5ml，30分钟取出，静置1—2分钟，吸去胰液，再加HanK’s 液20ml，轻轻摇动后吸去，如此反复两三次，目的是洗去残余的胰酶。

第三次加入营养液，每胚3ml左右，用粗口吸管吹吸数次，使细胞脱落分散。

静置1—2分钟，候组织下沉后，细心将细胞悬液吸出，另置一只25ml三角瓶，如此反复数次，使细胞尽量自组织块脱落，将多次取得的悬液合并一处，纱布过滤悬液。

必须注意每次吹吸一般6—7次为宜，太多则细胞受损，消化时间要灵活掌握，不足细胞不易掊落，太久则细胞破碎。

在消化过程中，摇动时组织不易下沉即立即停止，消化后如组织粘连如涕，证明消化过度。

二、细胞计数：取细胞悬液0.1（100ul）置盛有0.9ml10.4%台盼蓝的试管中混合,用血球计数板计数。

计算方法：4大方格细胞数每ml细胞数=——————————————X10（5）45中格细胞数或每ml细胞数=——————————X10（4）三：接种以营养液配成每ml10（6）细胞（最终稀释度）接种链霉素瓶（1ml）、60ml瓶（8—10ml），100mm dish（10ml），60mm dish（4ml），37度孵育48小进后形成单层，接种病毒或作次代培养。

取孵化9-10日龄的鸡胚，碘酒→酒精消毒→取出鸡胚→放入盛有Hank’s液的灭菌平皿内→用Hank’s液洗三次→将鸡胚去内脏、爪、翅、头部→再用Hank’s液洗2次胚体→用镊子将胚体夹碎→将夹碎的胚体用镊子夹到培养瓶中→加0.25%胰酶消化液（2ml/胚或盖住沉淀为宜）→密封瓶口→37℃水浴消化10～20分钟（长毛刺时方可）。

将消化好的胚体取出→将胰酶液倒掉→再用Hank’s液冲洗3次，加入培养液→用吸管敲打（吹打）碎，→倒入带纱布的烧瓶内（16层纱布）→用培养液冲洗培养瓶→过滤到250ml瓶中→制成细胞悬液。

最后细胞稀释到80～110万个/ml,在细胞培养瓶中生长。

抗原进入机体后，除少数可以直接作用于淋巴细胞外，大多数抗原都要经过吞噬细胞的摄取和处理。

经过处理的抗原，可将其内部隐蔽的抗原决定簇暴露出来。

体液免疫：
吞噬细胞将抗原呈递给T细胞，再由T细胞呈递给B细胞——（感应阶段），再由B细胞产生记忆B细胞和效应B细胞（浆细胞），从而产生抗体——（反应阶段）。

抗体处理抗原——（效应阶段）
有的抗原可以直接刺激B细胞（后面程序一样）。

这种抗原呈递，多数是通过细胞表面的直接相互接触来完成的
细胞免疫：
T细胞产生记忆T细胞和效应T细胞——（感应阶段）。

效应T细胞将病毒的宿主细胞裂解，暴露出抗原——（反应阶段）。

然后由吞噬细胞将其消灭——（效应阶段）。