兽疫链球菌的改良及其发酵生产透明质酸论文

第54卷　第3期 化 工 学 报 Vol.54　№3 2003年3月 Journal　of　Chemical　Industry　and　Engineering　(China) March　2003研究论文搅拌与混合对兽疫链球菌发酵生产透明质酸的影响 高海军1,2　陈　坚2　堵国成2　章燕芳2　陈金春1　陈国强1 (1清华大学生物系,北京100084;2江南大学生物工程学院,江苏无锡214036) 摘　要　研究了透明质酸的流变学特性以及搅拌和混合对兽疫链球菌发酵生产透明质酸的影响。

结果表明:透明质酸溶液属于典型的非牛顿凯松流体;搅拌转速和透明质酸浓度对气液传氧速率有很大影响;在较高的搅拌速率下发酵时可以得到较高的透明质酸产量,650r・min-1时透明质酸产量为411g・L-1,产率系数为0108g・g-1;用有效搅拌模型分析发酵过程发现,只有在高搅拌转速时发酵体系才处于全部混合状态。

关键词　透明质酸　兽疫链球菌　流体　发酵　模型中图分类号　TQ92011 文献标识码　A 文章编号　0438-1157(2003)03-0350-07 EFFECT OF AGITATION AN D MIXING ON H YAL URONICACID PROD UCTION BY Streptococcus zooepidemicusG AO H aijun1,2,CHEN Jian2,D U G uocheng2,ZHANG Yanfang2,CHEN Jinchun1and CHEN G uoqiang1(1Depart ment of Biological Science and Biotechnology,Tsinghua U niversity,Beijing100084,China;2School of Biotechnology,Jiangnan U niversity,W uxi214036,Jiangsu,China)Abstract　Rheological features of hyaluronic acid and effects of agitation and mixing on hyaluronic acid(HA) production by S t reptococcus zooepi dem icus were investigated.HA solution is a non2Newtonian Casson2fluid. Oxygen transfer rate between gas and liquid phase was influenced by agitation and concentration of HA.High HA production was accompanied by faster agitation.HA concentration and yield of HA at650r・min-1reached 411g・L-1,0108g・g-1respectively.Based on circular cylinder cavern model,culture system was in perfect mixing state only at high speed agitation.K eyw ords　hyaluronic acid,S t reptococcus zooepi dem icus,fluid,culture,model引　言透明质酸(HA)是一种高分子量的黏多糖,由UDP/葡萄糖醛酸和UDP/N2氨基葡萄糖为单体交替连接而成[1],几乎存在于所有高等生物的软组织中,特别是在滑液和眼球的玻璃体中,具有重要的生理功能[2].在微生物特别是链球菌中HA以荚膜的形式出现.由于其结构特点,HA溶液具有极高的黏弹性和持水性,已广泛应用于化妆品、伤口愈合剂、滴眼液以及眼科、关节手术的制剂等[3],同时HA衍生物制备与应用方面的研究也在不断展开[4].虽然HA首先是从牛眼玻璃体中提取的,但A、C族链球菌荚膜中的HA与哺乳动物结缔组织中的HA没有区别.由于传统的动物组织提取法生产HA有许多难以克服的缺点,原料缺乏,成本很高,易受污染,同时HA市场不断扩大,微生物发酵法生产HA于1983年开发成功[5].此后关于HA生产的研究主要集中到用C族链球菌进行发酵生产上,研究内容包括基本发酵工艺[6,7]、营养要求[8,9]、发酵条件的2001-09-17收到初稿,2001-12-20收到修改稿.联系人:陈国强.第一作者:高海军,男,33岁,博士,助理研究员.R eceived d ate:2001-09-17.Corresponding author:CHEN Guoqiang.E-m ail:chengq@ 优化[10]等,但尚未见到关于HA发酵液的流体状态与发酵的关系等较为深入的研究报道.本研究考察了HA溶液的流变特征,研究比较了不同条件下HA溶液的混合与传氧,考察了搅拌与混合对HA发酵生产的影响,并用有效搅拌模型对发酵体系进行较为深入的探讨.1　材料和方法111　菌　种实验菌种为C族的兽疫链球菌(S t reptococcus zooepi dem icus)H23(实验室保藏号).112　培养基斜面、种子、发酵培养基见参考文献[11]. 113　培养方法斜面与种子培养方法见参考文献[11].小型发酵罐培养:215L发酵罐(韩国KFC),配有单只圆盘透平桨,桨、罐直径比D/T=1/2.加入115L发酵培养基,于121℃下灭菌15min.接种量为10%(体积),发酵过程中采用5mol・L-1 NaOH溶液自动控制p H值为710±011,培养温度为37℃;初始葡萄糖浓度为50g・L-1,通气量为3L・min-1,搅拌转速文中具体给出.114　测定方法透明质酸含量测定:采用Bitter-Muir氏法[12].葡萄糖含量测定:采用3,5-二硝基水杨酸法[13].菌体量测定:采取干重法与比浊法对照.将发酵液(适当稀释)离心后取沉淀,去离子水洗涤,于80℃干燥24h后,称取细胞量,计算细胞浓度;或悬浮于一定体积的去离子水中,于620nm比浊,与标准曲线对照,计算细胞浓度.HA分子量测定:极限黏度法[14].乳酸含量测定:对羟基联苯法[15].体积传氧系数(K L a)测定:溶氧电极(M ETTL ER TOL EDO,Switzerland)法[16].流体黏度测定:采用Haake旋转式黏度计(Haake viscometor,R otovisco R12,Haake MessT echik G mbh,G erman)测量,NV系统,温度为37℃,转速范围为0～256r・min-1.2　结果和讨论211　HA溶液的流变学特性与传质性能21111　不同浓度HA溶液的流变模型　考察不同浓度HA溶液的流变学特性,结果如图1、图2所示.可以看出,随着剪切速率(γ・)增高,剪应力(τ)和表观黏度(η)的变化经历了两个阶段:在较低的剪切速率下,剪应力随剪切速率线性变化,而黏度为常数,这个剪切速率范围比较小,并且浓度越高范围越小;继续增加剪切速率,进入另一个阶段,表观黏度迅速下降,出现明显的剪切变稀现象.可以看出浓度为0102～5g・L-1时的HA溶液在第1阶段(低剪切速率)内属于牛顿型流体,在第2阶段内具有非牛顿流体特性.Fouissac等[17]在25℃时研究HA溶液的流变特性,发现浓度为0111～11147g・L-1HA溶液的增比黏度ηsp也表现出同样的现象.高分子物质的稀溶液、浓溶液和亚浓溶液,其溶质与溶剂的作用形式不同,形成了不同的流变特性[18].Fig11　Correlation of shear rate with shear stressin HA solution at differentconcentrationsFig12　Correlation of shear rate with apparent viscosity in HA solution at different concentrations将所测数据采用幂次定律模型(power law model)、凯松模型(Casson model)等进行拟合,结果如表1所示.可以看出,两种模型都能对数据进行较好的拟合,但根据对发酵过程和模拟体系的观察,当体系的HA浓度较高时,发酵罐中存在明显的停滞区(近罐壁处或上部),表明流体有屈服力存・153・　第54卷第3期 高海军等:搅拌与混合对兽疫链球菌发酵生产透明质酸的影响 T able 1　Rheological model of HA solution in different concentrationsHA/g ・L -1Power law model ModelRegression coefficientCasson modelModelRegression coefficient510τ=0198 γ0151019934τ12=2146+01107 γ12019842410τ=1100 γ0146019773τ12=2146+01079 γ12019596310τ=0160 γ0149019847τ12=2100+01069 γ12019728215τ=0173 γ0153019913τ12=1191+01056 γ12019867110τ=0173 γ0133019760τ12=1162+01033 γ12019992011τ=0165 γ0132019734τ12=1148+01031 γ120197450102τ=0154γ0133019695τ12=1131+01031 γ12019713在.由于幂次定律模型中不含有屈服应力项(τ0),而凯松模型中有屈服应力常数项,所以后者更为准确地描述了体系的流变学行为.21112　HA 发酵体系的混合与体积传氧系数(K L a )　氧传递速率常是生物反应系统的一个限制性因素,同时也是反应器放大的一个重要参数.发酵体系(包括非牛顿体系)的传氧效率的研究较多[19],但还未见有关HA 发酵液传氧性能的报道.图3、图4为不同搅拌转速和不同HA 浓度时模拟体系中的体积传氧系数.从图3可以看出,搅拌速率越高越有利于K L a 提高,并且两者几乎成线性关系.除有益于传质外,发酵过程中,高搅拌速率还可以保证细胞均匀悬浮,将其他营养物质混合均匀,驱散细胞周围由自身代谢产生的有害物质.从图4可以看出,HA 浓度对传氧效率也有很大影响.由前面的研究可以知道,HA 浓度增高,溶液的黏度迅速增大.高的液体黏度既增加气液传质界面阻力,又影响气体在溶液中的扩散.有研究指出小分子溶质在低分子溶剂中的扩散系数与溶剂的黏度成反比关系[20].Fig 13　G as/liquid volumetric oxygen transfer coefficients with 319g ・L-1HA solutionunder different agitationspeedsFig 14　G as/liquid volumetric oxygen transfer coefficients of HA solution with different concentrationsunder agitation speed of 650r ・min -1212　搅拌转速对HA 发酵过程的影响对于HA 发酵,搅拌在发酵过程中有两个作用:一为搅拌混合作用,强化气液间的氧的传递,既维持发酵液中有足够的溶氧,为细胞提供氧气,又可使发酵液中的各营养基质混合均匀,有利细胞的吸收和利用;另一为剪切作用,既影响细胞的生长,又可加速细胞荚膜从细胞表面脱离[7],从而影响HA 丝状大分子的分子量.这些作用共同形成了独特的HA 发酵特征.21211　搅拌转速对细胞生长的影响　发酵条件对发酵的影响首先表现在对菌体生长的影响上.图5为不同转速下菌体量随时间变化曲线,可以看出搅拌转速越高菌体生长速率越快,850r ・min -1时菌体量增加速率最快,最终菌体量也最大,达317g ・L -1,300r ・min -1时菌体量最低,仅为118g ・L -1,但整个发酵周期都在16h 左右.图6为菌体对碳源的产率系数(Y X )随搅拌转速变化曲线,可以看出在高搅拌转速下Y X 也较高,300r ・min -1时为01032g ・g -1,而850r ・min -1时却达0107g ・g -1.发酵法生产多糖时,随着发酵过程的进行,细胞量增加,进入对数生长期后耗氧量急剧上升,产・253・ 化 工 学 报 2003年3月　Fig 15　Time course of cell growth under different agitationspeedsFig 16　E ffect of agitation on cell yield物浓度不断增加,发酵液黏度也逐渐增高,因而K L a 值迅速降低,当发酵进行到一定程度后,发酵液中的溶氧浓度(DO T )几乎为0(图7),此时溶液中的供氧与耗氧处于平衡状态.Fig 17　Time course of DO T in fermentationprocessFig 18　Trend of DO T under interrupting oxygen supply 图7为典型的发酵过程DO T 变化图,可以看出发酵过程中有相当一部分时间是处于DO T 为0或接近0的状态,搅拌转速不同时这个阶段的长短不同.图8为发酵过程中停止供气后发酵体系DO T 的变化,可以看出当DO T 低于10%以后细胞代谢速率减慢,呼吸强度降低.可以认为10%即为细胞生长的临界DO T [20].而高的搅拌转速使发酵过程处在较高的DO T 下,从而表现出较高搅拌转速有利于菌体生长.但高DO T 并不意味着可以获得高的HA 产量,这还存在着氧对部分途径的抑制、氧中间代谢产物(如O -2,H 2O 2)的毒害等作用[21].21212　搅拌转速对产物合成的影响(1)搅拌转速对HA 产量和HA 产率系数的影响　研究生产条件对发酵的影响最主要的目的是提高产品的最终浓度(产量)以及底物对产物的产率系数.图9为HA 产量在不同搅拌转速下随时间的变化趋势图,图10为搅拌转速对HA 终产量及产率系数(Y HA )的影响.可以看出,HA 发酵初期合成速率较慢,当发酵进行到7～8h 后,HA 迅速增加,这个时期约占发酵期的50%.发酵后期,碳源浓度比较低时,菌体可以继续生长(图5中14～16h ),HA 则停止合成.在较低转速时HA 终产量随搅拌转速增加而提高,从300r ・min -1的218g ・L -1增加到650r ・min -1的411g ・L -1,但继续提高转速到850r ・min -1时产量迅速降低,仅216g ・L -1.Johns 等[7]也发现HA 产量在一定范围内随搅拌速率的增加而提高.300～650r ・min -1搅拌转速下Y HA 与Y X 变化趋势相一致,从01055g ・g -1升高至01080g ・g -1,而搅拌转速为850r ・min -1时则大为下降,仅为01051g ・g -1.图9表明对于HA 发酵过程存在一个最佳搅拌转速,作者认为这可能有两方面的原因:一为前面提到的搅拌有助于HA 荚膜脱落,促进营养物质的吸收利用;另一为氧对菌体细胞的毒害作用.Cleary 和Larkin [22]对几株A 族链球菌研究后认为HA 荚膜多糖是防止氧对细胞毒害的保护膜,由于搅拌加速了氧的溶解,增加了细胞与氧的接触,从而也加速了细胞荚膜的合成以抵抗氧的毒害作用,而当搅拌转速超出了一定的限度时,细胞对氧过量摄入,则表现出氧对细胞的毒害作用,而使HA 产量大为降低.・353・　第54卷第3期 高海军等:搅拌与混合对兽疫链球菌发酵生产透明质酸的影响 Fig 19　E ffects of agitation on HAproductionFig 110　HA yield on glucose under different agitation speeds(2)搅拌转速对相对分子质量(M η)的影响　HA 作为一种高分子黏多糖,分子量是影响其黏弹,在发酵生产中HA 的M η同样也是应考虑的一个主要生产指标.从图11可以看出,在发酵初期,HA 分子量较低,随着发酵的进行,分子量不断提高,发酵终了时M η也达到最大.HA 的最终M η则随搅拌速率的提高而不断下降,300r ・min -1时为211×106,升高至850r ・min -1时则降至114×106.这与K im 等[10]所观察到的结果一致,但Armstrong 和Johns [23]却发现在300～1000r ・min-1范围内搅拌转速对分子量没有大的影响.Fig 111　Time course of relative molecular mass underdifferent agitation speedsVan de Rijn 等[24]发现HA 是由HA 合成酶在细胞膜上合成并分泌到胞外的.由于搅拌的剪切作用,一方面可能引起HA 的非正常合成,使得正在链延长阶段的HA 分子提前脱落,未达到一定分子量的HA ;另一方面,由于HA 是丝状长链分子,在搅拌剪切力作用下可能会发生断裂,从而降低了产品的分子量.21213　搅拌转速对乳酸产量和乳酸产率系数的影响　乳酸是HA 发酵过程中另一种主要产物,对其进行考察有助于了解菌种的代谢、发酵机制,以便创造条件使底物朝着有利于HA 合成的方向进行.图12为不同搅拌转速下乳酸的产量及产率系数(Y LA ).可以看出,在不同搅拌转速的发酵过程中大部分碳源转化成乳酸,搅拌转速越低表现越明显,300r ・min -1时乳酸量4612g ・L -1、产率系数0192g ・g -1,到850r ・min -1时乳酸产量4110g ・L -1、产率系数0181g ・g -1.合成乳酸是许多链球菌的特征,关于链球菌合成HA 的过程中伴随着乳酸的大量产生已有许多报道[7,10].Fig 112　E ffect of agitation on lactic acid production21214　搅拌转速对HA 和乳酸比生成速率的影响　图13为HA 发酵过程中产物的最大比生成速率随搅拌速率变化关系图(图中数据系单位时间内产物平均比合成速率比较所得).可以看出,HA 最大比生成速率(πHA ,max )和乳酸的最大比生成速率(πLA ,max )变化规律略有不同.对于HA ,在300r ・min -1时πHA 最小,仅0111g ・g -1・h -1,转速在450～650r ・min -1范围变化时发酵具有最大的比生成速率,πHA ,max =0122g ・g -1・h -1,继续增高转速,πHA ,max 开始下降,850r ・min -1时降为0117g ・g -1・h -1;对于乳酸,随搅拌转速的增加,其比合成速率呈单一的下降趋势,300r ・min -1时为311g ・g -1・h -1,850r ・min -1时为212g ・g -1・h -1.较低转速时速率降低较快,较高转速时趋于平缓.213　HA 发酵过程中的搅拌效率通常,高黏度假塑性发酵液的搅拌比较困难,・453・ 化 工 学 报 2003年3月　Fig113　Maximum specific synthetic rate underdifferent agitation speeds由于黏度梯度的原因使得远离搅拌器的流体流动性急剧下降,同时黏度也使搅拌器的泵送能力(pumping capacity)下降,导致搅拌死角的存在,使得混合效率下降,气体在反应器中难以被打碎成细小气泡.前已述及HA溶液存在着一定的屈服力,当流体存在屈服力时,还可能产生一种“有效搅拌区域”(cavern volume)现象[25],即在搅拌器附近的圆柱形区域搅拌良好,而外围部分静止不动.在HA发酵过程后期,可以观察到体系中明显存在着这种现象.许多多糖的发酵体系中存在有效搅拌现象,Solomon等[26]、Nienow和Elson[25]等对羧甲基纤维素(CMC)、黄原胶等多糖溶液进行了较为深入的研究,发现搅拌器的大小、搅拌转速等都对有效搅拌体积有很大的影响,并提出了有效搅拌圆柱模型(circular cylinder cavern model).图14为搅拌转速和搅拌器直径对有效搅拌体积的影响[27]及圆柱有效搅拌模型.式(1)为有效搅拌模型中有效搅拌直径的数学表达式D c D 3=1136π2P0ρN2D2τ(1)式中　D c为有效搅拌直径,P0为不通气时的搅拌功率[28,29],ρ为发酵液体密度,N为搅拌转速, D为搅拌器直径,τ为表观剪应力(其值参见图1).当有效搅拌区域没有达到罐壁时其高径比为014,当区域达到罐壁后D c即为定值D f(罐径),区域高度随着搅拌速率增高继续增大.这里本文继续采用014作为高径比,而D c仅表示理论有效直径.图15为HA发酵过程采用凯松模型和方程(1)进行计算后得到的有效搅拌体积(T c)占发酵体积(T v)的百分比随时间变化关系图.可以看出,高搅拌转速(650r・min-1)时,整个过程的整个发酵体Fig114　E ffect of agitation speed,diameter of impelleron cavern volume and picture of circularcylinder cavern modelFig115　Time course of percentage of cavern volume to broth volume in culture process atdifferent agitation speed・553・　第54卷第3期 高海军等:搅拌与混合对兽疫链球菌发酵生产透明质酸的影响 系都处于良好的搅拌状态,最终HA 浓度为411g ・L -1;而低搅拌转速时,随着发酵的进行有效搅拌体积逐渐减小,HA 合成量也相应减少(图9、图10),450r ・min -1、300r ・min -1时最终HA 浓度分别为317g ・L -1、218g ・L -1.可以推测混合是否完全、是否有大量非有效搅拌区域与HA 产量的高低有着密切的关系.Serrano 2Carreon 等[30]根据混合现象和动力学的相互作用提出了包含搅拌因子的黄原胶发酵的动力学模型,并对黄原胶发酵过程做出了很好的预测.R eferences1Markovitz A ,Cifonello J A ,Dorfman A.The Biosynthesis of Hyaluronic Acid by Group a Streptococcus.J.Boil.Chem.,1959,234:2343—23502O ’Regan M ,Martini I ,Crescenzi F ,de Luca C ,Lansing M.Molecular Mechanisms and G enetics of Hyaluronan Biosynthesis.Int.J.Biol.M acromol.,1994,16:283—2863Balazs E A.In :Miller D 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基于组学分析优化兽疫链球菌的透明质酸发酵生产胡云箫;吴俊俊;赵北辰;王阳;康振【期刊名称】《食品与发酵工业》【年(卷),期】2024(50)4【摘要】透明质酸具有保湿、润滑等多种生理功能,广泛应用于食品、医药和化妆品领域。

目前透明质酸主要依赖于兽疫链球菌发酵生产。

然而,遗传背景不清晰等问题,限制了兽疫链球菌作为底盘细胞的相关改造以及透明质酸发酵水平的提升。

该研究首先对兽疫链球菌WSH-24的全基因组和转录组数据进行了测序分析,发现该菌株具有高效的糖酵解和乳酸合成能力,以及不完整的三羧酸循环和多种氨基酸合成途径的缺失。

结合生长曲线分析,进一步明确该菌株为缬氨酸、谷氨酰胺、精氨酸和色氨酸4种氨基酸缺陷型。

在此基础上,通过外源添加对应的氨基酸使透明质酸产量达到(2.65±0.02)g/L。

其次,结合转录组测序数据,确定了维生素B5、维生素B7和维生素B12相关合成基因的转录水平过低。

通过外源添加对应的维生素有效提高透明质酸的合成,使其产量达到(2.46±0.07)g/L。

最后,通过培养基优化,在3 L发酵罐上透明质酸发酵质量浓度达到5.63 g/L,生产强度为0.31 g/(L·h),相较优化前提高了33.33%。

该研究为进一步改造兽疫链球菌WSH-24奠定了基础,为透明质酸的产量提升提供了支撑。

【总页数】7页(P10-16)【作者】胡云箫;吴俊俊;赵北辰;王阳;康振【作者单位】糖化学与生物技术教育部重点实验室;食品合成生物技术教育部工程研究中心;江南大学生物工程学院【正文语种】中文【中图分类】S85【相关文献】1.生产透明质酸的兽疫链球菌NUF-035的筛选及摇瓶发酵条件2.搅拌与混合对兽疫链球菌发酵生产透明质酸的影响3.兽疫链球菌NW-162发酵生产透明质酸的研究4.以兽疫链球菌NUF—036分批发酵生产透明质酸的工艺研究及其动力学模型的建立5.氧载体正己烷对兽疫链球菌发酵生产透明质酸的影响因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

非动物源蛋白胨对兽疫链球菌产透明质酸影响的研究2.安琪酵母股份有限公司湖北宜昌 443003摘要：本研究对比了几种不同的非动物源蛋白胨和动物源蛋白胨对兽疫链球菌产透明质酸的影响。

采用3L六联发酵罐培养，对4种非动物源蛋白胨及2种动物源蛋白胨进行了对比研究。

结果表明，非动物源蛋白胨FP501能很好的对生产用的牛骨胨进行替换，发酵18h，透明质酸产率能达到9.55g/L，优于现在生产用的骨胨。

Abstract：This research focused on the effects of different non-animal peptones and animal-source peptones on the production of hyaluronic acid by Streptococcus zooepidemicus. Four kinds of non-animal peptone and two kinds of animal peptone were compared by cultured in 3L six-way fermentation tanks. The results show that non-animal peptone FP501 can replace the production of bovine bone peptone very well. The yield of hyaluronic acid can reach to 9.55g/L after 18 hours of fermentation, which is better than the current production of animal source peptone.关键词：兽疫链球菌；透明质酸；非动物源蛋白胨；酵母蛋白胨透明质酸(Hyaluronic acid,HA)是由N-乙酰葡萄糖胺和葡萄糖醛酸组成的一种高分子多糖，其具有高度的粘弹性、可塑性、渗透性和良好的生物相容性。

透明质酸合成途径在乳酸乳球菌中的建立及微生物合成透明质酸分子量调控机制的初步研究透明质酸(hyaluronic acid,HA)作为一种高分子量的黏多糖,广泛存在于脊椎动物细胞中,发挥着结构、信号传导和信号识别的功能。

HA由于其优异的黏弹性、保湿性和支撑作用,被广泛的应用于医药、化妆品、药物传递系统、疫苗和功能健康食品。

目前,工业上主要经由革兰氏阳性C型链球菌如兽疫链球菌(Streptococcus zooepidemicus)发酵生产。

但作为生产菌株,链球菌生长速度慢、培养基成本高等劣势日益显现出来,而寻找新的优秀野生生产菌株的希望渺茫。

所以,利用基因工程构建合成HA的工程菌株不但有利于克服链球菌作为发酵生产HA菌株的劣势,而且对提高HA的品质,扩大HA的应用范围具有理论意义和应用价值。

乳酸乳球菌(Lactoccus lactis)作为革兰氏阳性菌的模式生物,已被广泛应用于食品发酵生产中,且被认定为GRAS(generally regarded as safe)微生物。

乳酸乳球菌由于其自身的优良特性,正越来越多地被应用于代谢工程改造过的现代工业中。

在过去的25年中,乳酸乳球菌的基因操作方法日益成熟,其中一系列的诱导表达启动子得到了深入的研究,并已开始应用于工业生产。

通过改变小肽、单糖的浓度或诱导温度等调控因子,这些启动子能够实现乳酸乳球菌工程菌株中目的蛋白的可控表达。

NICE(the nisin controlled gene expression)系统是乳酸乳球菌中研究最深入和最有效的基因工程操作系统之一,已被广泛地应用于该菌株的代谢工程改造。

不但诱导剂乳酸链球菌素(nisin)是一种理想的高效安全无毒的食品级诱导分子,而且在NICE系统中可以将染色体上lacF基因缺失的乳酸球菌菌株以及含有lacF基因的质粒结合使用,用食品级筛选标记lacF替代抗生素抗性基因,构建食品级表达系统,而且该方式构建的工程菌株遗传稳定(deRuyter,Kuipers & de Vos,1996b;Mierau & Kleerebezem,2005a;Zhang,Chen,Jia,Chen & Huan,2002)。

吉林大学
硕士学位论文
兽疫链球菌发酵法生产透明质酸
姓名：***
申请学位级别：硕士
专业：微生物与生化药学
指导教师：滕利荣;刘兰英
20031201
吉林大学硕士学位论文兽疫链球菌发酵法生产透明质酸于酶解过程中，仍有部分细胞壁残留，而裸露的质膜部分则相互粘连。

Ｆｉｇ．４ｍｗｉｌｄｂａｔｅｒｉａｓｂｅｆｏｒｅ
ＦｉｇｓＴｈｅｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓａｆｔｅｒｅｎｚｙｍｅｈｙｄｒｏｌｙｚｉｎｇｅｎｚｙｍｅｈｙｄｒｏｌｙｚｉｎｇ
３．２激光诱变
激光可产生光、热、压力、电磁场等效应，作用于微生物细胞时，生物分子吸收光子或在激光的电磁场作用下分子内发生能级跃迁，达到一定的振动能并产生自由基，引起生物分子的分解、断裂，导致分子激活或损伤，在修复过程中有可能发生变异。

原生质体对激光敏感性较强，可在较小剂量下产生突变，得到较高正突变率。

由图６可见，随激光照射时间的延长，每一种功率密度下致死率均上升。

当照射时问为３００ｓ，功率密度为４０ｍＷ／ｃｍ２时，致死率为９９．８８％。

将存活的菌株经发酵培养，筛选透明质酸高产菌株。

收稿日期:2009-10-16作者简介:吴明霞,女(1979-)讲师,硕士研究生。

E -mail:wum 2ing0224@基金来源:宁德师范高等专科学校科研资助项目(项目编号2008Y004)温度对发酵生产透明质酸的影响吴明霞1,邓静2,吴华昌2(1宁德师范高等专科学校福建宁德352100;2四川理工学院四川自贡643000)摘要:为进一步提高兽疫链球菌透明质酸产量,本实验采用分阶段控制温度工艺,当温度由36℃培养到28h 转入38℃培养至发酵结束,其透明质酸产量有很大提高。

经发酵罐验证温度优化结果,其粗品产量由684g 提高到735g 。

关键词:透明质酸;温度;发酵罐中图分类号:Q93文献标识码:A文章编号:1006-8376(2010)01-0001-04 透明质酸(Hyalur onic Acid ,简称HA )是由β-D -葡萄糖醛酸和β-D -N -乙酰氨基葡萄糖的双糖单位反复交替连接而成的连锁状高分子物质[1],是链球菌、绿脓杆菌等类菌株荚膜的主要成分。

目前,透明质酸的生产方法逐渐由动物组织提取法转向微生物发酵法。

细菌发酵法生产透明质酸具有产量不受原料资源限制、成本低、产量高、有较高的相对分子量,分离纯化工艺简便,易于大规模生产等特点成为透明质酸生产的发展方向。

目前对透明质酸产生菌发酵的研究大多处于恒温控制阶段,本实验以经复合诱变的兽疫链球菌(S treptococcus zooepide m icus )作为透明质酸产生菌对其摇瓶发酵温度工艺进行优化,使用发酵罐进行验证实验,考察分阶段控制温度工艺对透明质酸产量的影响,从而选取最佳发酵工艺,为工业化生产提供指导。

1　材料及方法1.1　材料1.1.1菌种兽疫链球菌:复合诱变菌种1.1.2培养基种子培养基(%):葡萄糖1,蛋白胨0.5,磷酸二氢钾0.1,MgS O 4・7H 2O 0.05,琼脂1.5,pH7.0发酵培养基(%):淀粉2,蛋白胨1,酵母膏1,牛肉膏1,碳酸氢钠0.1,MgS O 4・7H 2O 0.051.2　方法1.2.1菌悬液的制备取斜面保藏的原始菌种接种于新鲜种子培养基上,于37℃培养14～16h 。

资料范本本资料为word版本，可以直接编辑和打印，感谢您的下载兽疫链球菌的改良及其发酵生产透明质酸论文地点：__________________时间：__________________说明：本资料适用于约定双方经过谈判，协商而共同承认，共同遵守的责任与义务，仅供参考，文档可直接下载或修改，不需要的部分可直接删除，使用时请详细阅读内容学号：08109117常州大学硕士学位论文兽疫链球菌的改良及其发酵生产透明质酸2010年 3 月Improved Streptococcus Zooepidemicus For ProducingHyaluronic Acid By FermentationA Dissertation Submitted toChangzhou UniversityBySun Xiao-HuiOrganic ChemistryDissertation Supervisor: Prof. Wang Li-QunMarch，2011常州大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文是本人在导师指导下独立进行的研究工作及取得的研究成果。

除文中已经注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。

对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在论文中以明确方式标明。

本人已完全意识到本声明的法律结果由本人承担。

作者签名：签字日期：年月日学位论文版权使用授权的说明本学位论文作者完全了解常州大学有关保留、使用学位论文的规定，即：研究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属常州大学。

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非保密论文注释：本学位论文不属于保密范围，适用本授权书。

兽疫链球菌产透明质酸发酵条件研究张翔;王腾飞;杨晓慧;王瑞明【摘要】透明质酸（Hyaluronicacid，简称HA），是国际上公认的一种生物大分子保湿剂，常用于眼科显微手术、关节炎治疗、高档化妆品、食物添加剂等领域。

对兽疫链球菌发酵生产透明质酸的最佳条件进行研究，采用单因素实验温度、pH值和接种量三个因素对透明质酸产量的影响，并通过正交实验进行优化发酵条件。

根据极差的大小，分析得到因素影响主次顺序为pH值影响最大，其次是温度，相对而言影响最低的是接种量。

兽疫链球菌在pH值为7．5、温度为38℃和5％接种量的发酵条件组合为最佳组合。

【期刊名称】《齐鲁工业大学学报：自然科学版》【年(卷),期】2014(028)004【总页数】4页(P51-54)【关键词】透明质酸;发酵条件优化;兽疫链球菌【作者】张翔;王腾飞;杨晓慧;王瑞明【作者单位】齐鲁工业大学山东省微生物重点实验室,山东济南250353;;;;【正文语种】中文【中图分类】Q539.7透明质酸，又称玻尿酸(Hyaluronic Acid，简称HA)，是一种大分子粘多糖，广泛存在于生物体的结缔组织中。

分子量仅为10～20个糖分子单位，可用于治疗晚期肿瘤的一些症状，如减少肿瘤体赖以生存的心血管生成，消炎和防止癌细胞转移等[1]。

透明质酸以其独特的分子结构和理化性质在机体内显示出多种重要的生理功能，如润滑关节，调节血管壁的通透性，调节蛋白质，水电解质扩散及运转，促进创伤愈合等[2,3]。

尤为重要的是，透明质酸具有特殊的保水作用，是目前发现的自然界中保湿性最好的物质，被称为理想的天然保湿因子。

透明质酸现已被广泛应用于化妆品、医学、保健品以及生物材料等领域。

随着近年来对透明质酸生物活性的认识，人们开始探索新的用途。

如利用其对伤口愈合的促进和对炎症的抑制作用，开发了防止粘连和促使伤口愈合的制剂。

为克服天然透明质酸在人体易于降解的局限，对其进行交联修饰，改构后的透明质酸可根据需要设计存留时间，还可以利用透明质酸的受体选择，使治疗药物定位释放，并由此产生了透明质酸给药体系的概念。

兽疫链球菌的改良及其发酵生产透明质酸论文摘要透明质酸作为一种重要的生物高分子化合物，具有广泛的应用价值。

然而，其传统的生产方法存在一些问题，如成本高、产量低等。

因此，本论文旨在研究兽疫链球菌的改良及其在透明质酸生产中的应用。

通过优化兽疫链球菌的培养条件、改良发酵工艺等方法，提高透明质酸的产量并降低生产成本，从而推动透明质酸产业的发展。

引言透明质酸是一种多糖酸，是由葡萄糖和N-乙酰葡萄糖胺通过β-(1,3)和β-(1,4)的糖苷键连接而成。

它具有很高的黏性和保水性，被广泛应用于医药、化妆品和食品等领域。

传统的透明质酸生产主要依赖于动物组织的提取，这种方法成本高昂且资源有限。

因此，寻找更加经济、高效的透明质酸生产方法具有重要意义。

兽疫链球菌是一种常见的细菌，广泛存在于土壤、水体等环境中。

它具有很强的代谢能力和适应性，可以利用多种底物产生透明质酸。

因此，通过改良兽疫链球菌的生理特性和发酵工艺，可以提高透明质酸的产量和质量，并降低生产成本，从而推动透明质酸产业的发展。

兽疫链球菌的改良兽疫链球菌的改良主要包括改良菌种、优化培养条件和遗传工程改造等方面。

改良菌种传统的透明质酸生产菌种主要为野生兽疫链球菌，但其透明质酸产量较低且生长较慢。

因此，研究人员通过随机诱变和遗传工程等方法，改良了菌种的生理特性。

例如，选育出透明质酸高产菌株，能够在较短时间内产生大量的透明质酸。

优化培养条件透明质酸的产量受到兽疫链球菌的培养条件的影响较大。

研究人员通过优化培养基的组成、调节培养条件等方式，提高透明质酸的产量。

例如，添加适当的氮源和碳源可以促进兽疫链球菌的生长和代谢，从而提高透明质酸的产量。

遗传工程改造通过遗传工程改造兽疫链球菌，可以大幅提高其透明质酸产量。

研究人员利用基因工程技术，将透明质酸合成相关基因导入兽疫链球菌中，从而增强其透明质酸合成能力。

此外，通过基因敲除、基因表达调控等方法，也可以调控透明质酸产生相关基因的表达水平，提高透明质酸的产量。