常见猪病PCR检测操作步骤及试剂配制(精)

常见猪病PCR检测操作步骤及试剂配制一、RNA病毒(蓝耳病、猪瘟、乙脑、猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、轮状病毒等包括病料的处理、RNA的提取、反转录、和PCR扩增、凝胶电泳四个步骤。

1、病料的处理取组织病料约2克,加入4-5毫升灭菌的PBS或者生理盐水,置研磨器(灭菌中研磨或者用剪刀细心剪碎,置-20℃中反复冻融三次,即可用于检测。

2、RNA的提取1取上述冻融三次的病料约200微升置1.5毫升的离心管中,加入500-600微升TRIzol剧烈振摇30秒后,静置5分钟后,再次剧烈振摇30秒后,静置5分钟。

2在加入200微升的氯仿,上下颠倒混匀30s,静置5分钟,4℃ 12000g 离心15 min。

离心完毕后,取上清约400-500微升(注意不要吸到中间层白色物质置新的灭菌好的离心管中,加入等体积的异丙醇,颠倒数次后(不可剧烈震动静置10分钟,4℃12000g离心10 min.可见管底部有少量白色沉淀,倒掉异丙醇,加入1毫升75%的乙醇(DEPC水配制,振摇,将白色沉淀悬浮,4℃7500g离心5 min。

弃去上清,干燥沉淀物(将离心管倒置于卫生纸或者其它吸水纸上,室温约5 min即可加入20μLDEPC 水溶解用于RT-PCR,或于-20℃保存备用。

两步法:1、反转录在10μL的反转录体系中加入:上述步骤中提取的RNA7μL、5×Buffer 2μL、0.5μL或者下游引物0.5μL;65℃10分钟, 10 mM dNTP 0.25μL、Oligo (dT18迅速放置-20摄氏度冰箱中2分钟,加入M-MLV 100U/μL 0.25μL(反转录酶37℃水浴1h,即可做为PCR扩增的模板,立即用于PCR扩增或置于- 20 ℃保存备用。

2、PCR扩增设立阳性和阴性对照,阳性对照一般为病毒液,阴性对照用灭菌的双蒸水做为PCR反应模板。

反应总体系为25μLcDNA 2μL,(模板25mmol/L Mg2+ 1.5μL,2.5mmol/L dNTPs 2.0μL,10× Mg2+ free PCR Buffer 2.5μL,20mmol/ L上下游引物各1μL,Taq DNA聚合酶(5U/μL0.2μL无菌双蒸水补至25.0μL。

PCR反应条件为:94℃预变性3 min;94℃ 45s,56℃ 45s,72℃ 45s,共进行36个循环;最后72℃延伸10min。

(根据不同的病毒设定时间和温度一步法:采用的是TaKaRa 的PrimeScript One Step RT-PCR Kit Ver.2试剂盒在25uL反应总体系:<1> PrimeScript 1 Step Enzyme Mix , 1uL<2> 2 × 1 Step Buffer , 12.5uLO ,6.5ul<3> RNase Free dH2<4> 20mmol/ L上下游引物各1μL,<5> 提取的RNA模板:3ul反应条件:50℃反转录30min,94℃预变性2min,进行30个循环(94℃变性1min, 56℃退火1min,72℃延伸1min, 最后72℃延伸10min。

扩增完的PCR产物放4℃保存。

3、凝胶电泳1%琼脂糖凝胶的配制0.25琼脂糖+25毫升TAE+1.25微升Goidview放入锥形瓶中,置烤箱中约1分钟沸腾后,摇匀,放置室外,约20-30分钟后倒入板中,约30-45分钟凝固后即可使用。

点样:将凝胶放入电泳槽中,DL2000的DNA Marker3-5微升,其它样品5微升+0.5-1微升的londingbuffer混合后点样,开启电泳仪,电压80-150V。

4、PCR 产物回收纯化取20μL PCR产物与4μL 6×Loading Buffer混匀,1%琼脂糖凝胶(GoldView0.5ug/ml电泳。

电泳结束后,在紫外灯下切出含有目的DNA条带的琼脂糖凝胶,用纸巾吸尽凝胶表面的电泳缓冲液,此时应注意尽量切除不含目的DNA部分的多余凝胶以减小凝胶体积,从而提高DNA的回收产率。

之后按照胶回收试剂盒产品说明书回收目的片段,并取1μL回收产物点样观察回收效果。

纯化步骤如下:(1 称量胶块重量,计算胶块体积,按照1mg等于1μL计算胶块体积;(2 向胶块中加入3倍胶块体积的融化液DR-I Buffer;(3 均匀混合后65℃水浴10 min,其间摇晃3-5次使胶块完全溶化;(4 向上述胶块融化液中加入DR-I Buffer 0.5倍体积量的DR-II Buffer,均匀混合;(5 转移液体至Spin column中,12,000 rpm 离心1min,弃滤液(可将滤出液体回收再离心一次以提高DNA回收率;(6 将500ul 的RinseA加入Spin column 中,12,000 rpm 离心30s,弃滤液;(7 将700 ul 的Rinse B加入Spin column 中,静置2-3 min,12,000 rpm 离心30s,弃滤液;(8 重复上一步操作;(9 10,000 rpm,离心1min,弃滤液;(10 将Spin column 安置于一灭菌的1.5ml Eppendorf管中,在滤膜中央处加入灭菌双蒸水或者试剂盒中的洗脱缓冲液20-30微升,室温静置1-2 min; (11 12,000 rpm 离心1min,收集滤出液体再离心洗脱一次,即得到纯化的PCR 产物。

注:PCR纯化产物可直接用于测序,如用PCR回收产物直接测序时,回收第10步中不可用洗脱缓冲液,只可用双蒸水。

5、DNA病毒(PCV2、伪狂犬病毒、细小病毒等包括病料处理、DNA的提取和PCR扩增、凝胶电泳四个步骤。

1、病料处理同上2、DNA的提取1取处理好的病料约1毫升置1.5毫升的离心管中,12000 rpm/min离心五分钟,取上清液(500-700μl.缴入等体积的氯仿剧烈振摇静止5分钟,12000 rpm 离心10分钟,2去上清至新的离心管中,加入终浓度为分别为10% 的SDS(约50微升和50μg/ml蛋白酶K(约10微升,55℃作用1.5h-2h(提前准备好水浴锅。

3加入200uL Tris饱和酚,振荡混匀,4℃,12000 rpm/min离心15min;4取上清液,于一个新的离心管中,加入Tris饱和酚和氯仿各200uL,充分混匀, 12000 rpm/min离心15min;5取上清于一新的离心管中,加入200uL氯仿,充分混匀,12000 rpm/min离心15min;6去上清于新的离心管中,加入2倍体积无水乙醇,-20℃放置20min, 12000rpm/min离心15min,弃上清。

(无水乙醇提前冰浴7加入70%的乙醇(提前放入冰箱冲洗沉淀表面和管壁,弃乙醇,晾干。

(若无沉淀可以离心7500 rpm/min离心5min;8最后加入20μl 无菌ddH2O溶解,-20℃保存备用。

3、PCR扩增设立阳性和阴性对照,阳性对照一般为病毒液,阴性对照用灭菌的双蒸水做为PCR反应模板。

反应总体系为25μLcDNA 2μL,(模板25mmol/L Mg2+ 1.5μL,2.5mmol/L dNTPs 2.0μL,10× Mg2+ free PCR Buffer 2.5μL,20mmol/ L上下游引物各1μL,Taq DNA聚合酶(5U/μL0.2μL无菌双蒸水补至25.0μL。

PCR反应条件为:94℃预变性3 min;94℃ 45s,56℃ 45s,72℃ 45s,共进行36个循环;最后72℃延伸10min。

(根据不同的病毒设定时间和温度3、凝胶电泳同上4、PCR产物的纯化回收以及测序同上。

试剂配制1、DEPC水的配制向灭菌的玻璃瓶中加入超纯水,然后加入DEPC至终浓度为0.01%(V/V过夜搅拌(放置摇床中,高压灭菌即可。

2、病料处理用PBS的配制NaCl: 8.00gKCl: 0.20gNa2HPO41.42 gKH2PO4:0.27g向烧杯中加入800毫升去离子水,充分搅拌,用浓盐酸调节PH至7.4,加入去离子水定容至1升,高压灭菌后即可使用。

1、TAE电泳液150×TAE贮存液:Tris242g,冰乙酸28.5 ml和Na2EDTA.2H2O 37.2混合,向烧杯中加入800毫升去离子水,充分搅拌,加入57.1毫升醋酸,充分搅拌,加入去离子水定容至1升,室温保存。

(21×TAE工作液:50×TAE贮存液20 ml,加纯水定容至1000 ml。

4、10%SDS:10gSDS置于100-200ml烧杯中,加入80ml的去离子水,68℃溶解,调PH7.2,早定容100ml.5、dNTP Mixture、ExTaqDNA聚合酶、TRIZOL等试剂均购自Invitrogen公司; M-MLV 购自Promega公司。

DL2000的DNA Marker , 一步法的PrimeScript One Step RT-PCR Kit Ver.2试剂盒购自TaKaRa公司。

Tris饱和酚,购自Solarbio。

检测用的引物:1.蓝耳:上游:JN1 5 CGGTTTTGATGGGCGACA 3下游:JN2 5 TGCAGGCGTGCGAGGTAA 3退火温度:53-56℃检测缺失毒株用2.猪瘟<1>检测疫苗毒用上游:HCV1 5AAACGGAGGGACTAGCCGT 3下游:HCV2 5GATTCAACTCCATGTGCCATG3退火温度:56℃<2>检测野毒上游:CSFV1 5-ACCTAATCTTACACTATGCAATC-3下游:CSFV2 5-CTGGACTAGTCCCATCAAAT-3退火温度:51-54 ℃3.传染性胃肠炎上游:TGEV1 5-GATGGCGACCAGATAGAAGT-3下游:TGEV2 5-GCAATAGGGTTGCTTGTACC-3退火温度:51 ℃4.流行性腹泻上游:PEDV1 5- GAAATAACCAGGGTCGTGGA-3下游:PEDV2 5-GCTCACGAACAGCCACATTA-3退火温度:51 ℃5.乙脑上游:JE -1 5 AACAGCATGCAAATCGAAGAC3下游:JE- 2 5 CCAGAAACATCACCAGAAGG3退火温度:55 ℃6.伪狂犬上游:PRV-gB-F 5’CGTCGAAGTACACGTACCCG3’下游:PRV-gB-R 5’CTCGAGCGAGCTGCAGAACAAG3' 退火温度:55 ℃7.细小上游:PPV-F 5’CCCAGAGGCAACAGCAATTAGG 3’下游:PPV-R5’CGAGATCTTGTGAAGATGTGG3’退火温度55℃8.圆环上游:PCV2-F 5’CAACAGCATGCCCAGCAAGAAGAAT3’下游:PCV2-R 5’TAGATTACACAGTCTCAGTAG3’退火温度55℃。