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自体免疫细胞治疗技术-肿瘤治疗第四模式-肿瘤患者新选择日期：2011-01-28 来源：新桥医院肿瘤生物治疗中心责任编辑：叶主任咨询详情生物治疗是利用分子生物学、细胞生物学的研究成果，从人体自身免疫系统和肿瘤基因入手通过调动人体的天然免疫系统或扩增人体自身的靶向性较强的抗肿瘤因子来实现防治肿瘤的目的。
目前在临床开展的肿瘤生物治疗有细胞因子治疗、细胞转输治疗、自体免疫细胞治疗、单克隆抗体治疗、癌疫苗治疗、基因治疗、抗血管生成治疗等。
其中运用最成熟疗效最好的是自体免疫细胞治疗技术。
自体免疫细胞治疗作为最新最成熟的肿瘤生物治疗技术，它是从患者自体外周血中分离出单个核细胞(抗癌相关因子，自然杀伤细胞)经过体外实验室激活、修饰、扩增后回输到患者体内，起到调节和增强患者的免疫功能，并直接杀伤肿瘤细胞和病毒感染细胞的作用。
该方法从上世纪80年代应用于临床肿瘤治疗以来，技术日趋成熟，越来越得到肿瘤患者与医生的认可，现与手术、放疗、化疗并称四大肿瘤治疗模式。
新桥医院依托全军唯一肿瘤研究所为技术平台，结合自身实力帅先引进肿瘤生物治疗技术，并组建了新桥医院肿瘤生物治疗中心。
中心实力雄厚，拥有陈正堂，朱波、孙建国等一大批军队高级医疗技术人才，为了更好的将科研与临床结合，中心还配备了国际领先的GMP实验室。
自开展肿瘤生物治疗以来，中心救治肿瘤患者上千例，患者满意度达95%以上。
肿瘤生物治疗的治疗方式主要有两种：一、主动免疫治疗我们采集患者的外周血，分离能够活化患者自身体内抗肿瘤细胞的因子，然后在体外培养、修饰、增殖后回输到患者体内，这样就能迅速激发增强人体自身的抗癌能力。
DC细胞治疗属于此范畴。
二、过继性免疫治疗我们分离患者自身体内就存在的抗癌细胞，在体外活化，增殖后直接输入患者体内对抗肿瘤，这样相当于为患者培养了一支强大的抗癌军团。
细胞因子诱导的杀伤（Cytokine-Induced Killer, CIK）细胞属于此治疗范畴。
低氧环境下人乳腺癌细胞系MCF-7转录调节因子-1表达变化及其机制刘颖,乔如丽，尚里，张锋军,焦扬驰，胡思畅,赵庆丽中国人民解放军联勤保障部队第九四O医院，兰州730050摘要：目的观察人乳腺癌细胞系MCF-7E26转录特异性序列-1(Ets-1)表达变化,并探讨其机制。
方法取对数生长期MCF-7细胞，使用氯化钻(CoCl2/诱导的化学性低氧培养环境以及缺氧小室培养环境模拟肿瘤细胞低氧微环境，通过过表达和敲降缺氧诱导因子-1a(HIF-1a)研究Ets-1基因的表达情况,通过荧光定量PCR(q-PCR)和蛋白印记实验(Westernblot)方法分别研究低氧环境下Ets-1mRNA和蛋白表达情况，使用免疫共沉淀(Co-IP)和免疫荧光染色(IF)方法研究不同情况下蛋白互作,使用免疫沉淀法研究Ets-1蛋白翻译过程中的乙酰化、泛素化和磷酸化。
结果低氧刺激下，乳腺癌细胞系中Ets-1蛋白水平显著上升;低氧环境下Ets-1mRNA相对表达量升高；过表达HIF-1a导致乙酰基转移酶p300活性增强;并且p300与Ets-1在细胞质中共定位;低氧刺激下,Ets-1的乙酰化水平升高,Ets-1乙酰化后与E3泛素连接酶COP-1相互作用减弱;300抑制剂C646处理MCF-7细胞降低Ets-1蛋白水平，并增强其与COP-1相互作用。
结论低氧微环境下培养的MCF-7细胞中Ets-1蛋白和mRNA表达升高,Ets-1表达升高的调控机制可能为低氧促进了Ets-1转录，同时HIF-1a使乙酰基转移酶p300活性增强，引起Ets-1乙酰化水平升高，乙酰化Ets-1与E3泛素连接酶COP-1相互作用受阻，进而降低其降解。
关键词：低氧环境;乳腺癌;MCF-7细胞；E26转录特异性序列-1doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2020.24.011中图分类号:R341 文献标志码:A文章编号：1002-266X(2020)24-0045-05ETS-1expression changes in breast cancer MCF-7cells induced by hypoxiaand its mechanismLIU Ying,QIAO Ruli,SHANG Li,ZHANG Fengjun,JIAO Yangchi,HU Sichang,ZHAO QingliNo.940Hospital of Joint Logistics Support Force of People's Liberation Army,Lanzhou730050,China Abstract:Objective To observe the expression changes of E26transformation specific sequence1(Ets-1/in human breast cancer cell line MCF-7under hypoxia and to explore the mechanism.Methods MCF-7cells in the logarithmic phase were cultured in CoCl2-induced chemical hypoxia environment and hypoxia chamber culture environment to simulate the hypoxic microenvironment of tumor cells.The expression of Ets-1gene was studied by overexpression and knockdown of hypoxia inducible factor-1a(HIF-1a).Fluorescence quantitative PCR(Q-PCR)and Western blotting were used to detect the expression of Ets-1mRNA and protein in hypoxic environment.Immunoprecipitation(co IP)and immunofluorescence staining(If)were used to determine the protein interaction in different conditions.Co IP was used to study the acetylation,ubiquitination and phosphorylation of Ets-1protein.Results Ets-1protein and level in breast cancer cell line MCF-7increased significantly under hypoxia.Overexpression of HIF-1a resulted in the increase of acetyltransferase p300 activity;p300and Ets-1were co-localized in cytoplasm;the acetylation level of Ets-1increased under hypoxia stimulation, and the interaction between Ets-1and E3ubiquitin ligase COP-1was weakened;c646,a p300inhibitor,decreased Ets-1 protein level and enhanced its interaction with COP-1.Conclusions The expression of Ets-1protein and mRNA increases in MCF-7cells cultured in hypoxia microenvironment.The regulation mechanism of increased Ets-1expression may be that hypoxia promotes Ets-1transcription,meanwhile,HIF-1a increases the activity of acetyltransferase p300,which leads to the increase of Ets-1acetylation level;the interaction between acetylated Ets-1and E3ubiquitin ligase Cop-1is blocked, and the degradation of Ets-1is reduced.Key words:hypoxia environment；breast carcinoma；MCF-7cells;E26transformation specific sequence1基金项目：甘肃省自然科学基金(160RJZA170)；甘肃省卫计委课题(GSWSKY2017-50)通信作者:赵庆丽(E-mail:1320861509@)45乳腺癌是女性中发病率和病死率都最咼的一-种恶性肿瘤，严重威胁女性身心健康［1］0癌症是多种内外因素不协调相互作用导致的结果，其中低氧微环境既可促进癌症的发展，也是癌细胞增殖过程中导致的结果之一⑵。
雌激素受体对乳腺癌细胞截短型神经激肽受体-1的调控作用刘晓彬;仝颖娜;张露芳;周云丽【摘要】Objective To analyze the regulation of estrogen receptor α (ERα) on truncated neurokinin-1 receptor (NK1R-Tr), and the influence of this regulation on cell proliferation in estrogen receptor-positive breast cancer cell lines. Methods The chromatin immune coprecipitation (CHIP) was used to observe the transcriptional regulation function of ERαon NK1R-Tr in breast cancer cells. Luciferase reporter gene assay was used to verify whether ERα played a positive reg ulatory role in the expression of NK1R-Tr. Western blot assay and real-time-PCR were used to detect the expression of ERα and NK1R-Tr in breast cancer cells, MCF-7 and T47D, as well as the expression of NK1R-Tr protein and mRNA level. NK1R-Tr levels were also detected after using estradiol (E2, ERα agonist) and small interfering RNA (knock out ERα). CCK-8 and clone formation experimen were used to detect the proliferation ability of breast cancer cells after knocking outNK1R-Tr with small interfering RNAs. Results CHIP test and Luciferase reporter gene assay proved that ERα can positively regulate the expression of NK1R-Tr via the ERα sequences in the upstream of the NK1R-Tr gene promoter. The expression of NK1R-Tr at both protein level and mRNA level dropped in the estrogen receptor-positive breast cancer cell line MCF-7 upon knocking out ERα. After knocking out NK1R-Tr, the proliferation ability of estrogen receptor-positive breast cancer cells was lower than that of the control group. Conclusion The ERα p ositively regulates theexpression of NK1R-Tr, resulting in the increased cell proliferation in estrogen positive breast cancer cells.%目的：探讨雌激素受体α（ERα）阳性的乳腺癌细胞中ERα对神经激肽受体-1截短型变异体（NK1R-Tr）的调控作用，以及ERα是否通过调控NK1R-Tr的表达，间接调控细胞的增殖能力。
恶性肿瘤CIK/DCCIK临床治疗手册肿瘤的CIK细胞过继免疫治疗应用的报道已近10年，2009年6月，国家卫生部正式批准CIK细胞治疗作为第三类医疗技术应用于临床（卫办医政发 [2009] 84号）。
结合我公司治疗数千病例的经验，总结制定本治疗规范，以方便临床使用。
一、产品知识肿瘤生物治疗简述长期以来，肿瘤治疗最常见的方法是手术、放疗和化疗。
但这三种传统的常规模式均有其自身的局限性。
随着人们对肿瘤发生发展机制的深入研究，及肿瘤免疫学、分子生物学、生物工程技术的发展，肿瘤的生物治疗迅速发展，成为肿瘤治疗的第四种治疗模式。
生物治疗具有较强的针对性、特异性、有效性，对正常造血及免疫系统、主要器官无负面影响和明显毒性，被认为是本世纪肿瘤综合治疗模式中最活跃、最有前途的治疗手段。
生物治疗可以单独使用，也可以与现代手术、化疗和放疗方法联合应用，具有很强的互补作用，不但具有清除体内不同部位的肿瘤细胞，防止肿瘤复发与转移的作用，而且对病人受损的免疫系统又能起到恢复与重建的独特作用。
目前，肿瘤生物治疗主要有5 类：细胞因子治疗、单克隆抗体及其偶联物技术、基因治疗、过继细胞治疗和肿瘤疫苗治疗。
其中，CIK 细胞治疗是最具有发展应用价值的过继细胞治疗方法，而DC 细胞治疗是最具有发展应用价值的肿瘤疫苗治疗方法。
CIK细胞1、CIK基本信息CIK细胞，即细胞因子诱导的杀伤细胞(Cytokine-Induced Killer，CIK)是一种新型的免疫活性细胞，CIK增殖能力强，细胞毒作用强，具有一定的免疫特性。
由于该细胞同时表达 CD3 +和 CD56+ 两种膜蛋白分子，故又称为NK 细胞（自然杀伤细胞）样 T 淋巴细胞，兼具有 T 淋巴细胞强大的抗瘤活性，和 NK 细胞的非 MHC 限制性杀瘤优点。
该细胞对肿瘤细胞的识别能力很强，如同“细胞导弹”，能精确“点射”肿瘤细胞，但不会伤及“无辜”的正常细胞。
尤其对手术后或放化疗后患者效果显著，能消除残留微小的转移病灶，防止癌细胞扩散和复发，提高机体免疫力，因此， CIK 细胞被认为是新一代的肿瘤过继细胞免疫治疗的首选方案。
DC—CIK细胞治疗148例老年恶性肿瘤的疗效观察作者：耿奇李秀萍张平来源：《中国保健营养·中旬刊》2014年第02期【摘要】目的：探讨DC-CIK联合培养治疗不能手术、不能化疗的老年晚期恶性肿瘤患者的临床疗效观察。
方法：观察148例临床确诊为恶性肿瘤的老年患者的肿瘤标记物、免疫指标和KPS评分的变化。
结果：DC-CIK治疗后，肿瘤标记物CEA和CA125 降低，CD3+、CD4+、CD8+的指标都有显著提高（P【关键字】免疫治疗；树突状细胞；CIK；老年人；恶性肿瘤；疗效【中图分类号】R73 【文献标识码】B 【文章编号】1004-7484（2014）02-0565-01随着我国人口的老年化，老年恶性肿瘤的发病率和死亡率逐年上升。
大部分老年患者由于年纪、身体状况和合并各种基础病等原因而不能化疗、手术等治疗。
随着分子生物学和细胞免疫学的发展，生物免疫疗法已成为肿瘤治疗的重要方法[1]，其中，CIK细胞联合DC细胞治疗恶性肿瘤，提高患者免疫功能的同时，有协同抗肿瘤的作用[2]。
2011年12月～2012年10月148例晚期恶性肿瘤老年患者在我院接受DC-CIK治疗，报告如下：1 材料与方法1.1临床材料经病理学或细胞学确诊的癌症患者148例，男性92例，女性56例。
肺癌60例，乳腺癌20例，结肠癌15例，膀胱癌10例，前列腺癌8例，胃癌6例，肝癌5例，食道癌5例，胰腺癌5例，宫颈癌5例，卵巢癌3例，肾癌3例，黑色素瘤3例。
患者入选标准：年龄大于60岁；病理组织学、影像学或细胞学等检查确诊为肿瘤患者；生活自理，KPS评分标准50分以上；预计生存期至少大于3个月；签署知情同意书。
1.2 方法采外周血：采血前对患者进行血常规检查，淋巴细胞与单核细胞的总数≥1×109/L。
如不符合此标准，需采用GM-CSF进行刺激造血系统后，采血量为50-60ml，采血前晚患者进食清淡饮食。
DC-CIK分离与体外诱导：将采集的外周血加入葡聚糖梯度离心进行单个核细胞分离，采用虹吸的方式吸出单个核细胞细胞，用含有自体血清、细胞因子和硫酸庆大霉素的1640培养基悬浮，并转移至75ml的培养瓶内，置于37℃的二氧化碳培养箱中培养。
自体CIK过继免疫治疗恶性肿瘤的最佳输注时间邓海峰;吴昌平;蒋敬庭;陆明洋;徐斌;郑晓;李敏;刘检;周怡;孙青;石红兵【摘要】目的研究恶性肿瘤患者自体细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)的免疫表型与细胞毒活性的变化规律,探讨肿瘤患者CIK过继免疫治疗输注的最佳时间.方法采集40例恶性肿瘤患者外周血单个核细胞(PBMC),由IFN-γ、rhIL-1 α、rhIL-2等细胞因子和CD3单克隆抗体体外诱导培养成CIK.用流式细胞术动态监测免疫表型,MTT 法分析细胞毒活性.结果随着诱导时间的延长,PBMC中CD3+、CD3+CD8+、CD3+ CD56+表型细胞所占比例呈上升趋势.CD3+ CD4+细胞在7d达到峰值,随后缓慢下降.CD25+细胞在培养的早期(3～7 d)即达峰值,7～14 d缓慢下降,14～21 d快速下降.HLA-DR+细胞在0～14d处于上升期,14 d达峰值后快速下降.成熟CIK细胞毒活性[(52.49±7.70)％]较未活化的PBMC[( 7.02±2.00)％]显著增高(P＜0.01).结论 14 d左右能诱导出典型的CIK,CD3+ CD56+细胞处于对数生长期.确立自体CIK过继免疫治疗恶性肿瘤的最佳输注时间为第14天.【期刊名称】《临床检验杂志》【年(卷),期】2011(029)009【总页数】4页(P674-677)【关键词】细胞因子诱导的杀伤细胞;免疫表型;细胞毒活性;输注时间【作者】邓海峰;吴昌平;蒋敬庭;陆明洋;徐斌;郑晓;李敏;刘检;周怡;孙青;石红兵【作者单位】常州市第一人民医院肿瘤生物诊疗中心,常州市医学生物技术重点实验室,江苏常州213003;常州市第一人民医院肿瘤生物诊疗中心,常州市医学生物技术重点实验室,江苏常州213003;常州市第一人民医院肿瘤生物诊疗中心,常州市医学生物技术重点实验室,江苏常州213003;常州市第一人民医院肿瘤生物诊疗中心,常州市医学生物技术重点实验室,江苏常州213003;常州市第一人民医院肿瘤生物诊疗中心,常州市医学生物技术重点实验室,江苏常州213003;常州市第一人民医院肿瘤生物诊疗中心,常州市医学生物技术重点实验室,江苏常州213003;常州市第一人民医院肿瘤生物诊疗中心,常州市医学生物技术重点实验室,江苏常州213003;常州市第一人民医院肿瘤生物诊疗中心,常州市医学生物技术重点实验室,江苏常州213003;常州市第一人民医院肿瘤生物诊疗中心,常州市医学生物技术重点实验室,江苏常州213003;常州市第一人民医院肿瘤生物诊疗中心,常州市医学生物技术重点实验室,江苏常州213003;常州市第一人民医院肿瘤生物诊疗中心,常州市医学生物技术重点实验室,江苏常州213003【正文语种】中文【中图分类】R446.6肿瘤的免疫治疗正从基础研究向临床应用发展，细胞因子、免疫活性细胞、单克隆抗体(McAb)、肿瘤疫苗和基因治疗等肿瘤生物治疗的临床应用已取得了一定效果。
CIK细胞疗法基础知识一、何为过继性免疫治疗？何为CIK细胞？过继性免疫治疗是指通过回输体外培养扩增的免疫效应细胞，以提高机体抗肿瘤免疫功能的肿瘤治疗方法，是生物免疫治疗中最为成熟和有效的方法。
目前用于回输的免疫效应细胞主要有淋巴因子激活的杀伤细胞（LAK）、肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）、细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK）、树突状细胞（DC）、自然杀伤细胞（NK）和CD3单克隆抗体激活的杀伤细胞（CD3AK）等。
CIK是英文cytokine -induced killer 的缩写，中文译为细胞因子诱导的杀伤细胞。
它是将人外周血单个核细胞（PBMC）在体外用多种细胞因子（抗CD3McAb、IL-2、IFN-γ、IL-1α等）共同培养一段时间后获得的一群异质细胞。
其中CD3+CD56+细胞是CIK细胞群体中主要的效应细胞，被称为NK样T淋巴细胞，兼具有T淋巴细胞强大的抗瘤活性和NK细胞的非MHC（主要组织相容性复合体）限制性杀瘤优点。
二、CIK细胞如何发挥抗肿瘤作用？1、CIK细胞可以直接杀伤肿瘤细胞：CIK细胞可以通过不同的机制识别肿瘤细胞，释放颗粒酶/穿孔素等毒性颗粒，导致肿瘤细胞的裂解。
2、CIK细胞释放的大量炎性细胞因子具有抑瘤杀瘤作用：体外培养的CIK细胞可以分泌多种细胞因子，如IFN-γ、TNF-α、IL-2等，不仅对肿瘤细胞有直接抑制作用，还可通过调节机体免疫系统反应性间接杀伤肿瘤细胞。
3、CIK细胞能够诱导肿瘤细胞的凋亡：CIK细胞在培养过程中表达FasL（Ⅱ型跨膜糖蛋白）通过与肿瘤细胞膜表达的Fas（Ⅰ型跨膜糖蛋白）结合，诱导肿瘤细胞凋亡。
三、CIK细胞抗肿瘤作用有何特色？1、增殖活性高：在培养的第15天数量就可以达到70多倍，其效应细胞CD3+CD56+的比例和数量更是明显增加,可以达到1000多倍；2、杀瘤活性高，而且杀瘤活性的维持不需要外源大量的IL-2的输入来维持；3、杀瘤谱广：CIK对肾癌、恶性黑色素瘤、白血病、乳腺癌、直肠癌、胃癌、肺癌、食管癌、宫颈癌、卵巢癌、多发性骨髓瘤、恶性淋巴瘤（非T细胞淋巴瘤）等恶性肿瘤细胞都有显著的杀伤活性；4、对多重耐药肿瘤细胞同样敏感；5、杀瘤活性不受CsA（环孢霉素A）和FK506（普乐可复）等免疫抑制剂的影响；6、对正常骨髓造血前体细胞毒性很小：约为25%；7、能抵抗肿瘤细胞引发的效应细胞Fas-FasL凋亡：CIK细胞内有抗凋亡基因表达，并检出多种保护基因，如Bcl-2等和survivin的转录水平上调。
培养诱导乳腺癌患者自体CIK 细胞的研究 探讨获得大量乳腺癌患者自体树突状细胞（dendritic cells, DCs）和细胞因子诱导的杀伤细胞（cytokine-induced cells, CIK 细胞）的可行性。 乳腺癌患者经外周血干细胞动员，取 50 mL 外周血分外周血单个核细胞（PBMC），用 AIM-V 无血清培养基培养 DCs 和 CIK，并设健康人对照组，用 RPMI 1640 完 全营养培养基。结果 实验组 PBMC 产出 2×108 个并诱导出 1.2×107 个 DCs 和 2×109个 CIK 细胞，显著高于对 照组（P < 0.01）。DCs 的 CD86、CD11c 和 HLA-DR 分子都有较高表达，CIK 细胞 CD3+、CD56+双阳性细胞达 到14.41%。细胞毒实验提示 CIK 细胞有强大的杀瘤活性。结论 乳腺癌患者经外周血干细胞动员，用AIM-V 无 血清系统培养，少量外周血可诱导大量优质自体 DCs 和 CIK 细胞。 树突状细胞（DCs）是目前发现功能最强的专职抗原呈递细胞（APC），是唯一能激发静息的 T 细胞产生免疫应答的 APC，在肿瘤免疫中具有极其重要作用。CIK 细胞是非 MHC 限制细胞毒性淋巴细胞，CIK 细胞的主要效应细胞是高度增生的 CD3+、CD56+双阳性表型 T 细胞，又被称为 NK 细胞样 T 淋巴细胞，兼具有 T 淋巴细胞强大的抗肿瘤活性和 NK 细胞的非限制性杀瘤优点，在体外可大量扩增，DCs 和 CIK 细胞理想的过继性免疫治疗细胞。但临床应用仍受到很大限制，一是由于常规培养基含有异种血清，二是常规由患者 PBMC 诱导达到治疗量自体 DCs 和 CIK 细胞，需大量外周血。我们对乳腺癌患者进行外周血干细胞动员和用 AIM-V 无血清培养基培养，探讨获得大量自体 CDs、CIK 细胞和建立符合临床治疗标准的培养诱导系统的方法。 动员乳腺癌患者外周血干细胞和分离外周血单个核细胞 乳腺癌患者皮下注射 GM-CSF 6 g·kg-1·d-1，共 5 d，第 6 天抽取外周血 50 mL，为实验组。同时取等量健康人外周血做为对照组。用 Ficoll 密度梯度离心法分离 PBMC，分离步骤按产品说明。 诱导 DCs 采用 GM-CSF、IL-4 和 TNF-α诱导 DCs。用 AIM-V 无血清培养基将实验组 PBMC 密度调到 5×106，在 75 cm2 培养瓶，37℃、5% CO2、培养 2 h。洗去并收集非贴壁细胞备用诱导 CIK 细胞。贴壁细胞用含 800 U/mL 人重组 GM-CSF 和 500 U/mL 人重组 IL-4 的 AIM-V 无血清培养基培养，每 3 天更换新培养基及细胞因子，第 5 天加入 50 U/mL 人 TNF-α，第 7 天收获成熟 DC。对照组采用 RPMI 1640 培养基培养（含 10% 灭活胎牛血清， 2 mmol/L L-glutamine、50 mol/L 2-mercaptoethano，P-S 双抗 100 U/mL），细胞因子及培养方法同实验组。 诱导 CIK 细胞 参照 Wolf CIK 细胞诱导法，并做必要修改。用 AIM-V 无血清培养基将实验组非贴壁 PBMC 密度调至 1×106，第 0 天培养基内加入 1 000 U/mL，培养 24 h 后加入抗 CD3 单克隆抗体 50 ng/mL，IL-1 100 U/mL 和 IL-2 300 U/mL。每 3 d 更换新培养基和细胞因子并调整细胞密度至 2×105。对照组用 RPMI 1640 培养基培养（含 10% 灭活胎牛血清，2 mmol/L L-glutamine、50 mol/L 2-mercaptoethano，P-S 双抗 100 U/mL，25 mmol/ L· HEPES），细胞因子及培养方法同实验组。 流式细胞 检测 DC 表型 CD86、CD11c 和 HLA-DR，检测 CIK 表型 CD3 和 CD56。 细胞毒分析 采用乳酸脱氢酶释放法检测 CIK 细胞的细胞毒活力。方法简述如下：在 U 形底 96 孔板行细胞毒检测每孔置靶细胞 Bel-7402 10 000 个/100 L，自然释放孔内靶细胞10000/200L，最大释放孔内置靶细胞 10 000/200 L 含 1% TritonX-100，背景孔内置 200 L 培养基，实验孔每孔含靶细胞 10 000 个/200 L 和不同数量 CIK 细胞，效靶比例为 5:1、10:1、20:1 和 40:1，效应细胞自然释放孔每孔置等量 CIK 细胞，以上均复置 3 孔。在 5% CO2，90% 湿度，37 培养 4 h 后，将每孔培养基移入 EP 管内，250 r/min，离心 10 min，取 100 L 上清移入新 96 孔板对应孔内，每孔加入乳酸脱氢酶反应液 100 L，室温下避光反应 30 min，用酶标仪检测 492 nm 波长度吸收值 A（OD 值）。 经外周血干细胞动员，50 mL 乳腺癌患者外周血可分离 2×108 单个核细胞，红细胞混合率低于 5%。50 mL 健康人外周血可分离 1.2×107 单个核细胞。两组 PBMC 产出率有非常显著性差异（P < 0.01）。 为大量诱导乳腺癌患者自体 DC，本研究采用 75 cm2 培养瓶进行培养，2 h 贴壁后洗去非贴壁细胞，见大量贴壁细胞。诱导 1 d 后，贴壁细胞伸展，呈高度多形性，随着 DCs 的成熟，贴壁细胞逐渐减少，第 7 天可见大量成熟 DCs。将贴壁 DCs 细胞吹起，用计数板对 DCs （大细胞）计数，共产出 DCs 1.2×107，对照组产出 DCs 1.4×106，两组 DCs 产出总数有非常显著性差异（P > 0.01），产出率无显著性差异（P > 0.05）。 对实验组和对照组外周血诱导 CIK 细胞 14 d 细胞总数和 CD3、CD56 表型变化进行观察。50 mL 实验组外周血单个核细胞中，非贴壁细胞共 8×107，采用 AIM-V 无血清培养基培养，经 14 d 诱导， CIK 细胞体积增大，呈明显多形性、集落生长，细胞总数为 2×109，增加 25 倍，CD3+、CD56+ 双阳性细胞达到 14.41%，CD3+ 细胞 92.01%，CD56+ 细胞 15.18%。对照组非贴壁细胞 1×107，经 14 d 诱导， CIK 细胞总数为 3.8×108，增加 38 倍，CD3+、CD56+双阳性细胞达到 7.96%，CD3+ 细胞 97.52%，CD56+ 细胞 9.97%。两组的 CIK 细胞产出总数、产出率及 CD3+、CD56+ 双阳性细胞阳性率均有非常显著性差异（P < 0.01）。 CIK 细胞的细胞毒活性 采用非放射性乳酸脱氢酶释法检测 CIK 细胞的细胞毒活性，其基本原理是，细胞溶解后释放乳酸脱氢酶，根据效靶细胞共同培养 4 h 后上清液乳酸脱氢酶浓度确定细胞溶解率。 靶细胞溶解率公式为： 经外周血干细胞动员乳腺癌患者（实验组）和未动员健康人外周血（对照组）诱导 CIK 细胞 14 d 不同效：靶比靶细胞的溶解率见。 近年来，对 DCs 在肿瘤免疫调节中的作用进行了深入研究，认为 DCs 是调节免疫反应的核心，已有体外诱导培养 DCs 进行肿瘤治疗的Ⅰ期临床研究。CIK细胞具有杀瘤活性高，对正常组织毒性低，体外可高度扩增的特点，是理想的用于临床肿瘤过继免疫治疗的杀伤细胞。本研究设计对乳腺癌患者进行外周血干细胞动员，应用治疗级 AIM-V 无血清培养基进行 DCs 和 CIK 细胞培养，用国产市售重组 IL-2 代替进口试剂进行 CIK 诱导，并与 DCs 和 CIK 细胞标准培养诱导系统进行对照研究，探讨获得大量自体 CDs、CIK 细胞和建立符合临床治疗标准的培养诱导系统的可行性，为乳腺癌患者进行临床治疗提供依据，目前尚无类似研究。 获得大量高纯度 PBMC 是诱导大量自体 DCs 和CIK 细胞、满足临床治疗的基础。常规方法分离PBMC 产出率低，难以满足临床治疗的需要。本研究用 GM-CSF 对乳腺癌患者进行外周血干细胞动员 5 d 后，抽取 50 mL 外周血，获得了 2×108 高纯度 PBMC，显著高于对照组。采用 AIM-V无血清培养基代替 RPMI 1640 完全营养培养基，目的是为避免异重蛋白对患者引起的不良反应。经 7 d 诱导，实验组 DCs 产出量明显高于对照组，达到 1.2×107，流式细胞 CD11c、CD86 和 HLA-DR 表达显示，采用AIM-V 无血清培养系统可诱导出与 RPMI 1640 全营养培养基同样成熟的 DCs。结果显示，经外周血干细胞动员，少量抽取乳腺癌患者外周血，可大量诱导成熟 DCs，用于乳腺癌的过继性免疫治疗。 尽管一些研究报道，外周血非贴壁单个核细胞经 3 周诱导，CIK 细胞总数可增加 1 000 倍以上，我们的前期研究显示，外周血单个核细胞产出率个体差异非常大，要诱导达到治疗量的自体 CIK 细胞，仍需要抽取大量外周血或采用其它昂贵的方法，增加了治疗费用和风险。我们的研究结果显示，经外周血干细胞动员，50 mL 外周血除可大量诱导 DCs 外，经 14 d 无血清培养基和国产重组 IL-2 诱导可产出 2×109 自体 CIK 细胞，可达到临床治疗量，CD3+CD56+ 双阳性细胞阳性率高于同期对照组。诱导 14 d 细胞毒检测显示，虽然对照组细胞毒活性在效靶 40:1 高于实验组，但在效靶 5:1、10:1、20:1 均无显著性差异，具有高效的杀瘤活性。 综上所述，乳腺癌患者经外周血干细胞动员，用 AIM-V 无血清系统培养，少量外周血可诱导大量优质自体 DCs 和 CIK 细胞，可能成为对乳腺癌患者进行 DCs-CIK 序列治疗的良好方法。
