啤酒废酵母中乙醇脱氢酶提取工艺的研究

№.6 陕西科技大学学报 Dec.2007 Vol.25 J OU RNAL OF SHAANXI UN IV ERSIT Y OF SCIENCE&TECHNOLO GY ・41・3　文章编号:100025811(2007)0620041204啤酒废酵母中乙醇脱氢酶提取工艺的研究毛跟年,张晓霞,张云丽,遆艳萍(陕西科技大学生命科学与工程学院,陕西西安　710021)摘　要:以废弃的啤酒酵母为原料,采用超声辅助的方法对其中的AD H进行了提取.实验考察了料液比、啤酒酵母用量、p H、超声波功率、超声全程时间和提取液浓度对AD H提取效果的影响,进一步通过L9(33)正交试验对AD H的提取工艺进行了优化,得到了啤酒废酵母中AD H提取的最优方案为p H值8.5、超声功率320W、超声时间10min,在此条件下所得的AD H活力可达1806U/mL.关键词:啤酒废酵母;乙醇脱氢酶;提取中图分类号:Q554+.9 文献标识码:A0　引言乙醇脱氢酶(AD H)属氧化还原酶第一亚类,作用于-CHO H基团,是以NAD+、NADP+或PQQ为辅酶,催化伯醇和醛之间可逆反应的一种含锌金属酶,为胞内酶[124],已广泛应用于化工、医药、食品等工业领域.目前商品AD H多来源于动物肝脏,提取纯化工艺比较成熟,但其资源有限且价格昂贵,远远不能满足市场的需要,而啤酒厂废弃的啤酒酵母中含有大量的AD H.本文主要研究了从啤酒废酵母中提取AD H的工艺,为拓宽AD H的来源、降低AD H的生产成本提供了新的途径.1　材料与方法1.1　材料与设备(1)啤酒废酵母:由西安汉斯啤酒厂提供.(2)药品试剂:辅酶Ⅰ(NAD+)(Sigma公司生产),磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、乙醇等均为分析纯试剂.(3)仪器设备:H H22超声波细胞粉碎机(国华电器有限公司)、T G L216G台式离心机(宁波新芝生物科技股份有限公司)、UV29100紫外可见分光光度计(北京瑞利分析仪器公司)等.1.2　实验方法1.2.1　AD H活性测定AD H活性测定采用Vallec2Hoch法[5].将0.1mL AD H酶液与3mL p H为8.5的磷酸盐缓冲液混合,于37℃水浴预热5min,然后加入0.4mL的2M乙醇和0.1mL的4.5mM NAD+溶液,37℃水浴反应5min,立即置于沸水中灭活,于340nm波长处检测吸光度值.空白对照用蒸馏水代替加NAD+,其余均相同.AD H酶活力(U/mL)定义:将AD H在37℃每分钟氧化乙醇脱氢生成乙醛,即还原NAD+为NAD H,在340nm处测定的吸光度变化0.001作为一个活力单位(U).1.2.2　AD H的提取方法3收稿日期:2007-09-17作者简介:毛跟年(1962-),男,陕西省泾阳县人,教授,研究方向:生物制药陕西科技大学学报第25卷啤酒废酵母经反复冻融后离心浓缩,与一定体积的磷酸盐缓冲液混合,再在低于4℃的条件下采用超声波辅助的方法进行细胞破碎,每超声1s 间歇3s ,10000r/min 离心15min ,上清液在340nm 波长处测定吸光度值,计算AD H 活力.1.2.3　AD H 提取工艺的单因素实验在AD H 提取实验中,固定其他条件,以提取液中AD H 活力为指标,分别对料液比、样品处理量、提取液p H 、超声波功率、超声全程时间和提取液浓度进行考察,以确定各影响因素的适宜水平.1.2.4　AD H 提取工艺的正交试验在单因素实验的基础上,选择对AD H 提取效果影响较大的因素,以提取液中AD H 活力为指标,按照正交试验原理进行正交设计,每个水平设3个重复,对正交试验结果进行直观分析和极差分析,以确定啤酒废酵母中AD H 提取的最优方案.2　结果与讨论2.1　不同因素对啤酒废酵母中AD H 提取效果的影响2.1.1　料液比的确定表1　样品处理量对AD H 提取效果的影响啤酒废酵母/g磷酸盐缓冲液/mL AD H 活力/(U/mL )10202040350466在细胞超声破碎工艺中,提取液用量一般为样品处理量的3～5倍.但本实验通过对不同料液比下所得的AD H 活力进行比较,最终确定以啤酒废酵母量(w )∶提取液(v )为1∶2较为适宜.主要是由于实验所用材料为啤酒厂废弃的啤酒酵母,成分比较复杂,酵母菌体数量相对较少.选用较高的料液比例有利于提高单位提取液中AD H 的含量.2.1.2　样品处理量对AD H 提取效果的影响分别取10g 和20g 啤酒废酵母,按照1∶2的比例用p H 为8.5的0.01mol/L 磷酸盐缓冲液对AD H 进行超声辅助提取,超声波功率250W ,超声全程时间10min.提取液中ADH 活力的测定结果见表1.由表1可以看出,采用10g 和20g 啤酒废酵母在相同条件下进行超声辅助提取时,AD H 活力分别为350U/mL 和466U/mL ,后者不仅提取出的AD H 活性高,而且一次可以获得较多的粗酶液,故后续实验中均采用20g 的样品处理量.图1　p H 对AD H 提取效果的影响 图2　超声波功率对AD H 提取效果的影响2.1.3　p H 值对AD H 提取效果的影响取20g 啤酒废酵母,用不同p H 的磷酸盐缓冲液对AD H 进行提取,其他条件同2.1.2.提取液中AD H 活性测定结果如图1所示.由实验结果可知,啤酒废酵母中AD H 提取的适宜缓冲液p H 范围为8.5～9.5,在此范围内AD H 活性最高,升高或降低缓冲液的p H 值均可导致AD H 活力降低.2.1.4　超声波功率对AD H 提取效果的影响将20g 啤酒废酵母用p H 为8.5的磷酸盐缓冲液在不同功率的超声波下进行提取,其他条件同2.1.2.提取液中AD H 活性测定结果如图2所示.由实验结果可知,适宜于啤酒废酵母中AD H 提取的超声功率在320W 左右.超声波功率不同,AD H 的提取结果差异较大.AD H 为胞内酶,较低的超声波功率无法・24・第6期毛跟年等:啤酒废酵母中乙醇脱氢酶提取工艺的研究实现啤酒酵母细胞的充分破碎,AD H 不能完全释放出来.但若超声波功率太大,则产生的高温会对AD H 的活性造成影响,故在后续的AD H 提取工艺中超声波功率选定为320W.图3　超声全程时间对AD H 提取效果的影响 图4　提取液浓度对AD H 提取效果的影响2.1.5　超声全程时间对AD H 提取效果的影响将20g 啤酒废酵母采用功率为320W 的超声波按不同处理时间进行提取,其他条件同2.1.2.提取液中AD H 活力的测定结果如图3所示.由实验结果可知,超声处理全程时间不同时AD H 的提取结果也有所不同,处理时间过短不利于酵母细胞完全破碎,处理时间过长则会产热升温而使AD H 活性降低,比较适宜的超声全程时间在10min 左右.故在后续的AD H 提取工艺中,采用功率为320W 的超声波在全程时间10min 下进行实验.2.1.6　提取液浓度对AD H 提取效果的影响选用不同浓度的缓冲液,在功率为320W 的超声波下全程处理10min 对20g 啤酒废酵母进行提取,其他条件同2.1.2,AD H 活性测定结果如图4所示.由实验结果可知,在所选的提取液浓度范围内,AD H 的提取效果随着提取液浓度的增加而升高,但最终确定提取液浓度以0.08mol/L 较为适宜.考虑到温度较高时AD H 活力下降较快,故整个提取过程是在冰浴状态下进行的,以维持提取液温度在4℃以下.由于0.08mol/L 磷酸盐缓冲液在4℃以下时已接近饱和,因此继续提高提取液浓度对提取AD H 意义不大.表2　L 9(33)正交试验结果序号A (p H 值)B (超声波功率)/W C (超声全程时间)/minAD H 活力/(U/mL )18.5(1)280(1)10(1)161228.5(1)320(2)15(2)163838.5(1)360(3)20(3)177849.0(2)280(1)15(2)151859.0(2)320(2)20(3)165469.0(2)360(3)10(1)162279.5(3)280(1)20(3)17489.5(3)320(2)10(1)118899.5(3)360(3)15(2)474Ⅰ502832844422Ⅱ483445203630T =Ⅰ+Ⅱ+ⅢⅢ181638743626R321212367962.2　啤酒废酵母中AD H 提取工艺条件的优化根据单因素实验结果,以提取液p H 、超声波功率和超声全程时间为影响因素,提取液中AD H 活力为考察指标,设计了L 9(33)正交试验,实验结果见表2.2.2.1　极差分析由正交试验表极差分析所得的极差值R 的大小可以看出,3个因素对AD H 提取效果的影响大小依次为A >B >C ,即提取液p H >超声波功率>超声全程时间.比较正交表中各列的位级值大小可以得出AD H 提取的最优方案为A 1B 2C 1,即提取液p H 为8.5、超声波功率为320W 、超声全程时间为10min.但此方案并未出现在上述正交表中,故需对其进行验证性实验.2.2.2　方案验证取20g 啤酒废酵母,加入p H 为8.5的0.08mol/L 磷酸盐缓冲液40mL ,超声波功率为320W ,每超声1s 间歇3s ,超声全程时间10min ,操作温度控制在4℃以下.经3次重复实验,测得提取液中AD H 活力平均值为1806U/mL ,高于正交表中的最高值1778U/mL ,可见极差分析得到的提取方案可以作为啤酒废酵母中AD H 提取的最优方案.・34・陕西科技大学学报第25卷3　结论(1)运用超声辅助的方法对啤酒废酵母中的AD H 进行提取,得到的最优工艺条件为:20g 啤酒废酵母中加入p H 为8.5的0.08mol/L 磷酸盐缓冲液40mL ,采用的超声波功率为320W ,每超声1s 间歇3s ,超声全程时间为10min ,操作温度控制在4℃以下.在此条件下,获得的提取液中AD H 活性最高,可以达到1806U/mL.(2)研究表明,AD H 在温度较高时活力容易损失,故AD H 提取过程宜在低温下进行.将细胞冻融破碎法与超声辅助提取工艺相结合用于啤酒废酵母中AD H 的提取,既可减少高温对AD H 活性的影响,又能促进啤酒酵母细胞破碎,提高AD H 的提取效果.(3)目前,国内外市场中的AD H 多来源于动物肝脏,资源有限,价格昂贵.由于本研究从废弃的啤酒酵母中提取AD H ,既可省略复杂的微生物发酵过程,大大减少人力、物力和财力投入,降低生产成本,又能充分利用工业废弃物,减少工业废弃物所造成的环境污染,因此是拓宽AD H 来源的一条好途径.参考文献[1]Suck 2Y oung Y oon ,Hyang 2soon Noh ,Eun 2Ho K im ,et al .The highly stable alcohol dehydrogenase of T hermomicrobi um roseum :pur 2ification and molecular characterization[J ].Comparative Biochemistry and Physiology Part B ,2002,132:4152422.[2]J ulija Razumiene ,Vidut Gureviciene ,Aist Vilkanauskyt.Improvement of screen 2printed carbon electrodes by modification wit h ferro 2cene derivative[J ].Sensors and Actuators B ,2003,95:3782383.[3]Helmut Grisch.The et hanol oxidation system and it s 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1806U/mL.K ey w ords :abandoned beer yeast ;alcohol dehydrogenase (AD H );ext raction・44・。