转基因植物的分子检测与鉴定方法及进展
随着分子生物学和植物基因工程的不断发展，越来越多的育种工作者开始利用转基因技术获得常规育种技术难以得到的新种质和新品种。植物转基因技术最大的好处在于可以打破自然界物种间原有的生殖隔离，促进基因在不同物种间的交流，极大地丰富变异类型，增大遗传多样性，为植物新品种的培育提供丰富的育种资源。通过对基因功能的研究，筛选m目的基因，还可实现植物性状的定向改良。因此该技术自1983年首次获得转基因植物以来，便深受育种工作者青睐，得到了蓬勃地发展。至今已有30多科约200多种植物转基因成功；国际上相继有30多个国家批准3 000多例转基因植物进入田间试验，并且在美国、加拿大、中国等20多个国家成功进行了商品化生产…。到2006年止，全球转基因作物的商业种植面积达1．02亿hm2，比2005年增长13％，是1996年的62倍。转基因作物品种在农业生产中日益显现出巨大潜力。
植物转基因操作中，除利用抗生素抗性和除草剂抗性等选择基因排除非转化细胞而留存转化细胞，以及利用Gus和CFP等报告基因显示转基因成功外，更重要的是从分子水平鉴别出阳性转化体，明确目的基因在转基因植株中的拷贝数和转录与表达情况。本文就常用的转基因植株检测与鉴定方法作一概述，并对近期发展起来的新方法做简要介绍。
1 外源基因整合与否及其整合拷贝数的鉴定
1．1 PCR(p01 ymera se chain reaction)检测
1．1．1 常规PCR
PCR技术对目的片段的快速扩增实际上是一种在模板DNA、引物和4种脱氧核糖核苷酸存在的条件下利用DNA聚合酶的酶促反应，通过3个温度依赖性步骤(即变性、退火和延伸)完成的反复循环。经PCR扩增所得目的片段的特异性取决于引物与模板DNA间结合的特异性。根据外源基因序列设计出一对引物，通过PCR反应便可特异性地扩增出转化植株基因组内外源基因的片段，而非转化植株不被扩增，从而筛选出可能被转化的植株。
由于PCR检测所需的DNA用量少，纯度要求也不高，不需用同位素，实验安全，操作简单，检测灵敏，效率高，成本低，使之成为当今转基因检测不可或缺的方法，被广泛应用。然而，PCR检测易出现假性结果。引物设计不合理，靶序列或扩增产物的交叉污染，外源DNA 插入后的重排、变异等因素都会造成检测的误差。因此常规PCR的检测结果通常仅作为转基因植物初选的依据，有必要对PCR技术进行优化，并对PCR(real-time quantitative PCR)检测为阳性的植株做进一步验证。
1．1．2 优化的PCR
PCR技术的优化目的在于提高扩增产物的特异性、推测目的基因的拷贝数及整合情况，从而提高检测的效率。常见的有多重PCR(Multiplex PCR， MPCR)、降落PCR(Touchdown PCR，TD-PCR)、 rpPCR、反向PCR(inverse PCR，IPCR)、实时定量 PCR等。
1．1．2．1 多重PCR
MPCR是在同一管PCR反应体系中，使用多套针对多个DNA模板或同一模板的不同区域进行PCR扩增的方法。与普通PCR法相比，MPCR反应更快捷，更经济，只需1次PCR反应，就能检测多个靶基因。 Matsuoka等用该方法同时扩增出了转基因玉米的5种外源基因Btll，Btl76Mort810，T25and GA21。陈明洁等用MPCR对转基因小麦植株的报告基因uidA和选择基因hat进行扩增，MPCR的检测结果与单基因的PCR检测结果完全一致。
由于MPCR技术是在同一反应管中加多对引物同时对多个靶位点进行检测，因此对引物的要求较高，不同引物间的相互干扰应降至最低；同时扩增的目的片段大小也不能太接近，否则凝胶电泳时难以分开，无法辨别。
1．1．2．2 降落PCR
TD-PCR是一种在一个反应管或少数几个反应管中通过一系列退火温度逐渐降低的反应循环来达到最佳扩增目的基因的PCR方案。它通过体系自身的代偿功能弥补以反应体系和并非完美的循环参数所造成的不足。此策略保证了最初形成的引物模板杂交体具最强的特异性。尽管最后一些循环采用的退火温度会降到非特异的Tm值，但此时的扩增产物已开始几何扩增，在余下的循环中处于超过任何非特异性PCR产物的地位，从而使PCR产物仍然呈现出特异性扩增。 R．H．Don等认为，PCR过程中的前几个循环对于扩增产物的纯度非常重要，因此前几个循环较高的退火温度，会增加引物与模板结合的特异性，TD-PCR方法可以阻止非特异性产物的形成。由于TD-PCR的策略是在较早的循环中避免低Tm值配对，故在TD—PCR中必须采用热启动技术。田路明等用TD-PCR对高羊茅转基因植株两个片段进行了扩增，结果表明TD— PCR能快速准确检测转基因植株。
1．1．2．3 rpPCR
F}1于外源基因整合到目标基因组时常发生重排，因此Southern杂交并不能清楚地分析转基因的拷贝数和整合情况。Kumar和FladungIvl在研究转基因杨树的外源基因整合行为时发明了rpPCR方法。这种方法就是利用不同的引物进行配对，对基因组DNA扩增，根据不同的引物对的扩增情况及产物的大小来推定 T-DNA的拷贝数、整合情况及拷贝的完整性等信息。与Southern杂交相比，该法的优点在于能比较方便快捷地指出重复单位是否完整，并能表明这种重复的方向。此方法的不足之处是在有多拷贝整合在不同的染色体上时不能显示作用㈣。
1．1．2．4反向PCR
IPCR与普通PCR相同之处是都有一个已知序列的DNA片段，引物都分别与已知片段的两末端互补。不同的是对该已知片段来说，普通PCR两引物的3、一末端是相对的，而IPCR则是相互反向的。因而 IPCR可以扩增已知序列片段旁侧的未知序列。根据这一特点，可以对外源基因在植物基因组中整合的拷贝数进行分析，多拷贝多位点整合时，扩增产物在电泳图谱上呈现多条带，单拷贝时只得到一条带。
然而，该技术要求DNA模板复杂度低于109bp，如果高于此值，则不能获得理想的效果。另外，自连接(环化)的效率也是限制该技术成功的因素。
1．1．2．5 实时定量PCR
实时定量PCR是一种在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法…1。其特点是：特异性好，实时定量PCR技术通过引物或和探针的特异性杂交对模板进行鉴别，具有很高的准确性，假阳性低；灵敏度高，采用灵敏的荧光检测系统对荧光信号进行实时监控；线性关系好，由于荧光信号的强弱与模板扩增产物的对数呈线性关系，通过荧光信号的检测对样品初始模板浓度进行定量，误差小；操作简单，自动化程度高，实时定量PCR技术对PCR产物的扩增和检测在闭管的情况下一步完成，不需要开盖，交叉污染和污染环境机会少；没有后处理，不用杂交、电泳、拍照。
Ingham等研究发现可用双向实时定量PCR检测转基因植物中的外源基因拷贝数。他们通过对37个株系的实时定量PCR检测，发现仅有2个株系是由于多个拷贝同时插人到了1个位点而与Southern结果不符，其余35个株系的双向实时定量PCR检测结果与 Southern结果高度吻合，表明实时定量PCR技术可用于检测转基因植物的拷贝数。杜春芳等则建立了一种双重定量PCR技术鉴定转基因植物纯合子的新方法，该方法能鉴定出转基因植株是纯合型还是杂合型，并能准确鉴定出转化植株外源基因的拷贝数，为鉴定转基因植物的整合性提供了方便。
1．2 Southe rn杂交
Southern杂交是利用经过标记的DNA、RNA探针与靶DNA进行特异性杂交，分析外源基因在植物染色体上的整合情况(如拷贝数、插人方式)以及外源基因在转基因后代的稳定性问题。Southern杂交可以不受操作过程中的DNA污染影响和清除转化中的质粒残留所引起的假阳性信号，准确度高同，特异性强，是研究转基因植株外源基因整合最可靠的方法。已广泛应用于水稻、小麦、玉米、大豆、油菜、桃等各类作物转基因植株的检测。然而该方法程序复杂，成本高，且对实验技术条件要求较高，使其使用受到了限制。
2 外源基因在转化植株中是否转录的检测与鉴定
2．1 Nor t hern杂交
外源基因在转化植株中的转录水平可以通过细胞总RNA和mRNA与探针杂交来分析，称为Northern杂交，它是研究转基因植株中外源基因表达及调控的重要手段。Northern杂交程序一般分为三个部分：植物细胞总RNA的提取探针的制备印迹及杂交。Northem杂交比Southern 杂交更接近于目的性状的表现，因此更有现实意义。如竺晓平、孙辉、刘君等用Northem杂交分别对马铃薯、水稻、烟草的目的基因表达进行了鉴定。
但Northern杂交的灵敏度有限，对细胞中低丰度的mRNA检出率较低。因此在实际工作中更多的是利用RT-PCR(reverse transcription PCR)技术对外源基因的转录水平进行检测。
2．2 RT—PCR
RT-PCR的原理是在反转录酶作用下，以待检植株的mRNA合成cDNA，再以cDNA为模板扩增出特异的DNA。因此，RT-PCR可在mRNA水平上检测目的
基因是否表达。RT-PCR十分灵敏，能够检测出低丰度的mRNA，特别是在外源基因以单拷贝方式整合时，其mRNA的检出常用RT-PCR。
Samia Diennane等把烟草硝酸还原酶基因Nia2经农杆菌介导导人马铃薯，经RT-PCR分析，Nia2基因在转基因马铃薯体内RNA水平得到表达。周苏玫等。以皖麦48为受体导人反义trxs基因，研究抗穗发芽特性，用RT-PCR检测trxs基因的转录水平，结果表明反义trxs 基因正常表达的阳性植株，lrxs基因mRNA的丰度极显著降低，从而起到抵制穗发芽的作用。
由于RT-PCR是在总RNA或mRNA水平上操作，检测过程中必须注意RNA的降解和DNA的污染，另外还要设置严格的对照来防止假性结果的出现。
3 转基因植株外源基因表达情况的检测与鉴定
尽管在mRNA水平也能一定程度地研究外源基因的表达，但存在mRNA在细胞质中被特异性地降解等情况，mRNA与表达蛋白质的相关性不高(相关系数低于0．5)，基因表达的中间产物mRNA水平的研究并不能取代基因最终表达产物的研究。转基因植株外源基因表达的产物一般为蛋白，外源基因编码蛋白在转基因植物中能够正常表达并表现出应有的功能才是植物基因转化的最终目的。外源基因表达蛋白检测主要利用免疫学原理，ELISA及Western杂交是外源基因表达蛋白检测的经典方法。
3．1 ELI SA检测
E LIsA是酶联免疫吸附法(en zvme—linked immunosorbent assays)的简称，基础是抗原或抗体的同相化及抗原或抗体的酶标记，把抗原抗体反应的高度专一性、敏感性与酶的高效催化特性有机结合，从而达到定性或定量测定的目的。ELISA有直接法、间接法和双抗夹心法之分，目前使用最多的是双抗夹心法，其灵敏度最高。一般ELISA为定性检测，但若作出已知转基因成分浓度与吸光度值的标准曲线，也可据此来确定样品转基因成分的含量，达到半定量测定。该方法已在棉花、辣椒、水稻、烟草、番茄等多种转化植株的检测中应用。
使用ELISA检测外源基因表达蛋白具有便捷、灵敏、特异性好、试剂商业化程度高、成本低、适用范围广、试验结果易读等特点。但也存在易出现本底过高，缺乏标准化等问题。
3．2 we s t ern杂交
Western杂交是将蛋白质电泳、印迹、免疫测定融为一体的蛋白质检测技术，其原理是将聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS—PAGE)分离的目的蛋白原位固定在固相膜上(如硝酸纤维膜)，再将膜放人高浓度的蛋白质溶液中温育，以封闭非特异性位点，然后在印迹上用特定抗体(一抗)与目的蛋白(抗原)杂交，再加人能与一抗专一结合的标记二抗，最后通过二抗上的标记化合物的性质进行检出。根据检出结果，可知目的蛋白是否表达，浓度大小及大致的分子量。此方法特异性高，可用于定性检测。
由于Western杂交是在翻译水平上检测目的基因的表达结果，能够直接表现出目的基因的导人对植株的影响，一定程度上反映了转基因的成败，所以具有非常重要的意义，被广泛
采用。该方法已应用于炯草139,401、青蒿、枸杞、杨树等相关目的基因导入后的表达。Western 杂交的缺点是操作烦琐，费用较高，不适合做批量检测。
4转基因植株检测的其它技术
4．1 基因芯片技术
生物芯片技术是起源于核酸分子杂交，于20世纪80年代提出，90年代初期迅速发展，l 99 1年 Affymetrix公司Fodor小组对原位合成的DNA芯片作了首次报道。生物芯片(biochip)是指高密度固定在固相支持介质上的生物信息分子(如寡核苷酸、基因片段、eDNA 片段或多肽、蛋白质)的微阵列。生物芯片可分为基因芯片及蛋白质芯片。这两类芯片都可用于转基因植物的检测与鉴定，但目前应用潜力较大的是用于转基因植株中外源基因表达调控的eDNA芯片。eDNA芯片能够检测出由外源基因整合及外源基因不同的整合方式所引起的植物基因组任何微小的表达差异。将不同被测样品的mRNA分别用不同的荧光物质标记，各种探针等量混合与同一阵列杂交，可以得到外源基因表达强度差异的信息，从而实现外源基因表达调控的比对研究。如用基因芯片比较转基因植物和野生型植物的基因表达水平差异，HAT4基因在转基因植物中的表达水平是其野生型的50倍。将目前通用的报告基因、选择标记基因、目的基因、启动子和终止子的特异片段固定于玻片上制成检测芯片，与从待检植株抽提、扩增、标记后DNA杂交，杂交信号经扫描仪扫描后，再经计算机软件进行分析判断，可对转化植株进行有效筛选。例如，利用基因芯片对转基因水稻、木瓜、大豆、玉米、油菜等怍物的检测结果表明，该方法快速、准确。
与常规技术相比，生物芯片技术的突出特点是高度并行性、多样性、微型化及自动化。
目前，由于受到成本高的局限，使得该项技术的推广应用受到了限制，同时，一些假阳性背景也使得其应用受限。相信随着生命技术的不断向前发展，计算机处理软件的进一步开发利用，生物芯片必将得到越来越多的应用。
4．2试纸条技术
与ELISA原理相似，不同之处是以硝化纤维膜代替聚苯乙烯反应板为固相载体。先将特异性抗体吸附在膜上，将膜放入混有样品的溶液中，蛋白质随着液相扩散，遇到抗体，发生抗原一抗体反应，通过阴性对照筛选阳性结果，并给出转基因成份含量的大致范围。试纸条方法是一种快速简便的定性检测方法，将试纸条放在待测样品抽提物中，5～10rain就可得出检测结果，检测过程不需要特殊仪器和熟练技能，经济便捷，特别适用于田间和现场检测。Akiyama H等用试纸条检测了转基因水稻中Cr'clAe蛋白质的含量，精度可达0．012 mg·g-1。但试纸条检测只能对特定的单一靶蛋白进行检测。
另外，近来有文献报道了试纸条检测技术的新发展，可利用试纸条技术对样品中某一核酸序列进行特异性的检测，并且实现了在同一试纸条上对多个核酸序列的同时检测。这无疑拓展了这项技术的应用范围，有助于检测效率的提高。
4．3原位杂交技术
原位杂交是通过杂交确定被检物在样本中的原本位置，是目前外源基因在染色体上定位及外源基因在组织细胞内表达定位的主要方法。染色体DNA原位杂交可用来确定外源基因在染色体上的整合位置，对研究外源基因遗传特陛有重要意义。许多实验表明位置效应是影响外源基因稳定及表达的重要因素。 mRNA原位杂交可直观地观察到外源mRNA的表达量及不同发育时期表达有否差异。外源基因表达蛋白的组织细胞免疫定位可用来确定表达蛋白在转基因植物组织及细胞中的分布，成为研究转基因植物中外源基因功能及外源蛋白稳定性的重要手段。A．P．Santos等报道了利用原位杂交技术使不同组织和物种在分裂间期的外源基因(包括单拷贝基因)和它的转录本可视化，与在细胞分裂中期研究基因行为相比，因基因(外源基因)的表达主要是发生在染色体分裂间期的，因此更直观、更有意义，有助于准确预测外源基因是否表达，可望减少外源基因后期检测时间。王逸群等利用蛋白免疫原位杂交法研究了转基因植物外源基因表达，认为该法比Western杂交操作简便、有效可行，适用于在翻译水平上对转基因植物进行分子检测。
4．4 其它方法
近几年还发展了一些新的外源基因的检测方法，如质谱分析、色谱分析、生物传感器、近红外光谱163l、微纤维装置(Microfabricated Device)等，在转基因植物检测中都有应用。
5 展望
综上所述，转基因植物的检测方法有很多。PCR可以检测目的基因是否整合在受体细胞的染色体上，但PCR检测灵敏，易受DNA污染，同时对多位点插入难以检测。检测外源基因整合在植物染色体上最可靠的方法就是Southern杂交和原位杂交。Southern杂交可检测外源基因插入的拷贝数和插入方式，是一种较为精确的分析，也是目前鉴定外源基因存在于转基因植物中的权威方法；原位杂交是可以检测外源基因存在的位置、整合外源基因的染色体及外源基因在该染色体上的位置。在外源基因的转录水平上，可用 Northern杂交和RT-PCR 检测。Northern杂交是研究转基因植物中外源基因表达的重要方法，然而较烦琐，而RT-PCR 较之操作简单，且更灵敏，特别是单拷贝时更常用。外源基因若编码蛋白，在转基因植物中表达蛋白的检测可采用ELISA和Western杂交。用 Western杂交检测外源基因是否表达，用ELISA则可做定量检测，两者常结合起来应用。
从转基因植物的检测技术的来看，新技术不断涌现，多种技术相互结合，互相补充，朝着高效、便捷、安全、自动化方向发展。
致谢：承蒙张兴国教授在写作过程中给予的热情指导与帮助，谨致以衷心的感谢!
热带农业科技，2008，31(1)
贺熙勇1，2，陈善春2，彭爱红2
(1．西南大学园林园艺学院，重庆北碚，4 007l 6；
2．云南省热带作物科学研究所，云南景洪6 6 6100)：
3．中国农业科学院柑橘研究所，重庆北碚4 0 0 71 2)
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转基因高通量检测技术研究进展 转基因高通量检测技术，是一种能快速、准确地检测转基因生物的方法，其应用范围 非常广泛。该技术主要基于DNA序列的变化进行检测，通过PCR扩增、酶切、芯片、测序 等多个技术手段来进行鉴定。本文将介绍目前转基因高通量检测技术的研究进展。 一、PCR扩增技术 PCR扩增技术是一种基于DNA分子生物学技术的检测方法，通过对转基因生物中特定 基因的DNA序列进行扩增，从而得到转基因生物的检测结果。近年来，随着PCR技术的不 断改良，如多聚酶链式反应（qPCR）、数字PCR等，PCR扩增技术的检测灵敏度和准确性得到了极大的提高，已经成为一种产业化的检测手段。 二、酶切技术 酶切技术是利用内切酶来识别、切割特定DNA序列的方法，从而确定转基因生物的存在。该技术主要应用于转基因成分比例的检测，可以检测生物材料中转基因成分的所占比例，能够监管遗传物质的流向和外源基因的输送，保证食品的安全性。 三、芯片检测技术 芯片检测技术是一种基于微阵列技术的检测方法，通过构建转基因生物特定DNA序列 的探针，将其固定于芯片表面，再将待检测的DNA样品与芯片进行杂交反应，通过读数分 析图像信号来判断是否存在转基因生物。该技术可以在同一芯片上鉴定多个转基因标记物，检测效率较高。 四、测序技术 测序技术是一种基于DNA序列分析的检测方法，能够准确、快速地鉴定转基因生物。 该技术分布式测序、二代测序、第三代测序等多种技术，其中二代测序技术应用最为广泛。二代测序技术通过高通量测序技术对DNA进行大规模并行测序，能够检测出所有的转基因 标记物，不仅可以实现精确可靠的检测，还能够对转基因材料的来源进行追溯和溯源，探 索种质资源的组成和演化规律。 综上所述，转基因高通量检测技术的发展已经走过了普及应用的初期阶段，现已成为 食品安全、医药研发、生物实验等领域不可或缺的重要技术手段。随着技术的进步和创新，该技术将会继续得到完善和发展，为转基因食品检测提供更加可靠和有效的保障。
农杆菌转化法及转基因植物检测方法 摘要：近年来，植物基因工程技术飞速发展，转基因植物在很多领域的研究推广取得了令人瞩目的成绩。植物基因工程中常用的转化方法一般是通过土壤农杆菌系统、植物病毒系统和DNA直接导入法这三种方法进行。另外，转基因技术快速发展的同时转基因植物检测技术也在不断地进歩和完善，目前被广泛应用的转基因植物检测方法有三类：整合水平上的检测、转录水平上的检测和表达水平上的检测。本文着重对农杆菌介导的植物转化方法和转基因植物的检测两方面进行综述。 关键词：农杆菌，转化，转基因植物，检测方法 伴随着生命科学的飞速发展，植物组织培养技术以及植物组织分化、植物基因重组等技术发展迅速并得到广泛应用。1984年转基因烟草的诞生[1]，使外源基因导入植物细胞从而获得转基因新品种的设想成为现实。随后，转基因技术被广泛应用于各个方面如：植物新品种的改良、植物性状改良、植物抗性的提高以及植物基因功能的研究等[2-4]。新型转基因大豆、转基因番茄及转基因玉米等转基因新品种陆续面世[5]。植物转基因技术不但能够打破植物的物种界限，还能够使物种基因彼此进行交流。使植物育种年限缩短，植物育种进程加快，植物抗性也在一定程度上得到很大提高，使来自于不同生物种类的优良目的基因导入植物并得到优良植物新品种。同时，运用转基因技术研究植物自身基因结构组成及其基因功能调控等方面也取得了一定成果；运用转基因技术还研制出生物反应器和雄性不育系[6]。 目前，利用转基因技术将目的基因导入植物基因组中的常用方法主要有：土壤农杆菌介导的基因转化、DNA直接导入和植物病毒系统介导法。本文着重介绍土壤农杆菌介导的目的基因转化法，同时也对目前转基因植物的检测进行适当总结。 1 土壤农杆菌介导系统的种类 土壤农杆菌中的发根农杆菌和根癌农杆菌能够侵染植物伤口并形成与土壤农杆菌中大质粒有关的植物肿瘤和冠瘿。能够诱发此类肿瘤的根瘤农杆菌中常常
植物基因转化及转基因植物的分析与鉴定 1. 引言 植物基因转化是一种重要的生物工程技术，利用这种技术 可以引入外源基因或修改内源基因，从而改变植物的性状和功能。转基因植物是通过植物基因转化技术获得的具有外源基因的植物，具有重要的应用价值。本文将介绍植物基因转化的基本原理和方法，并探讨转基因植物的分析与鉴定方法。 2. 植物基因转化的基本原理和方法 2.1 基本原理 植物基因转化利用穿透细胞壁的技术，将外源DNA导入植物细胞，通过细胞的内源机制使其稳定地表达。常用的植物基因转化方法包括农杆菌介导的转化、生物弹射法和基因枪法等。 2.2 基本方法 2.2.1 农杆菌介导的转化 农杆菌介导的转化是最常用的植物基因转化方法之一。基 本步骤包括构建表达载体、感受剂的处理和遗传转化的选择和鉴定。
构建表达载体时，将目标基因插入适当的载体上，并添加 转录和翻译的调控序列，如启动子和终止子，以确保目标基因的表达。 感受剂的处理是将表达载体导入农杆菌中，并通过培养条 件的优化，使农杆菌中的表达载体得到高效表达。 遗传转化的选择和鉴定是将感受剂经过适当的处理后，转 化到植物细胞中，并通过筛选和鉴定来确定转化成功的细胞株。 2.2.2 生物弹射法 生物弹射法是将DNA以高速撞击植物细胞，使其穿透细胞的质壁和细胞膜，进而将外源基因导入细胞内。生物弹射法通常使用微粒子加速器或毛发管射击法进行。 微粒子加速器是一种将金属微粒或微球与外源DNA一起加速，并将其发射到目标细胞上的设备。通过微粒的高速撞击，外源基因能够穿透细胞的质壁和细胞膜。 毛发管射击法是将DNA包裹在微小的金属颗粒上，然后使用高压气体将金属颗粒射击到目标细胞上。这种方法也能够使外源基因穿透细胞膜进入细胞。
转基因植物食品检测技术研究进展 摘要：随着基因工程技术的不断发展，人类可以通过改变生物遗传特性，获 得新品种和新产品。其中，转基因食品作为一种新型的农业生产和食品加工技术，逐渐被研发和商业化种植。然而，由于其安全问题备受关注，对转基因食品的安 全性问题也日益引起人们的关注。目前，对于转基因食品安全与否的问题，尚未 有确切的定论。因此，需要深入研究转基因食品安全检测技术，以保障食品的安 全性。本文的主旨在于阐述转基因食品所遇到的问题与挑战，并分析其检测技术 方法，以加强食品安全，探究转基因食品的安全性，促进基因技术的不断发展。 关键词：转基因植物；食品检测技术；策略 1转基因植物食品检测的意义 转基因食品安全性备受关注，人们对此十分关注。在这种情况下，提高转基 因植物检测技术和建立科学的管理体系，才能保证转基因食品的安全性。这是一 个非常重要的问题，需要我们共同努力解决。要保证转基因食品安全性，不仅需 要检测技术的提高，还需要从生产链上提高要求，规范市场导向，可以引导积极 的价值观。这一点非常重要，因为只有当市场导向向好的方向发展时，才能确保 转基因食品的质量和安全性。检测技术的发展可以淘汰不合格的产品，同时也促 使转基因公司更加重视产品质量把控。这是一个良性循环，有利于转基因食品产 业链的健康有序发展。这样，人们才能更加放心地食用转基因食品，从而进一步 促进这个产业的发展和壮大。 2相关性质探究 随着科技的不断发展，转基因食品已经成为人们日常饮食中的一部分。然而，这些食品中可能存在抗生素抗性基因，使得人类在使用抗生素治疗时出现抗药性 问题。此外，转基因植物还可能通过水平基因转移，将抗生素抗性基因传递给其 他微生物，从而扩大抗生素抗性的范围，对公共卫生造成潜在威胁。抗生素抗性 是一个全球性问题，对人类健康造成了严重威胁。转基因食品中存在抗生素抗性
植物分子遗传学的进展 植物分子遗传学是一门研究植物基因结构和功能、遗传变异及 其遗传规律的学科，近年来，随着分子生物技术的飞速发展，植 物分子遗传学也迎来了新的发展和突破。 一、分子标记技术 分子标记是指分子生物学技术在植物育种中应用的一种方法， 通过对基因座DNA序列遗传多态性的分析，来辅助植物育种工作。种类繁多的分子标记使得植物遗传学家能够对作物及其杂交后代 的遗传多样性进行更加精确、快速和高效的检测和分析。目前， 常用的分子标记有限制性片段长度多态性（RFLP）、序列标记（SSR）、扩增片段长度多态性（AFLP）等。 二、基因组学 随着分子生物学研究的深入，植物基因组学逐渐成为一门新兴 的学科。植物基因组学利用高通量测序技术对植物基因组中的所 有基因和非编码序列进行系统的测序和分析，从而研究植物的基 因功能、基因调控、基因互作和遗传多样性等问题。植物基因组
学的发展为我们深入了解植物的基因组结构和功能提供了重要的技术手段。 三、转基因技术 转基因技术是指将外源基因导入到植物细胞中，使其成为植物基因组的一部分，从而改变植物的遗传性状的技术。随着转基因技术的研究不断深入，越来越多的植物品种被开发出来。比如，一些高产、抗虫、抗病、抗旱的转基因作物已经逐渐成为农业生产中的重要种类。 四、CRISPR-Cas9技术 CRISPR-Cas9技术是目前热门的基因编辑技术之一，它可以精准地剪切基因组中的目标序列，并修复该基因组或在该基因组上进行修改。这种技术被广泛应用于植物基因组的编辑和改良，目前各种植物的基因编辑技术已经实现了精确、快速、高效的基因编辑，并满足了人们对作物的需求。
转基因作物快速检测技术进展与展望 近年来，随着转基因作物的广泛应用和种植，对于转基因作物的快速检测技术越来越受到关注。因为转基因作物具有一定的安全隐患，而政府和有关机构又要求对转基因产品进行严格的管理和检测，所以大力推进与发展转基因作物的快速检测技术已经成为当下的一个重要任务。本文将简单介绍转基因作物快速检测技术的现状与未来发展方向。 一、传统转基因作物检测方法 1. PCR法 PCR法（聚合酶链式反应）是一种常用的转基因快速检测方法，它的原理是基于DNA 的扩增，即让DNA分子在体外通过一系列反应条件得以精细拷贝，并能够对目标DNA分子定量分析。与其他检测方法相比，PCR法经济、快速、高效、对同种基因不同表达的鉴别效果非常显著。但是PCR法也存在一些缺点，其中主要的缺点包括产生假阴性、假阳性结果，其检测范围受到一定限制等问题。 2. 蚕豆胆囊减水法 蚕豆胆囊减水法是一种集样品制备和检测于一体的检测方法，它采用蚕豆越冬苗的冷却提取，去除胆囊和胆汁等杂质的方法，以达到有效地检测转基因组成的目的。这种检测方法的优点是便捷、实用，并且对于不同的转基因品种都有一定的检测敏感性和鉴别性。 3. 高效液相色谱法 高效液相色谱法是一种主要基于分离技术的检测方法，它利用不同成分在流动相中的物理、化学特性差别，相互进行有效分离。该方法的优点是简单明了、检测快速，同时也具备较高的质量控制水平，如分辨率、检测灵敏度、分离度等多个检测指标。但是该方法也有一些缺陷，如成本较高，依赖专业技能、需要预处理等问题。 除了传统的检测方法以外，基于近年来的技术进步，对于转基因作物的快速检测技术已经有了新的发展方向。下面将介绍一些当下主流的转基因快速检测技术。 1. 基因组学方法 基因组学方法主要针对目标序列进行定序、组装和注释，并建立相应的数据库和软件平台。因此，这种方法的优点在于它具备较高的准确性、快速性和高通量性，同时较少依赖于实验条件和实验者的技能水平，适用于不同来源、不同处理方式的特定转基因，在转基因检测中具有广泛的应用前景。 2. 光学免疫检测法
食物中转基因成分的快速检测技术研究进展 食物安全一直是人们关注的焦点之一。随着科技的不断发展，食品检测技术也 在不断提高。其中，食物中转基因成分的快速检测技术一直备受研究者关注。本文将对该技术的研究进展进行探讨。 传统的转基因食物检测方法往往需要一系列的实验步骤，耗时且复杂。然而， 随着生物学、化学和物理学等多学科知识的融合，现代食品检测技术得到了极大的提升。特别是分子生物学和生物技术的发展，为转基因食物检测提供了新的思路。 近年来，PCR（聚合酶链式反应）技术成为转基因食物检测中的重要手段。PCR技术通过特定序列的引物，将转基因成分与非转基因成分区分开来。该技术 具有高度灵敏度和特异性的优势，能够快速、准确地检测转基因成分的存在。然而，PCR技术仍存在一些局限性，例如无法区分不同转基因品种和检测中存在交叉反 应的可能性。 为了克服PCR技术的局限性，研究者们纷纷寻求新的检测方法。基于生物传 感技术的转基因食物检测方法逐渐崭露头角。该技术利用转基因成分与生物分子之间的特异性相互作用，通过检测生物传感器的信号变化来判断食物中是否存在转基因成分。尤其是利用纳米材料和生物分子的结合，如金纳米颗粒和抗体等，可以大大提高检测的灵敏度和准确性。 除了生物传感技术，基于光学的转基因食物检测方法也备受关注。例如，利用 表面等离子共振传感器（SPR）等技术，可以实时监测食物中转基因成分的存在。SPR技术通过检测光的全反射性质变化来分析食物样品，具有高灵敏度和实时性的特点。这种方法不仅适用于单一转基因成分的检测，还可以用于多个转基因成分的同时分析。 另外，质谱法作为一种新兴的食品检测技术，也能够应用于转基因食物的检测。质谱仪通过分析食物样品中物质的分子质量和相对丰度，可以判断其中是否含有转
转基因食品检测技术研究进展 摘要：随着人口的不断增长和资源的日益紧缺，转基因技术作为一种重要的 遗传改良手段逐渐得到了广泛的应用。然而，由于转基因食品可能带来的食品安 全问题，转基因食品的检测一直是食品安全领域的一个重要研究方向。本文综述 了转基因食品检测技术的研究进展，主要包括PCR法、电化学法、免疫学法、质 谱法等多种技术的原理、优缺点以及应用情况。同时，对未来的研究方向进行了 展望，认为将会出现更加灵敏、快速、准确的转基因食品检测技术。 关键词：转基因食品；检测技术；PCR；电化学法；免疫学法；质谱法 引言：转基因技术是指利用分子生物学和遗传工程技术对生物进行基因改良，以创造具有新的性状或改良已有性状的生物。转基因技术已被广泛应用于农业、 医药、工业等领域，并为人类社会发展带来了巨大的经济和社会效益。然而，由 于转基因食品可能带来的食品安全问题，转基因食品的检测一直是食品安全领域 的一个重要研究方向。转基因食品检测技术主要是通过检测转基因成分来确定食 品是否含有转基因成分。目前，常用的转基因食品检测技术包括PCR法、电化学法、免疫学法、质谱法等。本文将对这些技术的原理、优缺点以及应用情况进行 综述，并对未来的研究方向进行展望。 一、PCR法检测转基因食品 PCR法是一种基于核酸扩增的技术，它利用DNA聚合酶催化下的链式反应， 扩增出目标DNA片段，并通过凝胶电泳等方法对扩增产物进行检测。对于转基因 食品检测而言，PCR法的应用范围非常广泛。例如，基于PCR法的检测可以检测 到大豆、玉米、棉花、油菜籽等主要转基因作物。PCR法的实验过程可以分为样 品处理、DNA提取、PCR扩增、凝胶电泳等步骤。样品处理的目的是从食品中提 取目标基因组DNA，并去除携带着非目标DNA的成分。DNA提取的过程中，需要 使用化学或物理方法将DNA从细胞或组织中释放出来。PCR扩增的过程中，需要 设计合适的引物对目标基因组DNA进行扩增，并在PCR反应体系中加入反应物质。
食用油脂中转基因成分的分子检测技术研究进展 作者：曾慧君郦娟康翠欣卢跃鹏杨永武汉食品化妆品检验所 来源：《中国食品》 2018年第15期 摘要：日常生活中食用植物油脂不可或缺，而我国进口制油原料中相当数量为转基因原料。目前食用油脂主要的研究技术为理化及分子生物学技术。本文概述了食用油脂中转基因成分的 分子检测技术的进展情况。 自20世纪80年代世界第一例转基因作物诞生以来，转基因作物在提高产量、改良品质、 抗逆能力等方面越来越显示出巨大作用。在我国进口的制油原料中，有相当数量均为转基因产品。然而由于转基因作物可能存在的安全性问题，使得转基因产品的标签成为公众关注的热点。为了保证消费者的知情权和选择权，已有30 多个国家制定了相应的法律法规，对转基因作物 及其衍生产品的标签进行管理。我国新出台的《食品安全法》中亦明确规定：生产经营转基因 食品应当按照规定显著标示。因此，建立合适的检测手段以确定食品中是否含有转基因成分已 成为当务之急。 自DNA分子技术兴起后，国内外发展了多种转基因食品DNA检测方法。目前对于外源基因 的检测主要是通过对转入的外源基因进行PCR扩增，然后进行紫外或荧光检测。PCR技术全称DNA聚合酶链式反应技术，是一种在体外由引物介导的DNA聚合酶催化的聚合反应，能在短时 间内准确地把目的序列大量复制，在转基因食品检测方面，主要是用于从DNA即基因水平来鉴 定被测食品。但其在日常检测中仍存在以下问题：各种提取方法通用性不好，在物种和食品种 类中存在扩增成功率不同的问题；检验灵敏度和效率都不高。 从食用油脂中提取出可用于核酸检验的DNA是进行转基因成分检验的关键步骤。然而，由 于制取食用油的原料、原料处理、加工工艺和食用油储存条件以及储存时间地长短都会导致食 用油中DNA残留量不同。因此，有必要针对不同的食用油设计出最优DNA提取方案，以便进一 步摸索出外源基因的最佳PCR检测方法。 食用油脂中转基因成分检测的最大障碍是DNA的提取，因为经过一系列深加工，油脂中 DNA含量较低，且受破坏较严重，提取难度大。如Gryson研究组发现，大豆油经过前两道工序 离心除杂、脱胶后，几乎可以除去其中的DNA，PCR的扩增结果为阴性。为了攻克这一难题，国内外研究组对常用的DNA抽提技术进行改良，以期获得稳定可行的DNA提取技术，现阶段有些 研究组已取得一些成效。如白立群等建立的冷冻干燥法成功检测出大豆油中的内源基因和外源 基因；Costa等对样品进行冷冻离心预处理再结合CTAB的方法，也可提取获得大豆油中的DNA；Gryson等对样品量进行梯度研究，提示在增大样品量后，可以得到扩增所需的DNA模板。此外，商业化的食品DNA抽提试剂盒也引起了关注。通过对试剂盒提取食用油DNA的比较研究，得出 比较好的食用油DNA提取试剂盒有QIAamp DNA stool extractionkit (Qiagen)、The Nucleospin? food kit和WizardMagnetic DNA Purification System for Food。然而，由于 各研究组的局限性，很多DNA抽提方法只针对单一品种，没有同时对几种食用油进行针对性和 系统性的研究。（基金项目：湖北省食品药品监督管理局科研项目，食用油脂中转基因成分的 分子检测技术的研究（课题编号：201601014））
转基因植物分子检测技术转基因植物检测转基因植物分子检测专利技术 姜桐桐,2，黄凤兰1,2*，陈晓凤1,2，赵永1,2，李佳会1,2，周 婷婷1，常旭丰1，刘佳琪1 （1.内蒙古民族大学生物化学生命科学学院.内蒙古通辽 028000； 2.内蒙古自治区高校产业技术研究中心.内蒙古通辽 028000 3内蒙古自治区高校蓖麻育种重点重点麻省理工学院.内蒙古通辽028000） 摘要：和植物基因工程技术不断发展，转基因关键技术分子检测 技术也博得不断发展，本文转述了外源基因整合抗原的检测技术和外 源基因表达的检测技术，细致的描述了每种检测技术的原理和优缺点。 关键词：分子检测技术；转基因植物；原理 Transgenic plant molecular detection technology Tongtong jiang1.2 Fenglang Huang1.2 * xiaofeng chen1.2 Yong Zhao1.2 Jiahui Li1.2 Tingting Zhou1 Xufeng Chang1 Jiaqi Liu1 (1.College of Life Science, Inner Mongolia University for the Nationalities, Tongliao city，028000；2.Inner Mongolia RegionIndustrial Engineering Research Center of Universities for Castor, Tongliao city，028000；3 The Inner Mongolia auts region castor peeding, key laboratory of colleges and universities, Tongliao city，028000） Abstract:With the continuous development of molecular biology and plant gene engineering and transgenic molecular
转基因植物的筛选与鉴定 随着植物转基因技术的不断进步，它对于分子遗传学研究和植物改良都具有特别重要的意义。转基因植株的筛选在转基因技术中起着关键性的作用。将含有35S启动子的基因载体PMDC150经农杆菌介导，利用农杆菌侵染拟南芥花序的方法转入拟南芥后得到T1代种子。文章通过组织培养来筛选含有Kan抗性的转基因植株。 标签：拟南芥；转基因植物；筛选 1 文献综述 1.1 转基因植物的研究进展 植物的遗传转化是指利用重组DNA，细胞组织培养等方法，将外源基因导入到植物的组织或细胞中，获得转基因植物的技术[1]。从转基因植株成功之后，转基因技术飞速发展，如今，植物在抗病、抗虫和抗药等方面都有了转基因植株。这种技术对改进农作物品质、提高产量等方面都有非常大的帮助。 1.2 基因转化技术 随着人们对基因转化技术不断地深入研究和探索，现已发现多种基因转化的方法，例如农杆菌介导的基因转化、花粉管通道法等。相比较其他植物基因的转化方法，农杆菌介导法有着减少成本、容易操作等优点，但对宿主细胞有着严格的要求。每种方法都有其优缺点，所以根据植物的不同种类，我们要选择合理的转化方法，达到理想的转化效果。 1.3 本论文的目的和意义 植物的转基因技术日新月异迅速发展，已经成为许多国家重点发展的新目标新领域，它所产生的巨大的社会和经济效益促使各个国家对其进行更加深入的研究，由其产生的巨大的生产潜能一定会推动社会的进步，改善人类现有的生产、生活质量以及健康水平。 本文以拟南芥为主要研究对象，通过转化后的农杆菌侵染拟南芥花序的方法及组织培养的方法进行了轉基因植物的筛选。借由本次实验研究，可深入了解基因工程等相关领域的理论，可熟练掌握相关技术例如无菌操作技术、植物转基因技术、植物组织培养技术等等。 2 转基因植物的筛选与鉴定 2.1 实验材料
水稻转基因系的分子鉴定 1．目的 1．1从T2不同转基因株后代中鉴定得到分离出的纯转基因株、杂合转基因株和非转基因株，为根系和生理学实验提供材料； 1．2鉴定纯转基因株中插入T-DNA的拷贝数和插入方式； 1．3鉴定纯转基因株中插入T-DNA的插入位置。 2．材料 中华11 （CK） H05系列 石狩白毛（CK） E10系列 WD17系列 3．主要试剂和配方 3.1 DNA微量提取 微量提取液： 200mM Tris-HCl(pH7.5 250mM NaCl 25mM EDTA 0.5% SDS 酚/氯仿 氯仿 无水乙醇、70%乙醇 TE缓冲液（pH8.0） 10mg/ml RNase 3.2 Htp的PCR鉴定 Taq酶及Buffer 购自Takara公司 dNTPs购自华美公司 3.3 植物DNA大量提取 抽提液： 1.5%CTAB(十六烷基三甲基溴化铵) 75mmol/L Tris-HCl PH8.0 1M NaCl 15mmol/L EDTA 沉淀液： 1%CTAB 50mmol/L Tris-HCl PH8.0 10mmol/L EDTA 高盐TE: 1mol/L NaCl 10mmol/L Tris-HCl PH8.0 1mmol/L EDTA 3．4 Southern杂交
Southern杂交液（1×）:20×SSC 250 mL 5%SDS 5 mL 10%Sarkosyl 10 mL ddH2O 735 mL Blocking Reagent 5 g 洗脱液(1x)：20x SSC 10 mL 5%SDS 40 mL ddH2O 950 mL 3.5 RNA提取 Trizol: 购自Invitragen公司 10×MOPS: 80mmol/L NaAc 0.2mol/L MOPS 10mmol/L EDTA 加DEPC处理的水定容，调pH值至7.0 RNA上样混合物：0.25%溴酚兰 0.25%二甲苯菁 50％甘油 1 mmol/L EDT A 1.2%甲醛变性胶(100ml)：1.2g grose 73ml DEPC水 10×MOPBuffer 10 mL 2.2M甲醛 6 mL 3.6 RT-PCR 反转录酶SuperscriptIII试剂盒购自Invitragen公司 PCR所用试剂同前。 3.7 Northern分析 Northern杂交液（1×）：20×SSC 25 mL 10%SDS 5 mL 10%Sarkosyl 5 mL 1MTrisHcl(ph7.5) 5ml ddH2O 10 mL Blocking Reagent 1 g 甲酰胺 50mL
植物基因的克隆与转化3转基因植物中报告 基因的检测方法
科技知识讲座 植物基因的克隆与转化(3) 转基因植物中报告基因的检测方法 李成云(云南省农业科学院生物技术研究所,昆明650223) 检测转基因植物有许多方法。根据检测的基因功能来划分,可分为调控基因(包括启动子、终止子等)检测法、标记基因检测法及目的基因直接检测法。根据检测的不同阶段区分,有DNA检测法,RNA检测法及蛋白质检测法。DNA检测法只能检测到外源基因是否已经整合到植物基因组中,而后两种检测方法检测到的是外源基因是否能在受体植物中表达;根据RNA检测法得到的结果可判定外源基因是否转录,蛋白质检测法则可检测出外源基因是否翻译。还可根据检测所用的具体方法划分,有PCR检测法、化学组织检测法、酶联免疫吸附法、S onth2 ern杂交法、Nouthern杂交法、Western杂交法及生物测定检测法等。但这些划分也并非是绝对的,如用PCR既可检测调控基因,也可检测标记基因和目的基因。其中较为常见及简便的方法是报告基因检测法,这些基因一般编码一个特殊的酶,这些酶所催化的反应很容易用普通的生化反应检测出来。而在正常的非转基因植物中,这些酶及其所催化的反应几乎完全不存在。目前常用的报告基因主要有卡那霉素抗性基因(NPT-Ⅱ),β-葡萄苷酶基因(G us),荧光素酶基因,胭脂碱和章鱼碱合成酶基因,氯霉素乙酰转移酶基因(Cat基因),除草剂抗性基因(Pat),二氢叶酸还原酶基因(DHFR)等。这些基因由于其检测简单方便,在大多数植物中背景小而得到广泛应用。本文对这些报告基因的检测原理及方法作一简要介绍。 NPT-Ⅱ基因的检测:抗卡那霉素基因编码新霉素磷酸转移酶Ⅱ(NPT-Ⅱ),是一个小分子量的酶(分子量为25000),它由转座子Tn5编码,催化许多氨基酸糖苷类的磷酸化反应,诸如新霉素、卡那霉素、庆大霉素和G418等。这个反应将ATP的γ-磷酸基转到抗生素分子上,从而阻止了它们的靶位点———核糖体的相互作用,起到解毒作用。在转基因植物、动物和原核生物中, NPT-Ⅱ基因广泛地被作为选择标记,用来研究基因的表达及其调节。 在含蛋白酶抑制剂的缓冲液中研磨转化的植物材料,制取细胞的提取物。将提取物点在非变性的聚丙烯酰胺凝胶上以避免酶的不可逆变性。电泳后,将胶从胶槽
转基因植物的分子检测与鉴定方法及进展 随着分子生物学和植物基因工程的不断发展，越来越多的育种工作者开始利用转基因技术获得常规育种技术难以得到的新种质和新品种。植物转基因技术最大的好处在于可以打破自然界物种间原有的生殖隔离，促进基因在不同物种间的交流，极大地丰富变异类型，增大遗传多样性，为植物新品种的培育提供丰富的育种资源。通过对基因功能的研究，筛选m目的基因，还可实现植物性状的定向改良。因此该技术自1983年首次获得转基因植物以来，便深受育种工作者青睐，得到了蓬勃地发展。至今已有30多科约200多种植物转基因成功；国际上相继有30多个国家批准3 000多例转基因植物进入田间试验，并且在美国、加拿大、中国等20多个国家成功进行了商品化生产…。到2006年止，全球转基因作物的商业种植面积达1．02亿hm2，比2005年增长13％，是1996年的62倍。转基因作物品种在农业生产中日益显现出巨大潜力。 植物转基因操作中，除利用抗生素抗性和除草剂抗性等选择基因排除非转化细胞而留存转化细胞，以及利用Gus和CFP等报告基因显示转基因成功外，更重要的是从分子水平鉴别出阳性转化体，明确目的基因在转基因植株中的拷贝数和转录与表达情况。本文就常用的转基因植株检测与鉴定方法作一概述，并对近期发展起来的新方法做简要介绍。 1 外源基因整合与否及其整合拷贝数的鉴定 1．1 PCR(p01 ymera se chain reaction)检测 1．1．1 常规PCR PCR技术对目的片段的快速扩增实际上是一种在模板DNA、引物和4种脱氧核糖核苷酸存在的条件下利用DNA聚合酶的酶促反应，通过3个温度依赖性步骤(即变性、退火和延伸)完成的反复循环。经PCR扩增所得目的片段的特异性取决于引物与模板DNA间结合的特异性。根据外源基因序列设计出一对引物，通过PCR反应便可特异性地扩增出转化植株基因组内外源基因的片段，而非转化植株不被扩增，从而筛选出可能被转化的植株。 由于PCR检测所需的DNA用量少，纯度要求也不高，不需用同位素，实验安全，操作简单，检测灵敏，效率高，成本低，使之成为当今转基因检测不可或缺的方法，被广泛应用。然而，PCR检测易出现假性结果。引物设计不合理，靶序列或扩增产物的交叉污染，外源DNA 插入后的重排、变异等因素都会造成检测的误差。因此常规PCR的检测结果通常仅作为转基因植物初选的依据，有必要对PCR技术进行优化，并对PCR(real-time quantitative PCR)检测为阳性的植株做进一步验证。 1．1．2 优化的PCR PCR技术的优化目的在于提高扩增产物的特异性、推测目的基因的拷贝数及整合情况，从而提高检测的效率。常见的有多重PCR(Multiplex PCR， MPCR)、降落PCR(Touchdown PCR，TD-PCR)、 rpPCR、反向PCR(inverse PCR，IPCR)、实时定量 PCR等。 1．1．2．1 多重PCR