利用根癌农杆菌转化木本植物的研究进展
曹艳春;赵振利
【摘要】本文着重论述了近年来国内外利用根癌农杆菌介导法转化林木的研究进展.简述了获得转基因林木的应用现状,并将国内外林木转基因工作给以概括,提出了转化过程中存在的问题,并对这一转化方法的应用前景进行了展望.
【期刊名称】《河南林业科技》
【年(卷),期】2006(026)001
【总页数】3页(P16-18)
【关键词】根癌农杆菌;转化;林木
【作者】曹艳春;赵振利
【作者单位】河南农业大学,郑州,450002;河南农业大学,郑州,450002
【正文语种】中文
【中图分类】S722.3+9
19世纪末Smith发现根癌农杆菌[1]及1987年Fillatti利用根癌农杆菌Ti质粒为载体，将新霉素磷酸转移酶基因转入杨树杂种NC5339无性系内，并经Southern blotting杂交证明转基因杨树中有外源基因存在[2]，从此利用根癌农杆菌介导成为重要的林木转化方法。同其他林木遗传转化方法相比，根癌农杆菌介导法具有仪器设备简单、成本低、发生基因沉默率低、转化频率高、导入DNA片段大等优点[3]。
根癌农杆菌转化林木的受体系统和方法主要有以下几个方面：
该方法是Monsanto公司的Horsch等人于1985年建立的。最常用的植物外植
体有受伤叶片（叶盘法）、茎段和叶柄，已在欧洲黑杨、挪威云杉、毛白杨、杨树（Populus spp.）、苹果、桃等树种上获得成功。
一般采用种子实生苗、试管苗或继代苗作为外植体，人为地在整株植株上造成创伤，然后把根癌农杆菌接种在创伤面上，或用针头注射到植物体内进行侵染转化[4]。
这种方法是充分利用实生苗的生长潜力，同时针对针叶树树叶形细小、韧皮部厚等特点，在针叶树种上获得成功。如在挪威云杉、欧洲落叶松和杂种落叶松上得到稳定的再生转化植株。
是指将处于再生壁时期的原生质体与根癌农杆菌一起培养，离心洗涤除菌后，在含抗生素的选择培养基上培养，得到转化的细胞或植株。Gupta等将荧光素酶基因（Luciferase）导入火炬松（Pinus elliotii Engelm.）原生质体中，并在培养过程中存活的原生质体及再生细胞中测到了外源基因的表达。
李卫等利用沙田柚具有一年抽梢三四次、自然出芽容易等特点，采用农杆菌直接感染附体叶腋，并将转化腋芽离体扩繁鉴定，诱导生根形成完整植株[5]。这种附体
腋芽转化-离体扩繁鉴定的方法无需无菌操作，又免除了抑制农杆菌的繁琐过程，
再生时间短，效率高，且这种方法直接在树体上进行转化可大大缩短童期。
鉴定外源基因的方法包括：报告基因检测、DNA分子鉴定、RNA分子鉴定和蛋白质分子鉴定等。其中又分为直接鉴定法和间接鉴定法：直接鉴定法为采用外源基因做探针，与转化体的DNA进行分子杂交，以确定有无外源基因，这就是“Southern blotting”鉴定法[6]；间接鉴定法如对Ti质粒上胭脂碱合成酶基因
的产物进行检测，或使用报告基因如β-葡萄糖苷酸酶和荧光素酶基因等进行间接
鉴定。
3.1.1 苏云金杆菌毒蛋白基因苏云金杆菌（简称Bt）制剂，长期以来用于多种害
虫的生物防治。饶红宇等在2000年将Bt基因转入杨树NL-80106，获得了再生
植株[7]。郑钧宝等将CryAc基因与慈姑蛋白酶抑制剂基因构建的双抗虫基因转入白杨杂种741，检测证明已得到转基因植株[8]。
3.1.2 蛋白酶抑制剂基因蛋白酶抑制剂（PI）是自然界含量最为丰富的蛋白种类之一，存在于所有生命体中。它影响外来蛋白的正常消化，使昆虫产生厌食反应，最终造成昆虫的非正常发育或死亡[9]。2001年Rro采用根癌农杆菌介导共转化法
将Bt CryIA和CpT-Ⅰ基因导入黑杨无性系NL-80106种，结果表明转双价基因
的株系比转单价基因的株系抗虫效果好。
3.1.3 其它淀粉抑制剂、蝎神经毒素基因、外源凝集素、核糖体失活蛋白等基因
也是丰富的抗虫基因。2000年伍宁丰等将抗虫的蝎神经毒素基因导入黑杨无性系
N80106中获得转基因植株[10 ]。
林木病害是导致林业减产的主要原因之一。采用常规的喷施杀菌剂不仅容易诱导病原菌发生突变产生抗性而失效，更重要的是污染环境。基因工程给林木抗病育种开辟了新的途径。
3.2.1 抗病毒基因工程目前使用的抗林木病毒基因有杨树花叶病毒外壳蛋白基因、洋李痘病毒的外壳蛋白基因和黄瓜花叶病毒外壳蛋白基因等几种。1991年Scorza 等利用根癌农杆菌介导法，将改造的含新霉素磷酸转移酶（NPT-Ⅱ）、β-糖苷酸
酶基因（GUS）与番木瓜环斑病毒（PRV-CP）构建的抗病毒基因表达载体导入欧洲李（Prunus domestica L.）中获得转基因植株。
3.2.2 抗真菌、细菌病害基因工程几丁质酶基因和角质酶基因是目前克隆的抗树
木真菌病的两种主要基因。此外，我国已从兔子中成功的克隆了防御素基因，构建了植物表达载体。1999年赵世民等将兔防御素导入毛白杨[11]。2001年汤浩茹
等成功将哈兹木霉几丁质酶基因导入核桃[12]。
林木的抗除草剂基因工程中，目前导入的外源基因主要有：来自沙门氏菌的aroA 基因、来自吸水链霉菌的抗膦丝菌素的抗性基因（bar基因）和抗草甘膦基因等。
1987年Fillatti等将突变的EPSP合成酶基因aroA，转入银白杨×大齿杨中，获
得了转基因植株。
植物体内的小分子化合物如脯氨酸、甜菜碱等对于植物忍受环境胁迫的能力具有十分重要的作用。国内外专家在这方面作了很多研究，主要有以下几个方面。
3.4.1 抗盐碱基因研究应用的耐盐碱基因主要有：甜菜脱氢酶基因、磷酸山梨脱
氢酶基因、脯氨酸合成酶A基因、胆碱脱氢酶基因等。2001年杨传平等将外源基因BetA导入小黑杨，并获得转基因植株[13]。
3.4.2 抗旱基因研究目前研究较多的干旱应答基因有两类，一类与植株细胞内特
定渗透调节物质合成有关；另一类为编码与自由基清除有关的酶。1997年，温尚昆等通过根癌农杆菌介导把与抗旱有关的激素合成基因导入毛白杨，获得再生植株[14]。
3.4.3 抗寒冻基因研究目前用于林木抗寒冻性遗传转化的基因主要有三类：鱼类
抗冻蛋白基因、编码超氧化物歧化酶和脂肪酸去饱和代谢关键酶基因[15]。1998
年Arisi等将拟南芥的Fe-SOD基因导入杨树，增加了杨树抗氧化能力和耐冻性。1999年Dolgov等用根癌农杆菌介导法将抗冻蛋白（AFP antifreeze）导入酸樱
桃（P. cerasus）中，获得转基因植株。
目前用于林木生殖发育调控的基因主要有芽孢杆菌RNA酶基因、DN-A基因以及影响林木花期的LEAFY基因[16]。已从辐射松、黑云杉、挪威云杉、苹果和杨树
中分离和鉴定出定向进化同源开花基因[17]。
提高林木的生长速度，改良林木的木材性状是林木育种的重要目标。木质素在林木中具有重要的生物学作用，但在造纸中需花费大量费用取出木质素，且会造成严重的环境污染。目前通过反义或正义同源DNA改良木质素基因工取得了一定的效果。所用的基因主要是一些编码调控木质素生物合成的关键性酶，如肉硅醇脱氢酶、L-苯丙氨酸裂解酶和香豆醇辅酶等[18]。
利用根癌农杆菌介导法获得了一些转基因植株，但根癌农杆菌的转化体系还不完善。此外，我国林木遗传转化工作中还存在科研经费不足、技术储备不足和创新性不够以及参加单位多、经费分散等问题。因此，在今后的林木遗传改良研究中不仅应加强科研单位之间的合作，而且应该将常规育种技术和现代生物技术有机的结合起来，充分重视拥有自主知识产权的林木基因和基因工程育种，加快转基因林木成果的产业化，提高转基因林木的经济价值。
总之，根癌农杆菌介导法为我们提供了一种快速、便捷的林木遗传转化的方法，大大提高了林木育种的目的性和可操作性。应加大研究投入、改进转化技术、寻找稳定高效的转化体系，从而培育出具有更高价值的林木新品种。
【相关文献】
[1] 陈章良. 植物基因工程研究与进展[J].生物学通报，1990，9（9）：4～7.
[2] Fillatti J J. Development of glyphosate tolerant populus plants through expression of a mutant agrogene from Salmonella typhimurium[J]. Genetic Manipulation of Woody Plants，Edited by James，W. Hanover ct al，1988：243～249.
[3] Binns A N. Agrobacterium-mediated gene delivery and the biology of host range limition[J]. Physiol Plant，1990，79：135～139.
[4] 许智宏，卫志明. 植物原生质体培养和遗传操作[M]. 上海：上海科学技术出版社，1997.
[5] 李卫，陈亮，蔡得田，等. 柑桔基因转化新方法的研究[J]. 植物学报，1997，39（8）：782～784.
[6] Huang Y. Agrobacterium rhizgenes mediated genetic transformation and in Votro regeneration of a conifer Larix deciduas[J].In Vitro Plant，1991，27（4）：201～207.
[7] 饶红宇，陈英，黄敏仁，等.杨树NL-80106转Bt基因植株的获得及抗虫性[J]. 植物资源与环
境学报，2000，9（2）：1～5.
[8] 郑均宝，梁海永，高宝嘉，等. 转双抗虫基因741毛白杨的选择及抗虫性[J]. 林业科学，2000，36（2）：13～ 19.
[9] 王深柱，钦俊德. 植物蛋白酶抑制素抗虫作用的研究进展[J]. 昆虫学报，1997，40（2）：212～218.
[10] 伍宁丰，孙芹，姚斌，等. 抗虫的AalT基因杨树的获得[J]. 生物工程学报，2000，16（2）：129～133
[11] 赵世民，祖国诚，刘根齐，等. 通过农杆菌介导法将兔防御素NP-1基因导入毛白杨（P. tomentosa）[J]. 遗传学报，1999，26（6）：711～714.
[12] 汤浩茹，Wallbraun L，任正隆等. 通过农杆菌介导将哈慈木霉几丁质酶ThEn-42基因导入核桃[J]. 园艺学报，2001，28（1）：12～18.
[13] 杨传平，刘桂丰，梁宏伟，等. 耐盐基因Bet-A转化小黑杨的研究[J]. 林业科学，2001，37（6）：11～15.
[14] 温尚昆，董春海，尹承. 由根癌农杆菌介导向毛白杨导入激素合成基因建立遗传转化系统[J].
生物技术，1997，7（2）：11～14.
[15] Gallardo F. Expression of a conifer glutamine synthetase gene in transgenic popular[J]. Planta，1999，210（1）：19～26.
[16] Yeh Y，Feeney R. Antifreeze proteins: Strutureand mechanisms of function[J]. Chem Rev，1996，96：601 ～617.
[17] Mckeen C D，Reilly U，Pusey P L. Production and partial characterization of antifungal substances antagonistie to Monilinia fructicola from Bacillus subtilis[J]. Phytopathology，1986，26：136～139.
[18] Southerton S G，Marshall H，Mouradov A，et al. Eucalyptus MADS-box genes expressed in developing flowers[J]. Plant physiology，1998，118（2）：365～372.
二、农杆菌介导植物转化的机制及影响转化效率的因素 转化机制： 与植物基因转化有关的农杆菌有两种类型：根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）和发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）。根癌农杆菌含有Ti 质粒。发根农杆菌含有Ri 质粒。根癌农杆菌的Ti 质粒和发根农杆菌Ri 质粒都具有一段转移DNA (transfer DNA，又称T-DNA)，在农杆菌侵染植物时，T-DNA 可以插入到植物基因组中，使其携带的基因在植物中得以表达。由于T-DNA 能够进行高频率的转移，而且Ti 质粒和Ri 质粒上可插入大到甚至150kb 的外源基因，因此，Ti 质粒和Ri 质粒成为植物基因转化中的理想载体系统。 1 与农杆菌转化相关的基因 与转化相关的基因主要包括农杆菌染色体上的基因和Ti 质粒上T-DNA 以外Vir 区的基因。染色体基因包括chvA、chvB、att、pscA、chvD 以及chvB。它们大多编码一些膜相关蛋白，负责细菌向植物受伤细胞趋化移动和帮助细菌附着于植物受伤细胞上。ChvD 蛋白可能在低pH 和磷酸饥饿情况下提高VirG 蛋白的合成水平。ChvE 与VirA 蛋白共同对virG 起激活作用。 原始的Ti质粒根据其功能的不同，可分为4个区： （1）T-DNA区：是在农杆菌侵染细胞时，从Ti质粒上切割下来转移到植物基因组中的一段DNA，其携带的基因与肿瘤的形成有关，但与T-DNA本身的转移与整合无关。T-DNA 上最重要的是两端的2个边界(LB和RB)，它们是T-DNA转移所必需的。只要其存在，T-DNA可以将携带的任何基因转移并整合到植物基因组中， T-DNA的右边界在T-DNA的整合中对于靶DNA位点的识别具有重要作用，因此，尤以右边界更为重要． （2）毒性区：位于T-DNA以外的1个30~40 kb的区域内，该区段编码的基因但对T-DNA 的转移和整合非常重要．这些基因也称为Ti质粒编码毒性基因(vir)。 （3）接合转移区：该区段存在有与细菌间接合转移有关的基因(tra)，调控Ti质粒在农杆菌间转移。 （4）复制起始区：该区段调控Ti质粒的自我复制。在遗传转化过程中除了Ti质粒上的基因参与外，还有农杆菌染色体基因。染色体基因包chvA、chvB、att、pscA、chvD 以及chvB。它们大多编码一些膜相关蛋白，负责细菌向植物受伤细胞趋化移动和帮助细菌附着于植物受伤细胞上。延伸因子P对于农杆菌的生长非常重要，但非必需．高水平的糖结合蛋白一ChvE可以扩大VirA蛋白对酚类物质的识别范围。结合ATP盒式转运体类似物蛋白ChvD，参与Vir区基因的表达调控，chvD基因座中插入无启动子的lacZ，农杆菌侵染力以及Vir区基因表达量大大下降，ChvD突变体中virG组成型表达侵染力则得以恢复，这一现象说明ChvD通过影响virG表达控制毒性。 2 Vir 基因的诱导表达机制 在植物受到创伤后，创伤组织的细胞释放出创伤信号——酚类化合物，如乙酰丁香酮。
木本植物转基因研究进展 摘要：从木本植物的概况及其转基因的现状、发展历程、研究现状、转化的目的基因、方法、受体系统、选择标记等方面入手，阐述了木本植物转基因研究的相关进展，并对各个环节的最新研究和存在的问题进行了简要的说明，探讨了可能的解决和替代方案，对于木本植物转基因未来的发展趋势进行了展望。 关键词：木本植物；转基因；研究进展 1.前言 木本植物指茎的木质化程度高、木质化细胞多、茎常较坚硬且直立的多年生植物，依形态不同，分乔木、灌木和半灌木三类。自古以来，木本植物在人类社会的各个层面都扮演着极为重要的角色，如建筑、工业、园林、食品等，已经成为人类必不可少的资源之一。此外，木本植物对于生物多样性、地表形态建成、全球气候等也有着决定性作用。 1974年，科恩（Cohen）将金黄色葡萄球菌质粒上的抗青霉素基因转到大肠杆菌体内，揭开了转基因技术应用的序幕[1]。将人工分离和修饰过的基因导入到生物体基因组中，由于导入基因的表达，引起生物体的性状的可遗传的修饰，这一技术称之为转基因技术。自诞生以来，转基因技术一直
毁誉参半，一方面，转基因技术对于植物性状改良、新品种的研发及生物技术的进步有着莫大的贡献；另一方面，由于转基因技术的不成熟和应用领域的关系，产生了一些负面影响，如遗传漂变、性状退化、致病性等，导致人们对转基因技术产生误解。即便如此，转基因技术的发展还是势不可挡，随着科学技术的不断进步和完善，转基因将有更多的用武之地。 长期以来，木本植物的改良主要是通过杂交育种的方式进行，但木本植物所特有的许多生物学特性，如较长的生长周期和童期、复杂的生殖方式、高度杂合性等，使得应用常规育种方法受到了极大的限制[2]，这就需求一种快速有效的方法来缩短木本植物的研究周期，从而更好地为人类的生产、生活提供帮助。转基因技术的兴起，为木本植物各方面的研究提供了契机，也为经济发展、人们生活水平的提高提供了机遇，现已逐渐成为研究的热点。 木本植物中，又以木本果树的研究较为热门和深入，转基因研究现已经在柠檬（Citrus limon）[3]、苹果（Malus pumila）[4]、柑橘（Citrus reticulata）[5]、葡萄（Vitis vinifera）[6]等植物上成功开展，为品种改良、抗病性、抗逆性方面的研究提供了参考。出于人们对转基因食品安全性的隐忧以及国家和政府对于转基因植物推广的慎重考虑，国内外转基因木本果树进行推广种植的很少，多数为学术研究，其他木本植物进
植物遗传转化研究进展 重庆师范大学生命科学学院生物科学（师范）专业2009级 指导教师 摘要：植物遗传转化是一项农业生物技术，它通过某种途径或技术将外源基因导入受体细胞的全基因组中，并使之在受体细胞中得以充分表达。目前一些重要农作物转基因品种已经或即将投入到实际应用，随着研究的不断深入,本文对植物遗传转化的技术作出了新的展望。 关键词：植物遗传转化；植物遗传转化方法；应用；进展 Abstract：Plant genetic transformation is a kind of agricultural biotechnology.It delivers to the whole-genome of receptor cells through a certain approach or technique to make the exogenous genes fully expressed in receptor cells. At present, genetically modified varieties of some important crops have been or are about to put into the practical use. with the deepening of the research,this paper makes a new outlook of the plant genetic transformation technology. Key words: Plant genetic transformation; the approaches of plant genetic transformation; application; progress 植物遗传转化是指以植物的器官、组织、细胞或原生质体作为受体，通过某种技术或途径转入外源基因，获得使外源基因稳定表达的可育植株。遗传转化也称为转基因技术。转基因植物的研究始于20世纪70年代。到了20世纪80年代，由于基因操作技术的提高和目的基因构建模式等内容的基本完成，植物转基因技术便应运而生。1983年获得了第一例转基因烟草，使植物基因工程发生了质的飞跃，植物转基因技术也已经得到了广泛的应用和发展，人们开始对外源基因导入植物细胞的方法进行大量的探索，建立了多种方法用于植物的基因转化。目前应用最普遍的植物基因的遗传转化方法主要有农杆菌介导法和DNA直接转入法[1,2]。
农杆菌转化法及转基因植物检测方法 摘要：近年来，植物基因工程技术飞速发展，转基因植物在很多领域的研究推广取得了令人瞩目的成绩。植物基因工程中常用的转化方法一般是通过土壤农杆菌系统、植物病毒系统和DNA直接导入法这三种方法进行。另外，转基因技术快速发展的同时转基因植物检测技术也在不断地进歩和完善，目前被广泛应用的转基因植物检测方法有三类：整合水平上的检测、转录水平上的检测和表达水平上的检测。本文着重对农杆菌介导的植物转化方法和转基因植物的检测两方面进行综述。 关键词：农杆菌，转化，转基因植物，检测方法 伴随着生命科学的飞速发展，植物组织培养技术以及植物组织分化、植物基因重组等技术发展迅速并得到广泛应用。1984年转基因烟草的诞生[1]，使外源基因导入植物细胞从而获得转基因新品种的设想成为现实。随后，转基因技术被广泛应用于各个方面如：植物新品种的改良、植物性状改良、植物抗性的提高以及植物基因功能的研究等[2-4]。新型转基因大豆、转基因番茄及转基因玉米等转基因新品种陆续面世[5]。植物转基因技术不但能够打破植物的物种界限，还能够使物种基因彼此进行交流。使植物育种年限缩短，植物育种进程加快，植物抗性也在一定程度上得到很大提高，使来自于不同生物种类的优良目的基因导入植物并得到优良植物新品种。同时，运用转基因技术研究植物自身基因结构组成及其基因功能调控等方面也取得了一定成果；运用转基因技术还研制出生物反应器和雄性不育系[6]。 目前，利用转基因技术将目的基因导入植物基因组中的常用方法主要有：土壤农杆菌介导的基因转化、DNA直接导入和植物病毒系统介导法。本文着重介绍土壤农杆菌介导的目的基因转化法，同时也对目前转基因植物的检测进行适当总结。 1 土壤农杆菌介导系统的种类 土壤农杆菌中的发根农杆菌和根癌农杆菌能够侵染植物伤口并形成与土壤农杆菌中大质粒有关的植物肿瘤和冠瘿。能够诱发此类肿瘤的根瘤农杆菌中常常
实验三根癌农杆菌介导的植物遗传转化 一实验目的 了解植物遗传转化的方法和理论 掌握根癌农杆菌介导的遗传转化技术 二原理 植物遗传转化技术是指通过物理的，化学的或生物学的方法，将外源的基因导入受体植物细胞中获得再生植株的转基因技术。自1983转基因植物问世以来，至今不到20年时间里，植物转基因技术发展迅速，除了占指导地位，运用最为广泛的农杆菌介导法，还发展了10多种转基因方法，如物理方面的基因枪法，电激法，显微注射法，超声波法，激光微束法，炭化硅纤维介导法，电泳法等；化学方面PEG介导转化，脂质体介导转化；生物学方面的种质系统法如花粉介导法，花粉管通道法等。 农杆菌介导法 土壤农杆菌（Agrobacterium）是一种革兰氏阳性菌，有两个种与植物转基因有关，即根癌农杆菌（Agrobacterium Tumefaciens）和发根农杆菌（Agrobacterium Rhizogenes）.它们在自然状态下具有趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤部位，并诱导产生冠缨瘤或发状根，在离体条件下，可以在不加任何生长素的培养基中持续生长，研究表明根癌农杆菌和发根农杆菌细胞中分别含有Ti 和Ri质粒,上面有一段T-DNA区，可以通过一系列过程进入植物细胞并将这一段T-DN插入到植物基因组中，这是农杆菌侵染植物后产生冠缨瘤或发状根的根本原因，因此农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系，人们可将所构建的目的基因插入到去除了致瘤基因的Ti(Ri)质粒的T-DNA区，借助农杆菌侵染受体植物细胞后T-DNA向植物基因组的高频转移和整合特性，实现目的基因对受体植物细胞的转化，然后通过植物细胞合和组织培养技术，利用植物细胞的全能性获得转基因再生植株。农杆菌介导法转基因技术的关键是T-DNA整合受体植物基因组的过程，这一过程依赖与Ti质粒上的T-DNA区，和Vir区各种基因的表达以及一系列蛋白质和核酸的相互作用。简略地说。其过程是：植物细胞在受伤后细胞壁破裂，分泌高浓度的创伤诱导分子，它们是一些酚类化合物，如乙酰丁香酮（acetosyringone,AS）和羟基乙酰丁香酮（hydroxy- acetosyringone,OH-As）农杆菌对这类物质具有趋化性，首先在植物细胞表面发生贴壁，继而植物创伤分子诱导农杆菌Vir区各种基因的激活和表达。首先是VirA和virG基因的活化，磷酸化的virG蛋白激活一系列vir基因的表达，导致T-DNA被剪切，加工，形成T-链蛋白复合体（T-复合体），通过农杆菌和植物细胞的细胞膜，细胞壁进入植胞内，T-复合体上的核靶向序列可引导T-DNA整合到植物基因组。 三实验材料 烟草KRK26叶片，农杆菌菌株EHA105，质粒的T-DNA含目的基因GFP，卡那霉素抗性基因为选择标记基因，结构如下图所示: LB Bt nos3 MCS nos3 nptII nos5 RB
植物抗病基因工程研究进展 摘要随着植物抗病基因的分离，植物抗病机制的分子生物学和植物抗病基因工程取得了重大研究进展。该文就植物抗病基因工程的原理、目的基因、转化方法等进行综述，并对植物抗病基因工程的应用前景做了展望。 关键词植物；抗病基因；基因工程；原理；目的基因；转化方法；前景 随着世界人口的迅速增长，粮食问题已成为人类生存的关键问题。有专家预测，到2050 年，全球人口总数将膨胀至90 亿。剧增的人口将给为人类提供粮食的农业生产带来严峻的挑战。众多学者为提高作物产量作了许多努力，也取得了很大成果。但是，长期以来，因病菌侵染而造成的作物产量损失也是巨大的。当前，防治病害的主要策略是改进栽培措施和施用化学杀菌剂。但这只能从一定程度上控制病害的流行而不能从根本上解决问题，而且化学药剂所带来的环境污染和病原抗药性生理小种的形成等问题也给病害防治造成了更大的障碍。 自上世纪90 年代以来，分子生物学理论和技术的不断发展完善，使人们能够从分子水平上研究植物与病原菌的相互作用机制，植物基因工程的兴起更是为病害的控制提供了更广泛的选择余地。基因工程被认为是一项能为人类提供以食用动物为基础的健康和充足粮食途径的关键技术，在应用中扮演着重要角色。在植物抗病基因工程的研究历程中，以植物抗病毒基因工程开展最早，发展也最为迅速，部分转基因植株已开始用于生产。随着植物抗病反应机制和病原菌致病机理研究的深入，近年来植物抗病基因工程的研究取得了很大的进展。 1 植物抗病基因工程的原理 人们对植病互作机制的认识，主要来源于对模式植物拟南芥的研究。并且已经从拟南芥中鉴定和克隆了许多抗病基因，给其他作物的抗病性遗传分析提供了理论基础。 病原菌对宿主植物成功的感染，包括接触识别、崩解植物理化防御系统、产生毒素、灭活整个植株或部分组织的代谢生理活性。病原菌往往含有致病基因和毒性基因，其表达 调控包含有复杂的信号传导。 在经典遗传学中，植物与病原物的互作被看作是由基因型控制的，植物抗病性常常是由来源于植物的抗病基因R 与相应的来源于病原物的无毒基因avr 互相作用所决定的，即“基因对基因”学说。Flor通过亚麻与亚麻锈病菌之间的相互关系的研究，发现真菌的显性avr 基因的产物（后来被描述成小种专化性诱导因子）能被R 基因的产物识别，从而激发植物抗性。 植物抗病基因工程指的是用基因工程（遗传转化）的手段提高植物的抗病能力，以此获得转基因植物的方法。植物抗病基因工程主要包括：抗病及其他相关基因的分离和克隆；与合适的载体及标记基因构成适于转化的重组质粒；用不同的转化方法向受体植物导入重组质粒；筛选转化因子并鉴定转基因植株。此外，还有一种可以获得抗病转基因植物的方法即把具有抗病能力的植物或微生物的DNA 直接导入受体植物，从后代中筛选具有抗病能力的个体，经过稳定转化得到转基因抗病植株。 2 用于植物抗病基因工程的目的基因 2.1 植物抗病基因 植物抗病基因工程选用的最佳目的基因来自植物自身的抗病基因，即上述的R 基因近20 年来，世界上许多重要实验室一直致力于植物R 基因的克隆，直到1992 年才取得突破，成功地克隆出第1 个玉米抗圆斑病基因Hm1。迄今人们已经从十余种不同植物中成功地克隆出了20 多种R 基因，如番茄抗叶霉病基因Cf2-9、Cf-2、Cf-4，水稻抗白叶枯病基因Xa21，拟南芥的抗丁香假单胞杆菌基因RPS2、RPM1、抗霜霉病基RPP5，亚麻抗锈病基因L6，大麦抗白粉病基因Mol等。这些抗病基因多数已转化到相应的感病植株中，并均使转基因植
农杆菌转化法 又名农杆菌Boletus介导转化法。农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，它能在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物和裸子植物的受伤部位(受伤处的细胞会分泌大量酚类化合物,从而使农杆菌移向这些细胞)，并诱导产生冠瘿瘤或发状根农杆菌转化法。根癌农杆菌和发根农杆菌中细胞中分别含有Ti(Tumour including)质粒和Ri质粒，其上有一段T-DNA(Transferring DNA)，农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将T-DNA插入到植物基因组中,并且可以通过减数分裂稳定的遗传给后代，这一特性成为农杆菌介导法植物转基因的理论基础。我们将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然后通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。农杆菌介导法起初只被用于双子叶植物中，近年来，农杆菌介导转化在一些单子叶植物(尤其是水稻)中也得到了广泛应用。 本段步骤 1、获取目的基因。用限制酶切割下目的基因。 2、基因表达载体的构建。将目的基因与载体(大多数选用质粒)用DNA连接酶连接起来。 3、将目的基因导入受体细胞。将含目的基因的重组质粒导入农杆菌(农杆菌为受体细 胞)。 4、目的基因的检测与鉴定。用DNA分子杂交技术/分子杂交技术/抗原-抗体杂交/个体生物学水平鉴定(这个方法需要导入重组后的细胞的植物体，详见第五步) 几种方法进行检验(根据要求选取不同方法)。 5、最后将成功表达的细胞导入植物体内，对植物体进行个体生物学水平鉴定。整个转基因体系的建立步骤大致可以归纳为:目的载体的构建---载体的农杆菌转化---农杆菌与植株共培养---转化植株的筛选---转化植株的鉴定。在每一步中都涉及到很多的方法与技术。目的载体的构建，包括目的基因的克隆，载体的酶切，连接，以及测序分析。载体的农
根癌农杆菌介导法原理 引言 根癌农杆菌介导法是一种常用的基因转化技术，广泛应用于植物遗传工程领域。它利用植物根癌农杆菌接触感染时产生的植物激素和DNA导入技术，将外源基因导入植物细胞，实现对植物基因组的改造。本文将全面、详细、完整地探讨根癌农杆菌介导法的原理、应用以及优缺点。 根癌农杆菌的特点 1. 根癌农杆菌简介 根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens) 是一种通过植物接触感染的土壤细菌，在植物遗传工程研究中具有重要的应用价值。它能够将其自身的T-DNA（转座子DNA）片段导入植物细胞，并在植物细胞中稳定表达。 2. 根癌农杆菌的感染机制 根癌农杆菌感染植物的过程包括以下几个步骤： 1.识别和结合：根癌农杆菌通过识别植物伤口释放的酚类化合物，结合到植物 细胞表面。 2.感染透入：根癌农杆菌产生的信号分子诱导植物细胞产生细胞壁降解酶，使 其自身进入植物细胞。 3.T-DNA转移：根癌农杆菌通过特殊的转移螺旋（vir蛋白）将T-DNA从细菌 自身转移到植物细胞中。 4.T-DNA整合：转移的T-DNA片段在植物细胞染色体上整合，并导致植物细胞 的遗传改变。 根癌农杆菌介导法原理 根癌农杆菌介导法利用根癌农杆菌的感染机制，将外源基因导入植物细胞，从而实现对植物基因组的改造。
1. 构建适合的转化载体 在根癌农杆菌介导法中，首先需要构建适合的转化载体。转化载体通常包括以下几个重要组成部分： •T-DNA：携带待转化的外源基因片段。 •选择标记基因：用于筛选转化成功的植物细胞。 •根癌农杆菌起始核酸序列（ori）：用于在根癌农杆菌中复制转化载体。 2. 根癌农杆菌感染植物 将构建好的转化载体导入根癌农杆菌中，然后让根癌农杆菌感染植物组织。通常可以通过以下步骤实现： •制备根癌农杆菌感染液：将构建好的转化载体导入根癌农杆菌中，培养至菌体达到一定浓度。 •植物组织处理：将待转化的植物组织浸泡在根癌农杆菌感染液中，利用真空处理或共振法促使菌体进入植物细胞。 •Co-cultivation：将处理后的植物组织与根癌农杆菌一起培养，使其进行共生培养。 3. 选择标记基因筛选转化植株 在根癌农杆菌介导法中，常常需要引入选择标记基因进行筛选，以确定是否成功实现了基因的转化。常见的选择标记基因包括抗生素抗性基因或荧光报告基因等。 通过制备含有选择标记基因相关抗性的培养基进行选择培养，能够筛选出转化成功的植株。 根癌农杆菌介导法的应用 根癌农杆菌介导法在植物遗传工程中具有广泛的应用，主要包括以下几个方面。 1. 基因功能研究 根癌农杆菌介导法可以将外源基因导入植物细胞中，使得研究人员能够通过研究转化植株的表型改变，研究目标基因在植物发育和代谢等方面的功能。
根癌农杆菌介导的真菌遗传转化研究进展 根癌农杆菌介导的真菌遗传转化是一种常用的真菌遗传改造方法，具有操作简便、高 效率、单拷贝整合等优点，可用于真菌基因敲除、基因敲入、表达融合蛋白等多个方面的 研究，已成为真菌遗传改造领域中不可或缺的技术手段之一。本文将对根癌农杆菌介导的 真菌遗传转化技术进行综述和展望。 根癌农杆菌介导的真菌遗传转化方法（Agrobacterium-mediated transformation, AMT）是利用土壤细菌根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）的T-DNA转移系统将外源DNA 导入到真菌基因组内的一种遗传转化方法。通常，AMT方法分为三个步骤：（1）将目标真菌菌株的孢子或体细胞暴露于含有外源DNA、根癌农杆菌以及诱导剂（如乙酰丙酮）的悬浮液中，使其吸附根癌农杆菌，并通过植物激素的作用促进真菌细胞分裂和分化；（2）将真菌悬浮液分别在培养液和选择性培养基上培养，去除未受到转化的真菌样本，并选育出转 化的真菌菌株；（3）通过PCR、Southern blotting等方法检测和鉴定转化真菌的基因型。 目前，AMT方法已被广泛应用于多种真菌，如神经鞘菌属、烟霉属、木霉属、豆角霉 属等，为研究真菌生物学和遗传学提供了有力支持。 根癌农杆菌转移DNA的机理主要分为两步：（1）形成T-DNA；（2）将T-DNA导入到植物细胞中。形成T-DNA的过程包括：第一步，根癌农杆菌感知到植物的存在，释放细菌素 以感染植物表面细胞，侵入植物细胞后会释放琥珀酸，琥珀酸激活VirA蛋白，VirA磷酸 化VirG蛋白；第二步，磷酸化的VirG与ChvE结合，T-DNA负链转录起始因子（nptⅡ）在VirE2的协助下被VirD2切割，一段所需基因和启动子序列就会包括在质粒上；第三步，VirE2将T-DNA协同转移入目标细胞，并与VirD2一起构成一种被称为转移复合体的结构。 在AMT方法中，真菌细胞表面的亲和配体可以结合到根癌农杆菌的T-DNA转移复合体，从而将外源DNA导入到真菌细胞中。由于真菌生长环境和植物大不相同，根癌农杆菌介导 的真菌遗传转化机理目前还不十分清晰，需要从更深层次理解其机理并加以优化。 AMT方法具有以下优点： （1）操作简便：AMT方法可以在普通细菌实验室条件下进行，无需特殊设备，而且真菌遗传改造的操作简单，适用于中小型实验室。 （2）高效率：AMT方法转化率高，多数真菌的转化率较高。 （3）单拷贝整合：AMT方法可使外源DNA以单拷贝整合到目标真菌的基因组中，降低了插入突变的风险，保证了遗传转化的稳定性。 （1）依赖于真菌种类：AMT方法对于不同的真菌种类的适应性不同，需借助特定的转化体系对转化效率进行优化。
根癌农杆菌侵染植物细胞的原理(一) 根癌农杆菌侵染植物细胞 引言 •介绍根癌农杆菌的重要性和相关研究价值 根癌农杆菌的特征 •描述根癌农杆菌的形态和生物学特性 •分析其与植物细胞的相互作用 根癌农杆菌的致病机制 •解释根癌农杆菌引发植物细胞根癌的基本原理 •探讨与植物细胞的信号传递路径有关的分子机制 根癌农杆菌的入侵方式 •阐述根癌农杆菌侵染植物细胞的入侵途径 •讨论其进一步感染植物组织的策略 根癌农杆菌与植物细胞相互作用的分子机制 •探究根癌农杆菌与植物细胞相互作用的分子信号传递路径•详细解析与根癌农杆菌侵染相关的植物抗病机制
目前的研究进展和应用前景 •总结根癌农杆菌领域的研究进展和重要发现 •展望根癌农杆菌在植物保护和基因工程领域的应用前景 结论 •总结根癌农杆菌的重要性和研究进展 •强调进一步深入研究的必要性 注意：以上仅为文章的结构框架，实际写作中需要根据相关知识 进行进一步展开和论证。 根癌农杆菌侵染植物细胞 引言 根癌农杆菌是一种植物病原菌，能引发植物细胞发生根癌，给农 作物产量和质量带来严重威胁。研究根癌农杆菌的侵染机制，有助于 深入了解植物-病原菌相互作用的基本规律，并为开发绿色农药和改良 农作物品种提供理论依据。本文将从浅入深，分解解释根癌农杆菌侵 染植物细胞的相关原理。 根癌农杆菌的特征 根癌农杆菌属于革兰氏阴性杆菌，具有细菌的典型形态特征：长 条形，带有尖头。此外，根癌农杆菌还具有荧光特性，可在适当条件 下发出荧光。根癌农杆菌能产生多种酶，如微量酶、蛋白酶和淀粉酶，进一步促进其侵染植物细胞的能力。
根癌农杆菌的致病机制 根癌农杆菌引发植物细胞根癌的主要原理是通过分泌信号分子和 效应蛋白来干扰植物细胞的正常生长和发育。根癌农杆菌分泌的信号 分子可促使植物细胞形成肿瘤组织，为其提供营养并进一步使其侵入 植物组织。此外，根癌农杆菌还通过效应蛋白介导的信号传递机制， 改变植物细胞的代谢和生物化学过程，从而为其提供繁殖环境。 根癌农杆菌的入侵方式 根癌农杆菌入侵植物细胞的主要途径是通过植物根部。根癌农杆 菌利用其头部的吸附器，附着在植物根部并释放粘附因子，使其更牢 固地粘附在植物细胞表面。随后，根癌农杆菌采用迁移因子的帮助， 侵入植物细胞的内部，并通过分泌毒素和其他侵染相关蛋白，破坏植 物细胞的防御系统，从而引发细胞根癌。 根癌农杆菌与植物细胞相互作用的分子机制 根癌农杆菌与植物细胞相互作用的分子机制十分复杂。研究发现，根癌农杆菌通过特定的外膜蛋白与植物细胞的受体相结合，并激活一 系列信号传递通路。在这个过程中，包括植物细胞表面受体、蛋白激酶、转录因子和调节蛋白等多个分子参与。此外，植物细胞通过产生 抗菌肽、激活相关抗病基因和调节细胞壁合成等机制来抵抗根癌农杆 菌的入侵。
根癌农杆菌介导的植物转化－叶盘转化法 一、原理 以根癌农杆菌介导的遗传转化是目前最有效的途径之一。根癌农杆菌对植物释放的化学物质产生趋化反应，向植物受伤组织集中。经共培养后，受伤部位的化学诱导物透过农杆菌的细胞膜使Ti质粒上的Vir基因活化。Vir基因产物使Ti质粒上的T－DNA进入植物细胞，并整合到植物核基因组中。插入在T－DNA左右边界区内的目的基因也随之整合到植物染色体上，从而使目的基因在植物细胞中得到表达。 二、目的 了解根癌农杆菌介导的植物基因转化的方法和用途，掌握叶盘转化法的基本原理和操作。 三、材料、试剂和器具 1、烟草、甘蓝无菌苗或田间生长的植株。 2、含目的基因的共整合载体或双元载体的根癌农杆菌。 3、YEB液培养基。 4、抗菌素储备液(Kan, Cif, Rif, Amp)。
5、MS基本培养基。 6、MS分化培养基。 7、70％乙醇。 8、0.1%升汞。 四、操作步骤 1、取幼嫩健康的叶片，用蒸馏水冲洗一遍，70％乙醇洗45秒，0.1%升汞消毒6－8分钟，无菌水冲洗5次，无菌滤纸吸干水分。 2、将无菌叶片剪成份0.5cm×0.5cm的小块，叶片近轴面向下，接种在愈伤组织诱导或分化培养基上，预培养2－3天。 3、挑取一个单菌落根癌农杆菌，接种到20ml附加相应抗生素的YEB培养液中，在27℃恒温摇床上培养到OD值为0.6-0.8。取上述上培养物按1％－2％的比例，转入新鲜的无抗菌素的YEB培养液中，继续培养6小时，当OD值为0.2-0.5时即可用于转化。 4、在超净工作台上，将菌液倒入无菌小培养皿，从培养液中取出预培养的外植体，放入菌液中泡1－5分钟。取出外植体在无菌滤纸上吸去附着的菌液。然后接种在愈伤组织诱导或分化培养基（烟草的培养基为MS附加IAA0.5mg/L, BA2.0mg/L）上，28℃暗培养2－4天。 5、将经过共培养的外植体转移到加有选择压的脱菌分化和愈伤组织诱
猕猴桃遗传转化研究进展 猕猴桃属于猕猴桃科猕猴桃属的多年生落叶藤本植物，其果实营养丰富，人体必需的矿物质、纤维素和维生素含量较高。此外，还具有药用价值，有水果之王之美誉。要获得高品质的猕猴桃，遗传转化无疑成为一种有效的现代生物技术。猕猴桃属雌雄异株，倍性复杂，雌雄株间花期不遇使种间杂交困难，育种周期长，且有不确定性。因此，需要引进新的手段和方法进行育种。目前，猕猴桃的遗传转化已取得很大进步，本文就猕猴桃遗传转化方面的研究进展做一综述。 1 已别离与克隆的猕猴桃目的基因 目前已被别离和克隆的目的基因，主要与猕猴桃果实成熟及衰老过程有关。从1993年开始，MacDiarmid和任小林等分别成功地从猕猴桃果实中别离和克隆出ACC氧化酶基因，导入猕猴桃，均可增强猕猴桃的耐贮藏性。1997年王春霞等建立了由根癌农杆菌介导的西瓜高效遗传转化系统，来控制植株的寿命和果实早熟或耐储藏性。xx年宋喜贵等利用从番茄果实中别离到的ACC合成酶c DNA基因反向置于CaMV35S启动子的控制之下，并转入美味猕猴桃的愈伤组织中从而延缓植株衰老并提高其耐贮藏性。Atkinson等从美味猕猴桃中别离克隆出PG基因。任小林等还从美味猕猴桃中克隆了钙调蛋白c DNA。徐昌杰等从中华猕猴桃别离出的ACC合成酶家族四个成员的基因组DNA片段。 2 猕猴桃遗传转化的方法 遗传转化主要是将外源基因导入受体细胞中，使之发生定向的遗传变异。通常利用重组DNA，组织培养或种质系统转化等技术，其方法主要有农杆菌介导法、花粉管通道法等。目
前，在猕猴桃遗传转化中应用的方法主要有农杆菌介导法、基因枪法、DNA直接摄取法等。 2.1 农杆菌介导转化法 包括根癌农杆菌和发根农杆菌介导法。该方法研究较成熟。农杆菌介导法获得稳定转化体的频率更高且重复性更好。 2.2 基因枪介导转化法 又称微弹轰击法，其将外源DNA片段包裹在微小金粒或钨粒外表，然后在高压作用下将微粒高速射入植物细胞或组织中，微粒上的外源DNA进入细胞后整合到植物染色体上，得到阳性表达从而实现基因转化。樊军锋等利用叶圆盘法和基因枪相结合，进行了秦美猕猴桃双价耐盐基因的转化研究并获得抗性转化植株。 2.3 DNA直接摄取法 DNA直接摄取法是将植物原生质体和外源DNA共培养，通过一定的化学和物理处理，使DNA进人植物细胞并得以表达。常见的有聚乙二醇法、电场诱导法等，通过改变细胞膜的通透性从而使原生质体获得转化。Oliver等以原生质体为受体系统，将外源基因cat（氯霉素磷酸转移酶）用电激法和PEG法转化美味猕猴桃原生质体获得成功。 3 猕猴桃遗传转化的影响因素 3.1 农杆菌菌株 3.1.1 菌株自身的影响因素 不同农杆菌菌株对猕猴桃侵染力有一定的'差异，这些影响因素包括农杆菌的趋向能力；农杆菌外表存在不适合的成分阻止农杆菌对植物细胞的附着；农杆菌外膜信号受体蛋白不能有效地识别植物细胞分泌的诱导分子等。研究说明A281略好于C58，C58的感染力强于
根癌农杆菌介导的甜樱桃茎尖遗传转化体系的建立木本植物包括大部分果树以及所有的林木，在国民经济和人类生存方面发挥着极其重要的作用。木本植物相对于大田作物和其他草本植物有一个较长的营养生长期，这是运用传统杂交育种方法改良木本植物性状的主要障碍。 植物遗传转化为克服木本植物传统育种局限性、加速树木遗传育种进程提供了一条有效途径。植物遗传转化能在分子水平上改造植物的遗传物质，它可以打破物种之间的生殖隔离障碍，定向改造植物遗传性状，提高了育种的目的性和可操作性。 植物遗传转化的研究和应用在近二十年中取得了巨大的发展，但是木本植物的遗传转化却远远落后于大田作物和其他草本植物。主要原因是木本植物的高频再生体系和高效遗传转化体系不够完善。 绝大部分果树属于木本植物。果树的遗传转化进展缓慢，甚至落后于林木，其原因仍然是缺乏适宜的遗传转化受体和高效的遗传转化方法。 樱桃是一年中最早上市的水果（木本），填补了春淡水果市场，而且风味和色泽深受人们喜爱。但其具有果小、核大、肉薄和裂果的缺点，而且是传统育种方法很难改良的树种之一，这促使人们想通过遗传转化技术改变其不良性状。 但缺乏合适的高效转化体系，为建立木本果树优良的遗传转化体系，本论文以甜樱桃为材料，用甜樱桃茎尖作外植体，建立了甜樱桃茎尖高频再生体系；并以驯化培养后的甜樱桃茎尖为受体，通过优化农杆菌遗传转化方法的各项参数，建立了甜樱桃茎尖遗传转化体系，其结果如下： 1、确定甜樱桃芽的再生体系通过进行不同激素组合对甜樱桃腋芽分化率的影响实验，确定了甜樱桃芽的再生体系为：诱导甜樱桃芽分化的培养基是B5+1.0mg／L
BA+0.1mg／LNAA、B5+1.0mg/L BA+0.2～0.5mg／LIAA，增殖培养基是B5+BA0.25mg／L+NAA0.05mg/L，生根培养基是 B5+IBA0.2～0.5mg/L。甜樱桃芽在该再生体系中的再生频率为97％。 2、比较不同浓度Cef的杀菌效果和受体材料对Kan的敏感度，确定了Cef的脱菌浓度是500mg/L和Kan的筛选强度50mg／L。 3、建立了农杆菌介导的甜樱桃茎尖转化体系棍癌农杆菌介导的甜樱状茎 尖迟传转化体系的灭立用驯化培养的甜樱桃茎尖作受体，优化了农杆菌介导转化体系的多项参数；以OD。 。0二～0．5的农杆菌菌液感染30删后共培养3d，能获得0．78％的抗性绿芽率。 4、通过比较二即筛选、延迟筛选和梯度筛选三种筛选方式对抗性绿苗率的影啊，得到梯度筛选的转化率为0．85％，是该转化体系的较好筛选方式c 5、实验研究了AS、Tween20和负压等回素对转化效率的影响，表明AS可明显提高转化效率，其最适浓度为120fnmoll；T、cen20和负压处理也能提高转化频率，了、een20的适宜浓度是 0．l％，负压的适宜处理是 lmm XIO次。 6、通过P＊R 扩增，初步证明证明外源基回己转入甜樱桃。
玉米遗传转化体系的研究进展 摘要：植物遗传转化是指以植物器官、组织、细胞或原生质体作为受体,通过某种技术或途径转入外源基因,获得使外源基因稳定表达的可育植株。玉米作为世界上主要三大粮食作物之一, 是现代食品工业、医药工业和化学工业的重要原料,在世界经济乃至人类生存方面占据肴举足轻重的地位，所以它的遗传转化研究一直受到各国科学家的重视，至今对玉米遗传转化的研究已经取得了一些成绩，本文主要针对近年来玉米遗传转化技术所取得的重要进展进行论述。主要包括玉米转化受体系统、转化方法及其优点与存在的问题以及对未来的展望等几方面论述玉米遗传转化的研究进展。 关键词：玉米；受体系统；遗传转化方法 0 前言 近年来，随着环境着人口、资源、环境三者之间矛盾的加剧，转基因作物渐渐地进入人们的视野并且显得极为重要。玉米是重要的粮食、饲料，同时还是制药、淀粉、糖浆、油料、酒精工业的主要原料，在我国经济生产中占有非常重要的地位。所以玉米遗传转化的研究备受各国科学家的重视。自1988年Rhodes等首次获得玉米转基因完整植株以来，玉米遗传转化技术得到了较大的发展[1]。不但许多有价值的基因转入玉米，而且转基因方法也出现了多样化，如基因枪法、农杆菌介导法、花粉管通道法等。随着转基因技术的发展与完善，更多的优良外源基因将被用于玉米的遗传改良，并且为阐述单子叶植物基因表达调控机理提供了新方法。 1玉米遗传转化受体系统的研究 1．1玉米基因转化受体体系应具备的条件是： 1 高效稳定的再生能力： 用于植物基因转化的外植体必须易于再生，有很高的再生频率，并且具有稳定性和重复性。根据贾士荣等报道认为，用于基因转化的受体系统应具有80%-90%以上的再生频率，并且每块外植体上必须再生丛生芽，其芽数量越多越好，这样才有可能获得较高频率转化。 2 较高的遗传稳定性： 植物基因转化是将外源基因导入植物并使之整合、表达和遗传，从而达到修饰原有植物遗传物质、改造不良的园艺性状之目的，这就要求植物受体系统接受外源DNA后应不影响其分裂和分化并能稳定地将外源基因遗传给后代，保持遗传稳定性，尽量减少变异。
根癌农杆菌介导的橡胶树花药愈伤组织遗传转化体系的建立黄天带;李哲;孙爱花;周权男;华玉伟;黄华孙 【摘要】为建立根癌农杆菌介导的橡胶树遗传转化体系,以花药愈伤组织为受体,研究了农杆菌菌株、共培养温度、共培养时间、乙酰丁香酮(AS)等因素对遗传转化效率的影响.结果表明,农杆菌菌株、共培养温度和共培养时间对转化效率具有显著影响,AS不影响转化效率.2.2万个花药愈伤组织经EHA105菌株侵染后,转入未添加AS的培养基,22℃共培养6 d,通过50 mg L-1卡那霉素抗性筛选、叶片GUS染色、uidA和Npt Ⅱ基因PCR特异扩增、PCR产物测序及Npt Ⅱ基因Southern检测,鉴定出11株转基因植株,并通过嫁接和次生体胚发生,获得来自8个转基因株系的681株转基因植株,移栽成活253株. 【期刊名称】《作物学报》 【年(卷),期】2010(036)010 【总页数】7页(P1691-1697) 【关键词】橡胶树;根癌农杆菌;花药愈伤组织;遗传转化;次生体胚发生 【作者】黄天带;李哲;孙爱花;周权男;华玉伟;黄华孙 【作者单位】中国热带农业科学院橡胶研究所/国家橡胶树育种中心/农业部橡胶树生物学重点开放实验窜/省部共建国家重点实验室培育基地/海南省热带作物栽培生理学重点实验室,海南,儋州,571737;中国热带农业科学院橡胶研究所/国家橡胶树育种中心/农业部橡胶树生物学重点开放实验窜/省部共建国家重点实验室培育基地/ 海南省热带作物栽培生理学重点实验室,海南,儋州,571737;中国热带农业科学院橡 胶研究所/国家橡胶树育种中心/农业部橡胶树生物学重点开放实验窜/省部共建国
苜蓿遗传转化研究趋势 目录 引言 (2) 1. 苜蓿转基因技术研究现状 (2) 1.1 农杆菌介导法 (2) 1.2 基因枪法 (3) 1.3 花粉管通道法 (3) 1.4 电击法 (4) 1.5 PEG介导法 (4) 2. 苜蓿遗传转化研究进展 (4) 2.1 苜蓿遗传转化的研究现状 (5) 2.2 苜蓿遗传转化的应用 (5) 2.2.1 苜蓿遗传转化在提高非生物胁迫的应用 (5) 2.2.2 苜蓿遗传转化在提高生物胁迫的应用 (6) 2.2.3 苜蓿遗传转化在品质改良方面的应用 (8) 3. 苜蓿遗传转化研究趋势 (8) 4. 结语 (8) 参考文献............................................ 错误!未定义书签。
引言 紫花苜蓿是世界上分布最广的多年生豆科植物之一。在中国，它也是一个最重要的豆科牧草。它不仅产量高，而且营养丰富。但是，随着草地盐渍化程度的加剧、草地生态环境的破坏和草地植被的严重退化，应培育大量的新品种，以满足草地畜牧业对牧草生产的需求。传统的选育抗盐、抗旱、抗病昆虫的育种方法具有长期、缓慢的不利因素。利用转基因技术培育苜蓿抗性新品种是牧草育种中最有效的方法。1986年，农杆菌促成的首例苜蓿转化成功。近10年来，苜蓿转基因研究取得了很大进展，本文综述了近十年来苜蓿转基因研究。 1. 苜蓿转基因技术研究现状 1.1 农杆菌介导法 农杆菌是一种土壤中的革兰氏阴性杆菌，主要分为发根农杆菌和分根癌农杆菌两类，它们可以通过伤口和伤口浸染植物冠瘿和毛根。农杆菌介导法是植物转基因工程发展最为明显、最成熟、应用最广泛的方法。它吸收自然转化机制的优点，消除了大量的T-DNA区基因，使其失去其致瘤性，并可以在感染植物的伤口把T-DNA转移到受体植物的基因组。早在1986年初，Deak 等以苜蓿茎段为外植体，通过农杆菌介导的方法导入紫花苜蓿，并获得转基因植株。1985年，horsh 等以叶片为外植体，和农杆菌介导的叶盘转化法成立，扩大了农杆菌侵染受体使用。1988年，Chabaud等用农杆菌介导叶和苜蓿叶柄感染表明，农杆菌种类及共培养时间均影响苜蓿遗传转化的重要因素。Hill等用农杆菌介导的转化编码苜蓿花叶病毒外壳蛋白基因转入不同品种的苜蓿，并对再生植株喷涂AMV病毒，发现转基因苜蓿比野生型苜蓿抗AMV强。1992年，Wandelt 等介绍了豌豆蛋白基因导入苜蓿根癌农杆菌介导法。转基因苜蓿的球蛋白含量提高到0.1%，是普通苜蓿的20倍。Tabe等用根癌农杆菌介导的葵花籽蛋白基因转入苜蓿的引入，使转基因苜蓿蛋白含量占叶片可溶性蛋白的0.1%。近年来，国内已经在农杆菌介导苜蓿转化方面获得巨大的进步。2002年，黄剑成功地建立了苜蓿高频再生体系。在农杆菌介导法的基础上，将甜菜碱醛脱氢酶基因导入苜蓿，获得转基因耐盐苜蓿。金树梅与苜蓿子叶为外植体，农杆菌介导的转化Gus基因转入某一种苜蓿中。曹致中等利用农杆菌介导法，建立了“中苜一号”紫花苜蓿的遗传转化体
根癌农杆菌介导的木霉遗传转化及应用进展 范亮波;李梅;冀颖;刘卫德;蒋细良 【摘要】木霉作为土传植物病原菌的生防真菌,研究其功能基因具有重要的意义.根癌农杆菌介导的遗传转化(ATMT)为木霉功能基因的研究提供了一个强有力的工具.对根癌农杆菌介导木霉遗传转化的机理、特点、方法及其在木霉中的应用进行了综述. 【期刊名称】《生物技术通报》 【年(卷),期】2010(000)003 【总页数】6页(P1-5,12) 【关键词】根癌农杆菌;木霉菌;遗传转化;TDNA 【作者】范亮波;李梅;冀颖;刘卫德;蒋细良 【作者单位】中国农业科学院植物保护研究所,农业部生物防治重点开放实验室,北京,100081;中国农业科学院植物保护研究所,农业部生物防治重点开放实验室,北京,100081;中国农业科学院植物保护研究所,农业部生物防治重点开放实验室,北京,100081;中国农业科学院植物保护研究所,农业部生物防治重点开放实验室,北京,100081;中国农业科学院植物保护研究所,农业部生物防治重点开放实验室,北京,100081 【正文语种】中文 木霉(Trichoderma spp.)属半知菌亚门,丝孢纲,丛梗孢目,是一种广泛存在于土壤中的丝状真菌。木霉可产生肽醇类、类固醇类、聚酮类、异腈类等多种抗菌代谢产物
以及几丁质酶、葡聚糖酶、淀粉酶等多种水解酶。这些抗菌代谢产物和酶类在木霉的生防特性中扮演了重要的角色,也对工农业生产有很大的利用价值。以往对木霉的研究主要集中在其分类、生防活性及产酶特性等几个方面[1],随着现代生物技术的不断发展,对木霉进行遗传转化,研究其基因功能,并依此来进一步改良木霉使其发挥更大的作用,成为木霉的一个研究热点。 实现丝状真菌遗传转化的方法有很多。根癌农杆菌介导的转化方法(ATMT)因操作方便,转化效率高及重复性好等特点而受到广大研究者的青睐。ATMT最初一直被用于多种植物的遗传转化,1995年,Bundock等[2]首次成功进行了根癌农杆菌介导的酵母菌遗传转化,随后 1998年,De Groot等[3]首次利用 ATMT法对 6种丝状真菌(包括木霉 Trichoderma reesei)进行了转化,并获得了成功。此后,ATMT因其独具的许多优点而被广泛地应用于丝状真菌的遗传转化中。ATMT为木霉遗传转化提供了很好的工具,利用 ATMT法对木霉进行随机或定点基因插入突变,在分子生物学水平上对木霉的基因进行研究,不仅对木霉分类学、生态学、生理生化及遗传学是很大的促进,而且对提高木霉的生物防效具有更重要的实践指导意义。将对ATMT转化木霉的机理、特点、方法、影响因素及其在木霉中的应用逐一进行阐述。 已有研究表明,与农杆菌转化植物相类似,根癌农杆菌介导木霉等丝状真菌的遗传转化同样需要Vir基因的表达。目前,对根癌农杆菌介导转化中农杆菌自身的转录和调控机理已研究得相当深入[4]。农杆菌 Ti质粒上毒性基因 Vir的表达是完成遗传转化所必须的。Vir区上有 6个操纵子(VirA-E,VirG),它们编码的蛋白质产物参与单链T-DNA的合成、加工和转移等过程。VirA与 VirG为调节蛋白,呈低水平的组成型表达,当外界存在酚类化合物如乙酰丁香酮等诱导物时,VirA通过自我磷酸化而活化,活化后的 VirA又将其磷酸基团转给VirG,使 VirG磷酸化而活化。VirG编码的蛋白质产物作为转录因子引起 VirB,VirC,VirD,VirE等的表达。VirD编码的产物