酵母蔗糖酶的分离提取论文
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酵母蔗糖酶的分离提取姓名：xxx 学号：xxxx 指导老师：xxxx大学 xx学院 10级1班邮编：xx摘要：采用自溶法从酵母中提取蔗糖酶，通过乙醇的分级与透析，得到较高纯度的酵母蔗糖酶。
并对每次所提取的蛋白质浓度、酶活性、纯化倍数及产量做了相应的计算。
最后所得的纯化倍数为14.41倍，产量为59.56%。
关键词：酵母蔗糖酶酶活力自溶法产量前言：生物体内所发生的一切化学反应，几乎都是在专一性酶的催化下进行的，因此酶的研究对了解生命活动的规律以及生命本质的阐述具有十分重要的意义。
随着分子生物学的发展，不论对酶分子本身作用机制的研究以及其他研究，越来越需要纯度高的酶制剂。
蔗糖酶又称转化酶，可作用于β-1,2糖苷键，将蔗糖水解为D-葡萄糖和D-果糖。
可用于转化蔗糖，增加甜味，制造人造蜂蜜，防止高浓度糖浆中的蔗糖析出，制造含果糖和巧克力的软心糖。
蔗糖酶在畜牧方面，可防治禽兽的疾病，促进幼龄禽兽的发育，节约饲料和提高肉产量等；在农业方面可防治植物病害、刺激植物生长、提高作物产量；在工业上可用作鱼、肉、蔬菜和水果等食品的保鲜剂。
1.材料与方法1.1试剂酵母粉（实验室提供），醋酸钠(0.5g)，乙酸乙酯（8ml），10%醋酸，无水乙醇，1mol/LNaOH，蒸馏水，PH=4.7缓冲液，DNS试剂，0.9%NaCl，考马斯亮蓝G-250，系列标准蛋白液，150mol/L 磷酸等。
1.2器材离心机，722分光光度计，水浴锅，量筒25ml，烧杯100ml，大小试管若干，各种专用移液管，吸耳球，玻离棒，胶头滴管，PH试纸等。
1.3方法1.3.1蔗糖酶粗品制备方法（1）自溶法将5g酵母粉倒入500mL烧杯中、少量多次的加入15mL蒸馏水搅拌均匀，成糊状后加入0.5g乙酸钠、8mL乙酸乙酯，搅匀，盖好，于35℃恒温水浴中搅拌30min。
(注：整个实验应避免高温，以防止酶失活)（2）抽提补加蒸馏水10mL，搅匀，盖好，于35℃恒温过夜，4000r/min 离心10min弃沉淀，得E1;量体积V1=17.3mL,取出2mL置于4℃冰箱保存，待测酶活力及蛋白质浓度(留样1)。
（3）乙醇分级和透析测E1 PH：用10%HAC调PH至4.5（注意少量、慢加、搅匀，防止调过），共加入0.7mL 10%HAC。
①第一次乙醇分级（30%乙醇饱和度）计算出使Ｅ１得乙醇浓度达30%时所需的无水乙醇Ｘ１的体积为6.9ml，将Ｅ１和乙醇Ｘ１，放入冰浴中预冷，在不断搅拌下缓慢滴加乙醇，4000ｒ/min离心10min，弃沉淀，留上清，得E2；得到上清液为V2=20.2ml（留样２）。
②第二次乙醇分级（50%乙醇饱和度）同上法加入Ｘ２（为达50%乙醇饱和度时需要补加的无水乙醇的体积），计算的加入无水乙醇Ｘ２为7.3mL。
4000ｒ/min离心10min，弃上清，沉淀立即用10ml 150mol/LPH6.0的磷酸溶解，并装入透析袋，透析６小时，4000ｒ/min离心10min，得E3，量体积V3＝11.3mL（留样３）。
③测定各步的总蛋白、总活力、并据此计算比活、回收率和纯化倍数。
纯化倍数=每次比活力/第一次比活力产量（%）=每次总活力/第一次总活力1.3.2蛋白质浓度测定——考马斯亮蓝G250染色法考马斯亮蓝G250在酸性溶液中呈棕褐色，它与蛋白质通过疏水结合作用后，变为蓝色，最大吸收光谱从470nm移至595nm，在一定条件下，蛋白质的浓度与595nm吸收度成正比例。
该法灵敏度在0.01~1.0ug/ml。
（1）蛋白质标准曲线的制作表1 蛋白质定量测定标准曲线制作溶液０管１管２管３管４管５管系列标准蛋白液／mL — 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0实际蛋白质含量／ug— 20 40 60 80 1000.9%生理盐水/mL 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 —蛋白质染色液／mL 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0轻轻摇匀，5min后以0号管调空白，595nm分光光度法测光密度值，测得结果为：试管１２３４５ＯＤ值 0.079 0.204 0.315 0.394 0.508根据结果绘出标准曲线：图1 蛋白质标准曲线根据上图的蛋白质标准曲线得到公式：y=5.06x (y:OD595值；x:蛋白质含量/mg)（2）蛋白质浓度测定从留样中取0.3ml加0.9%的NaCl 稀释至3ml（根据实际情况来确定稀释倍数），再按以下表格操作测定表2 蛋白质浓度OD595值溶液对照组留样留样’系列标准蛋白液/ml — 0.5 0.50.9%生理盐水/ml 1.0 0.5 0.5蛋白质染色液/ml 5.0 5.0 5.01.3.3蔗糖酶活性测定(1) 酶活性测定取5%的蔗糖、酶液5ml分别于35℃水浴中预热5min[若酶浓度过高，用0.2mol/L的醋酸缓冲液（PH=4.7）适当稀释]表3 蔗糖酶水解蔗糖试管 0管 1管5%蔗糖（mL） 2 21mol/L NaOH(mL) 0.5酶液（mL） 2 235℃水浴，3min1mol/L NaOH(mL) 0.5表4 还原糖的测定试管 0管 1管 2管反应液（mL） 0.5 0.5 0.5（取自表1中0管）（取自表1中1管）（取自表1中1管）DNS试剂（mL） 3 3 3水（mL） 1.5 1.5 1.5沸水浴5min后，立即流水冷却水（mL） 20 20 20OD520在葡萄糖标准曲线上找到所测定光吸收值对应的葡萄糖含量，按下面公式计算酶活力：蔗糖酶活力单位＝葡糖糖毫克数×9×酶的稀释倍数/2葡萄糖标准曲线公式为：y=0.0746x+0.0024 （y:OD520值；x:葡萄糖含量/mg ）在本实验条件下，每3min释放１毫克还原糖所需的酶量，定义为一个活力单位。
2.结果与分析2.1结果经测量和计算得表5 蛋白质浓度项目OD595E1 E2 E31 0.792 0.356 0.0502 0.803 0.354 0.055平均 0.797 0.355 0.053 蛋白质含量（mg） 0.158 0.070 0.010蛋白质浓度（mg/mL） 3.160 1.400 0.200表6 酶活力测定项目OD520E1(稀释150倍) E2(稀释100倍) E3(稀释100倍)1 0.275 0.161 0.3722 0.279 0.172 0.384平均 0.277 0.1665 0.378 葡萄糖毫克数/mg 3.681 2.200 5.035蔗糖酶活力单位 248.47 99.00 226.58表7 蔗糖酶分离提取效果计算留体积蛋白质浓度总蛋白活力总活力比活力纯化产量样mL(mg/ mL) (mg) （U/ mL）（U） (U/ mL ) 倍数（回收率）1 17.3 1.58 27.33 2484.7 42985.31 1572.8 1 1002 20.2 0.70 14.14 990 19998 1414.3 0.90 46.523 11.3 0.10 1.130 2265.8 25603.54 22658 14.41 59.562.2分析Ⅰ．该实验中酵母粉的搅拌均匀程度将影响整个实验的操作及结果(即最关键的一步)。
Ⅱ.在侧OD值时，电子示数不稳定，可能是由于溶液内部的物质分布不均匀。
Ⅲ.在蛋白质浓度测定时所用稀释倍数均为300倍，留样1与留样2的测定效果相对较好，留样3的OD值则较小，可能是稀释倍数过大。
Ⅳ. 在测定酶活力时，由于不知道所提取的蔗糖酶的活力，稀释时不能确切知道最佳稀释倍数。
故在多次探索后，确定了可用稀释倍数（见表6）。
按此稀释倍数稀释时，效果较好且OD值的范围在0.1~ 0.9。
Ⅴ.从比活力的测定看，留样2的比活力比留样1小，极大可能是由于在用10%HAC调E1的PH至4.5过程中加入过多的平衡液，同时也反映在留样2的纯化倍数小于留样上（按照理论，纯化的倍数应越来越高，即[E1]<[E2]<[E3]）。
3. 讨论本实验采用自溶法从酵母中提取蔗糖酶，通过乙醇的分级与透析，得到纯化的酵母蔗糖酶。
由于实验步骤较复杂，且不是连续操作，而是中间有很多间断等多种因素的影响，以致所得数据不太理想。
而本实验的衔接性比较强，随着实验的深入，试验的偏差就愈来愈明显，而后面数据较难取舍，只能得出十分粗糙的结论：，提取出的产品的蛋白质浓度为0.10mg/mL,酶总活力为25603.54U，比活力为22658U/mg，纯化倍数为14.41倍，回收率为59.56%。
另外，由于时间仓促和操作水平的限制，本实验也有许多不足之处需要改进。
The Separation and Extraction of Y east SucraseWriter:Huang Guoyu Instructor:Tao FangAbstract：The paper used the autolysis method to extract Sucrase from the yeast , through gradingethanol and dialysis ,to obtain a higher purity of yeast Sucrase. And each of the extracted protein concentration, enzyme activity, purification factor and output was made the corresponding calculations. Final purification factor obtained was 14.41times, production was 59.56%.Key words : yeast Sucrase enzyme activity autolysis method production。
