生化实验报告离子交换柱层析分离纯化蔗糖酶

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3、 蔗糖酶粗品（E1）的制备
①自溶：15g（一小袋）高活性干酵母粉倒入250ml烧杯中、少量多次地 加入50ml蒸馏水，搅拌均匀，成糊状后加入1.5g乙酸钠、25ml乙酸乙 酯，搅匀，再于35℃ 恒温水浴中搅拌30分钟，观察菌体自溶现象；
②抽提：补加蒸馏水30ml，搅匀，盖好，于35℃ 恒温过夜， 8000r/min
7.学习掌握酶促反应动力学中用双倒数法测定Km的方法、选择 确
定酶促反应最适条件（温度、pH值、离子浓度等）的方法；
8.学习《正交试验法》中最简单的入门知识：用正交表设计
试验方案、用极差分析处理试验数据并分析试验结果。
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Байду номын сангаас
二、实验原理
前言
酶是生物体内具有催化功能的蛋白质，可据酶蛋白的结构 和性质选择分离提纯条件和含量测定方法。
② 工作以曲葡线萄。糖(mg)含量为横坐标、A540值为纵坐标，画出
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3，5-二硝基水杨酸比色定糖法工作曲线的制作
试号 含糖量 葡萄糖标准液 去离子水 3，5-二硝基水杨酸试剂 A540
（mg） （ml） （ml）
（ ml）
10
0
2.0
3
2 0.4 0.2
1.8
3
3 0.8 0.4
⑥ 保存成品E3
测酶E3活力及蛋白质浓度
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成品E3 计算出E3浓度
周六（全天）上午8：00开始
(1).蔗糖酶米氏常数的测定
(2).用正交法测定几种因素
对蔗糖酶 活力的影响
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第1篇一、实验目的1. 理解蔗糖酶的催化原理和特性。

2. 掌握蔗糖酶的提取、纯化方法。

3. 学习通过不同方法测定蔗糖酶的活力。

4. 分析影响蔗糖酶活性的因素。

二、实验原理蔗糖酶是一种能够将蔗糖分解为葡萄糖和果糖的酶。

本实验旨在通过提取、纯化蔗糖酶，并测定其活力，了解蔗糖酶的特性。

三、实验材料与试剂1. 材料：- 酵母细胞- 淀粉- 蔗糖- 还原糖试剂（如班氏试剂）2. 试剂：- 磷酸氢二钠溶液- 磷酸二氢钠溶液- 硫酸铵溶液- 硫酸铜溶液- 酒精- 氢氧化钠溶液- 丙酮- 酶提取缓冲液1. 蔗糖酶的提取：- 将酵母细胞用磷酸缓冲液洗涤，并悬浮于磷酸缓冲液中。

- 使用匀浆机破碎细胞，收集匀浆液。

- 将匀浆液离心，收集上清液即为蔗糖酶粗提液。

2. 蔗糖酶的纯化：- 将蔗糖酶粗提液用硫酸铵溶液进行盐析，收集沉淀。

- 将沉淀用磷酸缓冲液溶解，并使用凝胶过滤柱进行纯化。

3. 蔗糖酶活力的测定：- 将纯化后的蔗糖酶与蔗糖溶液混合，在适宜的温度下反应。

- 加入还原糖试剂，观察颜色变化，根据颜色变化判断蔗糖酶的活力。

五、实验结果与分析1. 蔗糖酶的提取：- 通过匀浆和离心，成功提取出酵母细胞中的蔗糖酶。

2. 蔗糖酶的纯化：- 通过盐析和凝胶过滤柱，成功纯化出蔗糖酶。

3. 蔗糖酶活力的测定：- 在适宜的温度下，蔗糖酶能够将蔗糖分解为葡萄糖和果糖。

- 加入还原糖试剂后，溶液颜色发生变化，表明蔗糖酶具有活力。

4. 影响蔗糖酶活性的因素：- 温度：在一定范围内，温度升高，蔗糖酶的活力增加。

- pH值：在一定范围内，pH值升高，蔗糖酶的活力增加。

- 抑制剂：某些物质（如重金属离子）可以抑制蔗糖酶的活力。

1. 本实验成功提取和纯化了蔗糖酶，并测定了其活力。

2. 实验结果表明，温度和pH值是影响蔗糖酶活性的重要因素。

3. 在实际应用中，需要根据具体情况进行酶活性的调控，以获得最佳催化效果。

七、实验结论1. 蔗糖酶是一种能够将蔗糖分解为葡萄糖和果糖的酶。

恒流泵
核酸蛋白检测仪
部分收集器
部分收集器
部分收集器控制面板
部分收集器
记录仪
记录仪
记录仪
左侧纸速等调控面板

记录仪
右侧灵敏度、记录笔等调控面板
离子交换柱层析分离纯化检测仪器
（全国产国产仪器组合）
梯度混合器
层析柱
记录仪
部分收集器
核酸蛋白检测仪
恒流泵
无纸记录仪
部分收集器
部分收集器
离子交换柱层析分离纯化检测仪器
（进口仪器与国产仪器组合）
梯度混合器（国产）
层析柱
（φ1.0×20㎝ ）
恒流泵 （国产）
核酸蛋白检测仪 （进口）
部分收集器 （进口）
记录仪 （进口）
层析柱 （φ1.0×20㎝ ）
DEAE- Sepharose Fast Flow
梯度混合器
梯度杯
梯度混合器
恒流泵
核酸蛋白检测仪
灵敏度调节、调零
走纸调速
无纸记录仪
蔗糖酶活力检测现象
（纯化过程各收集管蔗糖酶活力检测的显色现象）
样品收集管依次蔗糖酶活力检测的显色现象 空白对照管
样品收集管依次蔗糖酶活力检测的显色现象
样品收集管依次蔗糖酶活力检测的显色现象
空白对照管
两支蔗糖酶活力最高的收集管检测显色情况

S tud ie s on M e thod D e ve lopm e n t of Inve rta s e Ion Excha nge C h rom a tog ram P urifica tion
X U P ei2y a, Q IU L e2quan (Co llege of B io log ica l and Environm en ta l Eng. , Zhejiang U n iv. of T echno logy, H angzhou 310032, Ch ina)
Sep h ro se 314. 8
2. 05
2. 87
110. 3
109. 7
98. 2
293. 4ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
0. 49
0. 92
200. 4
318. 9
43. 4
93. 2
浓缩倍数
2. 03
1. 82
2. 91
4 结 语
经 过 上 述 几 种 纯 化 方 法 的 比 较, 采 用 Q Sep ha ro se 纯化方法进行实验改进, 具有如下特点。
100m in 缩短到现在的 50m in, 减少不必要的实验重 复, 实验过程比较紧凑。
(3) 节约实验支出。离子交换介质D EA E2纤维素 由于流速慢, 柱床高度会随缓冲液浓度及 pH 改变, 不 能承受 0. 1M 以上 N aO H 清洗, 重生效果差, 寿命短。 琼脂糖介质在分辨率、回收率、流速等具有优越性。 且 其化学稳定性极高, 不易破碎, 可以承受 1M N aO H 的 清洗, 重生效果好, 可以使用数百至上千次, 因而降低 了成本。
采用 Pha rm acia 公司生产的琼脂糖为基质的弱阴 离子交换柱 D EA E Sep ha ro se 16×10 用起始缓冲液 0. 05M T ris2HCL pH 7. 3 缓冲液平衡, 加样, 先用0. 05 M T ris2HCL 缓冲液洗脱, 流速为每分钟 1mL , 然后盐 度 梯 度 洗 脱, 经 100m in 流 动 相 由 0. 05M T ris2HCL pH 7. 3 缓冲液到 1M N aCL 的 0. 05M T ris2HCL pH 7. 3 缓冲液, 每管收集 3mL , 进行紫外检测 (280nm ) 和酶活 力测定。

酵母蔗糖酶的制备及其动力学性质分析一、蔗糖酶(invertase or sucrase)简介蔗糖酶（EC.3.2.1.26）为水解酶类，主要存在于植物和微生物体内，专一性地催化蔗糖水解为果糖和葡萄糖的反应。

酵母蔗糖酶分子量约270000D，pI约5．0，最适pH4．6，耐酸和热，50℃保温30min 仍具有相当的活力，最适温度37℃。

耐乙醇，因此可用乙醇沉淀进行分离纯化。

二、酵母蔗糖酶的分离纯化本试验分离纯化酵母蔗糖酶分四步：甲苯抽提。

加热纯化。

乙醇分级沉淀。

纤维素柱层析分离纯化。

㈠、前三步分离纯化的原理如下：甲苯石英砂离心上层（甲苯层）：脂溶性物质酵母细胞破细胞中层（水层）：蔗糖酶，可溶性糖等研磨下层（沉淀）：细胞碎片、变性蛋白等取中层50水浴中使热不稳定蛋白变性上清：蔗糖酶、可溶性糖等（水层）保温30分钟沉淀：变性蛋白取上清加乙醇使蔗糖酶沉淀上清：杂蛋白及可溶性糖等冰浴中20分钟沉淀：蔗糖酶、杂蛋白等㈡、纤维素柱层析分离纯化的原理1、离子交换柱层析分离混合物的基本原理离子交换层析（Ion Exchange Chromatography）是一种根据待分离物质的阳或阴离子和相对应的离子交换剂间的静电结合，即根据物质酸碱性、极性等差异，通过离子间的吸附和脱吸附而将溶液中各组分分开的一种技术。

离子交换层析是一种液-固相层析技术。

其中，液相称洗脱液，固相的惰性支持介质称离子交换剂。

在离子交换剂上具有带电基团，不同的交换剂所具有的带电基团的电荷性质不同，如交换剂上的带电基团带正电荷，则可结合溶液（液相）中的阴离子，这样的交换剂称为阴离子交换剂，如DEAE纤维素、强碱型的离子交换树脂等。

反之，如交换剂上的带电基团带负电荷，则可结合溶液中的阳离子，这样的交换剂称为阳离子交换剂，如CM-纤维素、强酸性的离子交换树脂等。

离子与交换剂的静电结合作用具如下特点：选择性：离子所带的电荷越多，离子半径越小，越易结合。

遵循质量作用定理：对某一特定离子，随离子浓度的增大，则遵循质量作用定理向与交换剂结合方向进行可逆性：在一定条件下，结合在交换剂上的离子可被其它）离子取代而离开交换剂并随洗脱液流出层析柱。

蔗糖酶的提取、分离、纯化及活性检测摘要随着分子生物学的发展，不论对酶分子本身作用机制的研究还是其他研究，越来越需要纯度更高的酶制剂，这就要求我们熟悉酶提纯的一般操作步骤及酶的提纯及活力测定等重要的生物实验技术。

本次实验主要通过提取啤酒酵母中的蔗糖酶并经过两次纯化测定其活力与Km。

在实验过程中用乙醇分级分离法，DEAE-Cellulose柱层析，分子筛（凝胶过滤）层析提取纯化蔗糖酶。

在实验过程中，虽然我们很努力,但由于我们对实验的程序不熟悉，因此在实验的一些过程中有一些明显的操作失误，使得实验的最后测定结果与理论值有一定出入。

关键词啤酒酵母蔗糖酶乙醇分级分离 DEAE-Cellulose柱层析分子筛层析Km前言生物体内所发生的一切化学反应，几乎都是在专一性酶的催化下进行的，因此酶的研究对了解生命活动的规律以及生命本质的阐述具有十分重要的意义。

随着分子生物学的发展，不论对酶分子本身作用机制的研究以及分子生物学其他重要课题的研究都越来越多地需要使用作用专一，纯度高的酶制剂。

这就要求人们建立各种方法，以便从各种生物来源的材料中分离提纯酶。

由于酶本身也是蛋白质，因此酶分离提存的方法大体上与蛋白质纯化方法相同，一般来说，没有一种固定的方法，而往往根据实验者所要分离提纯酶的取材以及酶本身的物理﹑化学及生物学性质来确定分离提纯方法。

各种酶的纯化通常有五个阶段：①材料的选择与预处理；②细胞破碎；③抽提；④纯化；⑤浓缩﹑干燥及保存。

酶分离纯化成功与否的重要标志：一是要有较高的收率；二是达到所要求的纯度，这两个指标通常是矛盾的，可根据需要来有所侧重，一般来说，好的方法与步骤应该是简单易行，最终的酶制剂有较高的收率和纯度。

就单独的每种分离提纯的方法而言，有盐析法、有机溶剂分级法、调PH分级沉淀法、选择变性法、吸附法、层析法（纸层析、薄板层析、柱层析等）。

其中盐析法是用于蛋白质和酶分离提纯的最早而且最广泛的一种方法，该方法是根据蛋白质和酶在一定浓度的溶液中溶解度的降低程度的不同而达到彼此分离的方法盐析法常用的中性盐有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等，其中用得最多的是硫酸铵，因为它具有温度系数小而溶解度大的优点。

生物化学实验示范报告:实验名称：蔗糖酶的分离提取与纯化实验目的:1．掌握蔗糖酶分离提纯的原理与实验操作方法；2．掌握有机溶剂分级纯化蔗糖酶的原理和操作方法，了解蔗糖酶的离子交换层析法纯化原理；3．掌握酶活、酶比活等基本概念及测定原理、计算和操作方法；4．巩固并熟练掌握Folin法测定牛血清蛋白和3、5 -二硝基水杨酸法测定葡萄糖标准曲线制作方法，并能通过回归方程测定还原糖及蛋白质的含量。

实验原理：蔗糖酶分离提纯原理：酵母中的蔗糖酶含量很丰富，实验以安琪酵母粉为原料，首先采用自溶法破碎细胞壁、再用乙醇分级和DEAE—纤维素柱层析两步分离提纯，制备纯度较高的蔗糖酶制剂。

酶分离提纯的原理与蛋白质的相同。

但酶是有催化活性的蛋白质，在分离提纯过程中必须注意：防止酶变性失活；随时测定酶的比活力，并跟踪酶的去向、衡量酶提纯的程度及得率。

有机溶剂分级纯化蔗糖酶原理：利用不同蛋白质在不同浓度的有机溶剂—乙醇中溶解度的差异将蔗糖酶蛋白与其它蛋白质杂质进行有机溶剂分级沉淀，而使提取的蔗糖酶得以纯化（32％的乙醇饱和度沉淀分离杂蛋白，47.5％的乙醇饱和度沉淀分离酶蛋白）。

操作必须在低温下进行且避免有机溶剂局部过浓；分离后应立刻除去有机溶剂并用水或缓冲溶液溶解沉淀的酶蛋白（复溶），确保酶的活性；pH多选在酶蛋白的等电点附近；有机溶剂在中性盐存在时能增加蛋白质的溶解度减少变性，提高分离效果。

蔗糖酶的离子交换层析法纯化原理：本实验采用DEAE-纤维素（DEAE-C11）微粒状的、弱碱性的阴离子纤维素为柱料，进行蔗糖酶的进一步纯化。

它具有分辨率高、化学性质稳定、有开放性的长链结构、有较大的表面积、对蛋白质的吸附容量大等优点；纤维素上离子基团的数量不多，排列疏散，对蛋白质的吸附不是太牢固，用缓和的洗脱条件即可达到分离的目的，不致引起蛋白质的变性。

蔗糖酶活力与比活的测定：在蔗糖酶的纯化过程中，通过3、5-二硝基水杨酸法测定蔗糖酶催化蔗糖生成还原糖的量，测定酶活力大小，跟踪酶的活力。

实验报告一、实验目的和要求 三、实验材料和主要仪器 五、实验数据记录和处理 七、实验讨论和心得二、实验内容和原理 四、实验方法和步骤 六、实验结果和分析一、实验目的和要求1、学习离子交换层析的基本原理2、学习离子交换层析分离蛋白质的基本方法和技术3、学习蔗糖酶活性检测的基本原理和方法二、实验内容和原理1、离子交换层析由于蔗糖酶的偏酸性,所以在7.3 缓冲液的环境中，粗分离纯化样品蔗糖酶带负电荷，因此我们用阴离子交换剂可以先与蔗糖酶样品可逆交换吸附，然后通过用盐离子强度逐渐提高的洗脱液，使蔗糖酶和其他杂蛋白质的电荷被中和，与离子交换剂的亲和力降低，把不同的蛋白质按所带电荷的强弱逐一被洗脱下来，从而达到分离蔗糖酶的目的。

2、酶活力检测蔗糖酶是一种水解酶，它能蔗糖水解为等量的葡萄糖和果糖（还原糖）。

（50℃水解） 3.5－二硝基水杨酸与还原糖共热被还原成棕红色的氨基化合物，在一定范围内还原糖的量和反应液的颜色深度成正比。

（100℃显色）三、实验材料和主要仪器1、实验材料蔗糖酶粗分离纯化（溶解即为样品Ⅲ） 2、实验试剂 ⑴⑵ 20 7.3 缓冲液⑶ 20 （1 ）7.3缓冲液 ⑷ 0.2乙酸缓冲液，4.5 ⑸ 5%蔗糖溶液⑹ 3，5-二硝基水杨酸试剂 3、实验仪器（1）高速冷冻离心机（2）层析柱（φ1.0×20㎝ ）(1支/组）（3）Ä （1套/组）（4）部分收集器及收集试管（4管）（1台/组）（5）－20℃冰箱（保存样品用）（6）微量移液枪 200、1000（7）1.5离心管（留样品Ⅲ和样品Ⅳ用）（8）7离心管（留样品Ⅳ用）（9）恒温水浴（50℃、100℃）（10）试管、移液管、试管架等四、实验方法和步骤1、仪器连接（1）接通各仪器电源，将泵头分别放置A，B两个溶液瓶中。

注意B为含溶液。

（2）点击电脑桌面上软件图标，打开软件。

选择，点击，进入操作界面。

点击（3）在操作界面的工具栏，点击。

2.热处理 将上步所得上清液转入50 ml离心管，迅 2.热处理 将上步所得上清液转入50 ml离心管，迅 速放入50℃恒温水浴中，保持30分钟，并用玻璃 速放入50℃恒温水浴中，保持30分钟，并用玻璃 棒温和搅动抽提液，迅速用冰浴冷却，10000rpm 棒温和搅动抽提液，迅速用冰浴冷却，10000rpm 离心10分钟，弃去沉淀，测量上清液体积，留 离心10分钟，弃去沉淀，测量上清液体积，留 1.0ml (Ⅱ样品)测定此酶活力和蛋白浓度。 (Ⅱ样品) 3.酒精沉淀 将热处理后的上清液，加入相同体积 3.酒精沉淀 的-20℃95％乙醇，冰浴中温和搅动，（注意边搅 20℃95％乙醇，冰浴中温和搅动，（注意边搅 慢加，滴加乙醇时滴与滴之间不能连成线！！！） 放置30min，然后10000rpm离心10min，弃去上清 放置30min，然后10000rpm离心10min，弃去上清 液，试管中沉淀放置冰箱保存或将酒精处理后的 沉淀溶于7ml 沉淀溶于7ml 20 mmol/L Tris-HCl、pH7.3 buff(Ⅲ样 Tris-HCl、 buff(Ⅲ 品，留1.0 ml样液测活)，上样前用7ml离心管 品，留1.0 ml样液测活)，上样前用7ml离心管 5000rpm离心10min，待上样。 5000rpm离心10min，待上样。
甲液：溶解6.9g 结晶酚于15.2ml 10％NaOH溶液中，并用水稀释至 甲液：溶解6.9g 结晶酚于15.2ml 10％NaOH溶液中，并用水稀释至 69ml,在此溶液中加6.9g亚硫酸氢钠。 69ml,在此溶液中加6.9g亚硫酸氢钠。 乙液：称取255克酒石酸钾钠加到300ml 10%NaOH溶液中，再加 乙液：称取255克酒石酸钾钠加到300ml 10%NaOH溶液中，再加 入800ml 1%3,5-二硝基水杨酸溶液.甲,乙二溶液相混合即得黄色试剂,贮 1%3,5-二硝基水杨酸溶液. 乙二溶液相混合即得黄色试剂, 于棕色瓶中备用,在室温放置7 10天以后使用。 于棕色瓶中备用,在室温放置7-10天以后使用。

实验九酵母蔗糖酶的提取及其性质的研究本实验为学生提供一个较全面的实践机会，学习如何提取纯化、分析鉴定一种酶，并对这种酶的性质，尤其是动力学性质作初步的研究。

自1860年Bertholet从酒酵母Sacchacomyces Cerevisiae中发现了蔗糖酶以来，它已被广泛地进行了研究。

蔗糖酶（invertase）（β—D—呋喃果糖苷果糖水解酶）（fructofuranoside fructohydrolase）（EC.3.2.1.26）特异地催化非还原糖中的α—呋喃果糖苷键水解，具有相对专一性。

不仅能催化蔗糖水解生成葡萄糖和果糖，也能催化棉子糖水解，生成密二糖和果糖。

本实验提取啤酒酵母中的蔗糖酶。

该酶以两种形式存在于酵母细胞膜的外侧和内侧，在细胞膜外细胞壁中的称之为外蔗糖酶（external yeast invertase）, 其活力占蔗糖酶活力的大部分，是含有50% 糖成分的糖蛋白。

在细胞膜内侧细胞质中的称之为内蔗糖222酶（internal yeast invertase），含有少量的糖。

两种酶的蛋白质部分均为双亚基，二聚体，两种形式的酶的氨基酸组成不同，外酶每个亚基比内酶多两个氨基酸，Ser和Met，它们的分子量也不同，外酶约为27万(或22万，与酵母的来源有关)，内酶约为13.5万。

尽管这两种酶在组成上有较大的差别，但其底物专一性和动力学性质仍十分相似，因此，本实验未区分内酶与外酶，而且由于内酶含量很少，极难提取，本实验提取纯化的主要是外酶。

两种酶的性质对照表如下：实验中，用测定生成还原糖（葡萄糖和果糖）的量来测定蔗糖水解的速度，在给定的实验条件下，每分钟水解底物的量定为蔗糖酶的活力单位。

比活力为每毫克蛋白质的活力单位数。

本实验共有九个分实验：一、蔗糖酶的提取与部分纯化二、离子交换柱层析纯化蔗糖酶三、蔗糖酶各级分活性及蛋白质含量的测定四、反应时间对产物形成的影响五、pH对酶活性的影响和最适pH的测定六、温度对酶活性的影响和反应活化能的测定七、底物浓度对催化反应速度的影响及米氏常数K m和最大反应速度V max的测定八、尿素（脲）抑制蔗糖酶的实验九、棉子糖和果糖抑制蔗糖酶的实验（一）蔗糖酶的提取与部分纯化一、实验目的：学习酶的纯化方法，并为动力学实验提供一定量的蔗糖酶。

实验报告一、实验目的和要求 三、实验材料和主要仪器 五、实验数据记录和处理 七、实验讨论和心得二、实验内容和原理 四、实验方法和步骤 六、实验结果和分析一、实验目的和要求1、学习离子交换层析的基本原理2、学习离子交换层析分离蛋白质的基本方法和技术3、学习蔗糖酶活性检测的基本原理和方法二、实验内容和原理1、离子交换层析由于蔗糖酶的pI 偏酸性,所以在pH7.3 缓冲液的环境中，粗分离纯化样品蔗糖酶带负电荷，因此我们用阴离子交换剂可以先与蔗糖酶样品可逆交换吸附，然后通过用盐离子强度逐渐提高的洗脱液，使蔗糖酶和其他杂蛋白质的电荷被中和，与离子交换剂的亲和力降低，把不同的蛋白质按所带电荷的强弱逐一被洗脱下来，从而达到分离蔗糖酶的目的。

2、酶活力检测蔗糖酶是一种水解酶，它能蔗糖水解为等量的葡萄糖和果糖（还原糖）。

（50℃水解） 3.5－二硝基水杨酸与还原糖共热被还原成棕红色的氨基化合物，在一定范围内还原糖的量和反应液的颜色深度成正比。

（100℃显色）三、实验材料和主要仪器1、实验材料蔗糖酶粗分离纯化（溶解即为样品Ⅲ） 2、实验试剂⑴ DEAE-Sepharose Fast Flow⑵ 20mmol/L Tris-HCl pH7.3 缓冲液⑶ 20mmol/L Tris-HCl （1mol/L NaCl ）pH7.3缓冲液 ⑷ 0.2mol/L 乙酸缓冲液，pH4.5 ⑸ 5%蔗糖溶液⑹ 3，5-二硝基水杨酸试剂 3、实验仪器（1）高速冷冻离心机（2）层析柱（φ1.0×20㎝ ）(1支/组）（3）ÄKTA TM start（1套/组）（4）部分收集器及收集试管（4ml/管）（1台/组）（5）－20℃冰箱（保存样品用）（6）微量移液枪 200ul、1000ul（7）1.5ml离心管（留样品Ⅲ和样品Ⅳ用）（8）7ml离心管（留样品Ⅳ用）（9）恒温水浴（50℃、100℃）（10）试管、移液管、试管架等四、实验方法和步骤1、仪器连接（1）接通各仪器电源，将A,B泵头分别放置A，B两个溶液瓶中。

1、仪器连接
AB
开关
A、 50ml 20mmol/L Tris-HCl，pH7.3缓
冲液
B、 50ml 20mmol/L Tris-HCl，（0.5
mol/L NaCl） pH7.3缓冲液 1.接通各仪器电源，将A,B泵头分别放置
A，B两个溶液瓶中。注意B为含NaCl溶
液。1：缓冲液阀（Buffer valve） 2. 点2：击混电和脑器桌（面M上ixUenri）corn软件图标，打 开软3：件样。品选阀择（SySsatemmplCeovnatrlovel ，）点击OK ，进4：入泵操（作P界u面m。p）点击Connect 3. 在5：操压作力界传面感的器工（具P栏re，ss点u击reMannual Rusne。n出so现r）FlowRate 窗口，调节flowrate 为 61：ml清/m洗in，阀确（定Wa。sh valve）
Wash valve Collector
（1）连接混和器及样品阀，流速调整为1.0ml/min （2）切换至BufferB，直至Conductivity到达40mS/cm （3）连通BufferA，直至Conductivity接近2并平稳 ，准备装柱
3、装柱和平衡： （1）检查层析柱的两端接头，底端有膜的置于下方。 （2）程序暂停。将层析柱放入卡槽，上端接头与混合器（mixer) 相连，下端接头与样品阀（sample valve)相连。
实验器材与仪器
1、高速冷冻离心机 2、层析柱（φ1.0×20㎝ ）(1支/组） 3、ÄKTATM start（1套/组） 4、部分收集器及收集试管（4ml/管）（1台/组） 5、－20℃冰箱（保存样品用） 6、微量移液枪 200ul、1000ul 7、1.5ml离心管（留样品Ⅲ和样品Ⅳ用） 8、7ml离心管（留样品Ⅳ用） 9、恒温水浴（50℃、100℃） 10、试管、移液管、试管架等

蔗糖酶的提取及活力、含量和相对分子质量测定摘要：本学期共做了六次生化实验。

.第一次是提取及纯化蔗糖酶，以为后续实验提供样品。

实验主要目的是要求学生掌握高速离心机的使用。

实验共得到不同纯化度的三种提取液，标记为A、B、C。

将三种提取液分别放入冰箱保存，做为后续实验样品。

也因此做此实验时必须保证各个操作无误，及准确，以免影响后续实验的结果。

第二次是有关蔗糖酶的柱层析法，主要目的是要求同学掌握离子交换层析的原理及柱层析的操作技术及紫外吸收的分析方法。

此次实验通过柱层析及紫外吸收法得到2~3管的活力最大的分离液合并为分离液D，放入冰箱作为后续实验样品。

第三次实验为蔗糖酶的活力测定，目的为掌握酶的活力测定方法，了解各个酶的纯化情况。

利用分光度计测出各个样品的OD值，再对照葡萄糖的标准曲线来得出剩余葡萄糖的含量，从而获得各个酶的活力大小，了解各个酶的纯化情况。

并得出结论酶的纯化度越高，活力越小。

第四次实验为蔗糖酶蛋白质的含量测定，目的为掌握学习Folin-酚测定蛋白质含量的原理及方法，制备标准曲线测定未知样品中蛋白质含量。

同样利用与标准曲线对照来得到试样的蛋白质含量，并测出酶的比活力。

测量蛋白质的方法有多种，我们必须根据所做实验的具体选择合适的方法来测定蛋白质。

第五次的实验是微量凯氏定氮测总蛋白。

目的是要求同学掌握凯氏定氮法测定蛋白质含量的原理及方法。

本实验除利用了凯氏定氮法外还加上了酸式滴定法最后得出了毫克级别的总蛋白含量。

其结果与上一实验所测得的总蛋白质含量有所不同，正证明了不同的方法测量蛋白质造成的误差不同，致所得结果不同。

最后一次实验为SDS-PAGE测定蛋白质分子质量，目的为掌握SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和测定蛋白质分子量技术。

此实验操作复杂，需先制作凝胶再结果染色脱色，最后还要制作标准蛋白分子质量曲线图来进行试样对照。

最后得到蔗糖酶的分子量在5万左右及9万左右。

关键字：实验；提取液；比活；蛋白质；SDS-PAGE；OD正文：1，蔗糖酶的提取及提纯1.1，文献综述：蔗糖酶的分离利用的是细胞破壁法。

D E A E纤维素柱层析纯化酶蛋白实验集团文件版本号：（M928-T898-M248-WU2669-I2896-DQ586-M1988）(文献来自于丁香通（）)本实验目的是以柱层析的方法进一步纯化蔗糖酶蛋白，利用DEAE 纤维素树脂作为离子交换剂进行柱层析分级分离。

实验方法离子交换层析法实验方法原理利用DEAE纤维素树脂作为离子交换剂进行柱层析分级分离。

实验材料试剂、试剂盒仪器、耗材实验步骤1. ?离子交换剂的处理?称取1.5 克DEAE 纤维素( DE-23 ) 干粉, 加入0 . 5 mol/ LNaOH 溶液( 约50ml) , 轻轻搅拌, 浸泡至少0.5 小时( 不超过1 小时) , 用玻璃砂漏斗抽滤, 并用去离子水洗至近中性, 抽干后, 放入小烧杯中, 加50 ml 0.5 mol/ L HCl , 搅匀, 浸泡0.5 小时, 用去离子水洗至近中性, 再用0.5 mol/ L NaOH 重复处理一次, 用去离子水洗至近中性后, 抽干备用(因DEAE 纤维素昂贵, 用后务必回收)。

实际操作时, 通常纤维素是已浸泡过并回收的, 按“ 碱→酸” 的顺序洗即可, 因为酸洗后较容易用水洗至中性。

碱洗时因过滤困难, 可以先浮选除去细颗粒, 抽干后用0.5 mol/ L NaOH-0.5 mol/ L NaCl 溶液处理, 然后水洗至中性。

2. ?装柱与平衡?先将层析柱垂直装好, 在烧杯内用0.02 mol/ L, pH7.3 Tris-HCl 缓冲液洗纤维素几次, 用滴管吸取烧杯底部大颗粒的纤维素装柱, 然后用此缓冲液洗柱至流出液的电导率与缓冲液相同或接近时即可上样。

3. ?上样与洗脱?上样前先准备好梯度洗脱液, 本实验采用20 ml , 0.02 mol/ L,pH7.3 的Tris-HCl 缓冲液和20 ml 含0.2 mol/ L 浓度NaCl 的0.02 mol/ L, pH7.3 的Tris-HCl 缓冲液, 进行线性梯度洗脱。

实验三酵母蔗糖酶的部分纯化与纯度测定酶的纯化一、原理酵母中含有丰富的蔗糖酶(EC.3.2.1.26),本实验以酵母为原料,通过破碎细胞、热处理、乙醇沉淀、离子交换柱层析等步骤,提取蔗糖酶,并用聚丙稀酰胺凝胶电泳对其纯度进行测定。

离子交换层析法(ion-exchange chromatogramphy,简称IEC)中常用的阳离子交换剂有弱酸性的羧甲基纤维素(CM-纤维素),阴离子交换剂有弱碱性的二乙氨基乙基纤维素(DEAE-纤维素)。

蛋白质的混合物与纤维素离子交换剂的酸性基团或碱性基团相结合,结合力的大小取决于彼此之间相反电荷基团的静电引力,这又与溶液的pH值有关,因为pH值决定离子交换剂和蛋白质的解离程度。

盐类的存在可以降低离子交换剂的解离基团与蛋白质的相反电荷之间的静电引力,因此被的蛋白质的洗脱可通过改变pH值或离子强度 (或两者同时改变)来实现。

与离子交换剂结合力小的蛋白质首先从层析柱中被洗脱下来。

梯度洗脱是在洗脱过程中,使洗脱液的pH值(或两者同时)发生连续的变化,从而使吸附在柱上的各组分在不同的梯度下被洗脱下来。

二、实验材料、仪器和试剂1、实验材料干酵母2、仪器(1)高速离心机 (2)恒温水浴锅 (3)层析柱(1.0cm×16cm)(4)梯度混合器(5)部分收集器3、试剂(1) 95% 乙醇溶液 (2) DEAE-Sepharose Fast Flow (3) 1mol/L醋酸溶液(5) 0.05mol/L Tris-HCl缓冲液(pH值7.3)(6) 0.05mol/L Tris-HCl缓冲液(内含1mol/L NaCl溶液)pH值7.3三、操作步骤1、破碎细胞取15g 干酵母,加5~10g石英砂,置于预先冷却的研钵中,加30ml去离子水,研磨30min,在冰箱中冰冻约20~30min(研磨液面上刚出现冰结为宜),重复2次,加5ml去离子水,置离心管中,12000r/min离心15min,留0.5ml上清液为第一组分。

五、实验的主要仪器
1．冷冻离心机 2．研钵 3．恒温水浴箱 4．-20℃冰箱 5．梯度混合器 6．层析柱 (1×20cm)
六、实验操作流程
干酵母粉→加缓冲液研磨→离心→热处理→酒 精沉淀→离心→上清夜→上DEAE—Sepharose FF 柱→层析→活力检测
七、实验关键步骤：（以下各步骤除热处

Hale Waihona Puke 离子交换层析是常用的层析方法之一。它是在以离子 交换剂为固定相，液体为流动相的系统中进行的。离 子交换剂与水溶液中离子或离子化合物的反应主要以 离子交换方式进行，或者借助离子交换剂上电荷基团 对溶液中离子或离子化合物的吸附作用进行。这些过 程都是可逆的。在某一pH值的溶液中，不同的蛋白质 所带的电荷存在差异，因而与离子交换剂的亲和力就 有区别。当洗脱液的pH改变或者盐的离子强度逐渐提 高时，使某一种蛋白质的电荷被中和，与离子交换剂 的亲和力降低，不同的蛋白质按所带电荷的强弱逐一 被洗脱下来，达到分离的目的。

DEAE-Sepharose F F柱预先用20mmol/L Tris-HCl, pH7.3 buff 平衡(约30ml流出液即可)，以流出液pH 与 buff 一致为准。上样后，用20 m mol/L Tris-HCl, pH7.3 buff 进行NaCl梯度洗脱(NaCl 为0.5mol/L),层 析柱连上梯度混合器，混合器中分别为50ml、 20mmol/L Tris-HCl, pH7.3缓冲液和50ml 20mmol/L Tris-HCl，pH7.3缓冲液，其中含0.5mol/L NaCl。




酶活力检测：
取试管若干支编号，各加入0.5mL 5%蔗糖 （pH4.6），每隔一管取100uL收集液，按先后顺 序分别加入上述含0.5mL 5%的蔗糖的试管中混匀， 置50℃水浴10min。再加入0.5mL 3,5-二硝基水杨 酸，于沸水浴中煮沸5min，用自来水冷却，直接 目测。即可确定酶活力高峰范围。

0.11 4
2.35 1 1.98 8
0.36 3
1.03 0 0.86 7
0.16 3
0.67 7 0.10 3
0.57 4
（6）脲对蔗糖酶的抑制作用 取做好编号的试管，按下表进行实验。 管号 0.5mol/L 蔗糖/μl 蔗糖酶/μl 乙酸缓冲液 pH5.0/μl 4mol/L 脲/μl
H 2O /μl
2 0.2 0.2 0.6 40 1
3 0.2 0.2 0.6 50 3
4 0.2 0.2 0.6 50 6
5 0.2 0.2 0.6 60 10
6 0.2 0.2 0.6 60 15
7 0.2 0.2 0.6 70 20
8 0.2 0.2 0.6 70 30
9 0.2 0.2 0.6 80 40
10 0.2 0.2 0.6 80 50
8 0.8 16 0.2 2 1.33 8
9 0.9 18 0.1 2 1.48 2
10 1.0 20 0.0 2 1.60 8
水杨酸试剂/ml
沸水浴 5min，流水冷却，定容至 15ml
A540
0
(2)反应时间的影响 取做好编号的试管，按下表进行实验。 管号 0.2mol/L 蔗糖/ml 乙酸缓冲液 pH5.0/ml
H 2O /μl
1 0 600 200 200 1.0 2.0
2 20 580 200 200 1.0 2.0
3 30 570 200 200 1.0 2.0
4 40 560 200 200 1.0 2.0
5 60 540 200 200 1.0 2.0
6 80 520 200 200 1.0 2.0
H 2O /μl
0.05