常见生理指标的测定方法

小黑豆相关生理指标测定1.表型变化：鲜重、株高、主根长和叶面积鲜重：取处理好的植株，擦干根和叶表面水分，测量整株植物的重量，每个测6个重复。

株高：取处理好的植株，测量从根和茎分隔处到植株最高点的高度，记录，每个测6个重复。

主根长：取处理好的植株，测量从根和茎分隔处到主根最远点长度，记录，每个测6个重复。

叶面积：取处理好的植株，选择第二节段的叶片，测量叶面积，叶面积测量方法是测每个叶片最宽处长度作为叶的长，测叶片最窄处长度作为叶的宽，叶片长和宽的乘积即为叶表面积。

每个测6个重复。

2.总蛋白、可溶性糖、丙二醛（MDA）和H2O2含量测定样品处理：取0.5g样品（叶片要去除叶脉、根要先用清水清洗干净），速在液氮中冻存，在遇冷的研钵中加液氮研磨，然后加入1.5ml的Tris-HCl（pH7.4）抽提，将抽提液转移到2ml的EP管中，于4℃，12000rpm离心15min，取上清，保存在-20℃下，上清液可用于总蛋白、丙二醛（MDA）、可溶性糖和H2O2含量测定。

总蛋白测定（Bradford法）：样品反应体系（800ul H2O+200ul Bradford+5ul 样品），空白对照为（800ul H2O+200ul Bradford）。

测定后带入标准曲线Y=32.549X-0.224(Y代表蛋白含量，X代表OD595)，计算得出蛋白含量。

可溶性糖测定：样品反应体系（1ml蒽酮+180ul ddH2O+20ul样品提取液）；空白对照（1ml蒽酮+180ul ddH2O），测定OD625后带入标准曲线：Y=0.0345X+0.0204(Y代表OD625，X代表可溶性糖含量（ug）)蒽酮配方：称取100mg蒽酮溶于100ml稀硫酸（76ml浓硫酸+30mlH2O）.注意：浓硫酸加入水中时，一点一点递加，小心溅出受伤。

丙二醛（MDA）测定：在酸性和高温条件下，丙二醛可与硫代巴比妥（TBA）反应生成红棕色的3,5,5-三甲基恶唑2,4-二酮，在532nm处有最大吸收波长，但该反应受可溶性糖的极大干扰，糖与TBA的反应产物在532nm处也有吸收，但其最大吸收波长在450nm处。

植物生理生化指标测定植物生理生化指标测定是研究植物生长发育和适应环境的重要手段之一、通过测定植物的生理生化指标，可以了解植物的代谢活动、光合作用强度、水分状况、营养状况等，从而为植物生长调控、抗逆性研究提供依据。

下面将从光合作用测定、水分状况测定和营养状况测定三个方面对植物生理生化指标测定进行详细介绍。

光合作用是植物生长发育的重要过程之一，也是植物蓄积养分和能量的主要途径。

常用的光合作用测定指标有净光合速率、光饱和点、光补偿点和光抑制。

净光合速率是指单位时间内单位叶面积净光合产物的量，可以通过测定二氧化碳吸收量和氧气释放量来计算。

光饱和点是指植物的净光合速率达到最大值时的光强度，可以通过测定不同光强下的净光合速率来得出。

光补偿点是指净光合速率和呼吸速率相等的光强度，可以通过测定不同光强下的净光合速率和呼吸速率来确定。

光抑制是指过高或过低的光强度对植物光合作用的影响，可以通过测定光强对净光合速率的影响来评价。

水分状况是植物生理生化指标测定的重要方面之一，也是植物生长发育和适应环境的关键因素之一、常用的水分状况测定指标有相对含水量、蒸腾速率和水分利用效率。

相对含水量是指植物组织中的相对含水量与干重的比值，可以通过称量植物组织的湿重和干重来计算。

蒸腾速率是指单位时间内单位叶面积水分蒸腾的量，可以通过测定植物的蒸腾量和叶面积来计算。

水分利用效率是指植物单位干物质产量所需要的水分量，可以通过测定植物的干物质产量和水分消耗量来计算。

营养状况是植物生理生化指标测定的另一个重要方面，也是植物生长发育和代谢活动的基础。

常用的营养状况测定指标有叶绿素含量、叶绿素荧光参数和土壤养分含量。

叶绿素含量是评价植物叶绿素合成和叶绿素降解的指标之一，可以通过植物叶片中叶绿素的提取和测定来得出。

叶绿素荧光参数是评价光能利用效率和光能转化效率的重要指标之一，可以通过叶绿素荧光仪来测定。

土壤养分含量是评价土壤中不同营养元素含量的指标之一，可以通过土壤样品的提取和测定来得出。

1丙二醛〔MDA〕含量的测定丙二醛在酸性和高温的条件下，可以和硫代巴比妥酸〔TBA〕反响生成红棕色的三甲川，在532nm处有最大光吸收。

植物组织中可溶性糖与TBA的显色反响产物在450nm和532nm处也有吸收。

测定时要排除可溶性糖的干扰，因此分别测定532nm和450nm处的吸光值，直接求得植物样品提取液中MDA的浓度；MDA含量采用硫代巴比妥酸法测定。

计算公式如下:C(µmol.L-1)=6.45OD532-0.56OD450进一步算出每克样品鲜重中丙二醛的含量〔µmolg-1FW〕。

试剂：10%三氯乙酸〔TCA〕：10g三氯乙酸定容于100ml0.6%硫代巴比妥酸：0.6g用10%三氯乙酸TCA定容于100ml试验步骤:〔1〕取植物材料用液氮迅速研磨成粉，取0.2g左右材料，放入5ml离心管内。

〔2〕参加5ml 10%的三氯乙酸，提取30min后，10000r/min离心15min。

〔3〕取上清液2ml，参加2ml 0.6%TBA，混匀，在100℃水浴中煮15min，冷却，冷却后再测量。

〔4〕分别测定532nm和450nm处的吸光值。

以2ml〔加TBA,水〕水代替提取液作为对照管。

2蛋白质含量测定----考马斯亮蓝G-250法实验原理：考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，当它与蛋白质结合后变为青色，前者最大光吸收在465nm，后者在595nm。

在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质一色素结合物在595nm波长下的光吸收与蛋白质含量成正比，故可用于蛋白质的定量测定。

仪器和试剂：牛血清白蛋白500微克/毫升：10ｍｇ蒸馏水定溶至100ｍｌ考马斯亮蓝G-250：10ｍｇ溶于5ml 90％乙醇中，参加10ml85％的磷酸，用蒸馏水定溶于100ｍｌ操作步骤：1.标准曲线的制作：取4支试管，按下表配制不同浓度的牛血清白蛋白溶液各1毫升,参加5毫升考马斯亮蓝G-250试剂，摇匀，放置2分钟后用10毫米光径的比色杯在595nm 下比色。

实验一植物组织中可溶性蛋白质含量的测定考马斯亮蓝G-250染色法[原理] 考马斯亮蓝G-250(Coomassie brilliant blue G-250)测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。

该染料在游离状态下呈红色，在稀酸溶液中当它与蛋白质的疏水区结合后变为青色，前者最大光吸收在465nm，后者在595nm。

在一定蛋白质浓度范围内(1～1000μg)，蛋白质与色素结合物在595nm波长下的吸光度与蛋白质含量成正比，故可用于蛋白质的定量测定。

考马斯亮蓝G-250与蛋白质结合反应十分迅速，2min左右即达到平衡。

其结合物在室温下1h内保持稳定。

此法灵敏度高(比斐林-酚法还高4倍)，易于操作，干扰物质少，是一种比较好的定量法。

其缺点是在蛋白质含量很高时线性偏低，且不同来源蛋白质与色素结合状况有一定差异。

[材料、仪器设备及试剂](一)材料各种花草茶(二)仪器设备 722分光光度计，烧杯，量瓶，移液管，具塞刻度试管等。

(三)试剂(1)标准蛋白质溶液：100μg／mL牛血清白蛋白：称取牛血清蛋白25mg，加水溶解并定容至100mL，吸取上述溶液40mL，用蒸馏水稀释至100mL即可。

(2)考马斯亮蓝G-250溶液：称取100mg考马斯亮蓝G-250，溶于50mL 90％乙醇中，加入100mL 85％(W／V)的磷酸，再用蒸馏水定容到1L，贮于棕色瓶中。

常温下可保存一个月。

[实验步骤](一)标准曲线的绘制取6文具塞试管，按表2-29-1加入试剂(0～100μg／mL的标准蛋白)。

混合均匀后，向各管中加入5mL考马斯亮蓝G-250溶液，摇匀，并放置5min左右，用1cm光径比色皿在595nm下比色测定吸光度。

以蛋白质浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制标准曲线。

(二)样品测定(1)样品提取。

称取样品0.1g，用5ml蒸馏水或者缓冲液研磨成匀浆后，3000转离心10分钟(2)吸取样品提取液1．0mI，放人具塞试管中(每个样品重复2次)，加入5mL考马斯亮蓝G-250溶液，充分混合，放置2min后在595nm下比色，测定吸光度，并通过标准曲线查得蛋白质含量。