微生物多样性研究进展
一、微生物平板纯培养法
概述
微生物平板纯培养法是用于估计微生物多样性的传统法，曾被认为是监测特殊微生物群变化的非常有效的方法。
根据目标微生物选择相应的培养基，然后通过各种微生物的生理生化特征及外观形态等方面进行分析鉴定。但需从琼脂平板上将菌落分离出来，并对分离菌进行鉴定。由所得到的分类组或分类群的分布情况可了解群落的结构。这种方法对于衡量小群体多样性方面不失为一种快速的方法。
优点
微生物平板纯培养法在分离具有一定功能的特殊目标物种时是非常有用的，利用这种方法已获得许多很有应用价值的微生物种类。许多微生物资源的开发与利用还是要依赖传统的平板培养技术。针对难培养微生物和不可培养微生物，当前，部分学者致力于提高微生物在平板上的培养能力。
局限性
由于微生物培养方法人为限定了一些培养条件，存在许多不足，无法全面反映微生物生长的自然条件，常常造成某些微生物的富集生长，而另一些微生物缺失。只能反映极少数微生物（1%左右）的信息，所测结果误差较大，埋没了大量极有应用价值的微生物资源。因此这种传统的研究方法只能作为一种辅助手段，并且只有结合现代生物技术来才能较为客观而全面的反映微生物群落结构的真实信息。
培养条件的优化
Kaebedein认为实验室培养条件与微生物生活的自然环境相差过远，特别是培养基成分的前后变化是影响微生物实验室培养的一个关键因素。它以海洋微生物为样品，设计了原位培养技术。
二、磷脂脂肪酸方法（PLFA)
概述
磷脂是所有生活细胞的细胞膜的基本组分。PLFA是磷脂的组分。具有结构多样性和高生物学特异性，是特有效的生物标记物，可用于了解微生物群落结构。
总PLFA谱中某些特征脂肪酸分别对细菌、真菌和放线菌是特异的，且在大多数情况下PLFA的某专一类型在某一环境微生物分类群中占优势。
对微生物学者来说，仅区分细菌和真菌是不够的。因为这样忽视了许多微生物种类和功能性亚种。应用磷脂类化合物的脂肪酸组成来研究微生物群落结构多样性
是近几年来发展的一种新方法。磷脂类化合物只存在于所有生物细胞膜中，一旦生物细胞死亡，其中的磷脂类化合物马上消失，生物中的磷脂类化合物能显示出快速转换率，而且生物可以把相对稳定的磷脂类化合物作为它们的生物量，磷脂类化合物的这些特性和磷脂类化合物与生物的密切关系，可用作土壤中微生物群落结构指纹分析。土壤微生物群落结构的研究提供了一个较简便、准确的方法。至今，已经积累了大量关于微生物脂类的脂肪酸组成的数据。
PLFA方法是一种快速、可靠而可重现的分析环境微生物群落结构的方法，可用于表征在数量上占优势的环境微生物群落，包括不可培养微生物。该方法最适合用作总微生物群落分析，而不是专一的微生物种类的研究。PLFA的组成和浓度受环境微生物生长条件和生理状态的影响。另外，包括PLFA在内的所有的环境生物标记都存在可萃取性和未知的稳定性问题。土壤的生物标记稳定性主要取决于与降解过程有直接关系的温度、湿度和其他条件。
磷脂脂肪酸 ( PLFA) 方法通过提取和分离指示性PLFA( 活体细胞膜的重要成分，恒定出现在同一类环境微生物中) ，测定他们的含量，定量反映可繁殖或具有潜在繁殖力的不同类群环境微生物生物量和总生物量。微生物的群落结构是衡量环境微生物变化的一个重要指标，在土壤环境中微生物总量不变时，很难判断微生物群落结构的变化情况。PLFA方法能用于这种情况下的微生物群落结构的检测，但是这种检测只是针对在数量上占优势的土壤微生物群落。
局限性
PLFA方法适合跟踪研究微生物群落的动态变化，能够快速有效的从环境样品种提取大部分脂肪酸，但是也有其局限性。
1、它不能从种的水平上鉴定微生物，只能鉴定到属；
2、这种方法强烈的依赖于标记脂肪酸，标记脂肪酸变化导致错误的群落变化估计。因此操作过程需要十分谨慎，防止人为因素的干扰；
3、细菌和真菌在不同的生长时期以及环境压力下的脂肪酸含量有所变化，给监测带来困难。
三、Biolog微平板分析
概述
Biolog 法是美国 BIOLOG公司于1989年开发成功的一种快速、简单的新型微生物群落功能多样性鉴定方法。
微生物物种多样性与物种的丰富度及均匀度相关，群落内组成的物种越丰富、均匀度越大，则该群落的多样性越高。群落多样性和均匀度是间接反映群落结构和功能的重要特征，通过BIOLOG ECO微平板测定，可以反映群落的稳定性和群落的组成结构，目前国BIOLOG微生物自动鉴定系统大多是应用在环境微生物群落土壤微生物群落、菌种鉴定研究中。
BIOLOG ECO微平板通过微生物对单一碳源的利用来了解其微生物的动态，与传统的平板计数法相比，这种方法比单纯了解微生物总数要行之有效。微生物对碳源的利用能力则是微生物生长情况的主要指标。因此BIOLOG ECO微平板可以用于估价
微生物群落代谢多样性和功能多样性的研究。
优点：
1、无需分离培养纯种微生物，即可获得有关微生物群落总体活性与代谢功能的信息。
2、最大限度地保留微生物群落原来的代谢特征。
3、灵敏度高，分辨力强，数据的读取与记录可以由计算机结合数学统计分析方法辅助完成，可以较为直观、快捷的反映环境微生物生物多样性，相比传统的平板计数法能更详尽的反映微生态的变化与波动情况，有利于对微生态更为详尽的研究。
局限性：
1、它所得出的结构和功能方面的信息是基于在 BIOLOG GN系统内生长的微生物，主要是革兰氏阴性菌。
2、该方法对快速生长和适合在实验条件下生长的小部分群落成员有强烈的选择性，被测试的底物不能准确地代表出现于自然生态系统中的底物类型。
3、Biolog反应特征只能粗略地代表实际环境微生物群体底物利用的动力学特征。
4、由于培养环境如湿度、渗透压、pH值等方面的改变都可能引起微生物对碳底物实际利用能力的改变而造成一定的误差。
5、目前所拥有的标准数据库还不完善，有些种类还不能被准确鉴定。
四、RFLP技术
概述
RFLP是指16S rRNA基因的限制性片段长度多态性，它是一种利用限制性酶切片段长度差异来检测生物个体之间差异的分子标记技术。
原理：通过PCR扩增DNA，扩增产物经限制性内切酶消化，消化后的样品进行琼脂糖凝胶或丙烯酰胺凝胶电泳分析，用溴化乙锭或硝酸盐染色，有着核酸序列差异的不同种群微生物DNA其酶切片段的数量和大小不同，电泳图谱呈现多态性。
优点：
测定的序列数据库具有直接的参考意义
其测定的结果要比DGGE或者SSCP的结果更可靠
缺点：
1、作图比较费时，难以分析大量的DNA样品；
2、由于图谱的谱带比扩增DNA 的谱带要多，会过高估计群落成员数目。
3、产生的长多态性片段，含较多的等位基因，适用于鉴别种间的不同，当近缘种微生物在扩增片段靠近荧光标记端的切点时，该技术无法区分出这些近缘种。
T-RFLP技术
T-RFLP是指末端限制性片段长度多态性分析，与RFLP相似，只是在PCR引物末端标记荧光。扩增基因由限制性酶降解，随后在自动DNA测序仪上检测，仅有那些荧光
