54. 病毒宏基因组学

病毒学检验知到章节测试答案智慧树2023年最新山东第一医科大学绪论单元测试1.病毒是一种专性细胞内寄生的非细胞型微生物。

（）参考答案:对2.病毒的种类较多，其中可以感染细菌的病毒我们称之为（）。

参考答案:噬菌体3.病毒学检验的一般原则包括（）。

参考答案:质量控制原则;足够的硬件设施;生物安全原则;标本的采集原则4.下列属于病毒直接检测方法的是（）。

参考答案:细胞病理学检测;病毒蛋白检测;电子显微镜技术;病毒核酸检测5.下列选项中，属于病毒学检验应用范围的是（）。

参考答案:病毒性传染病的的检验与检疫;新发病毒性疾病的病原和防治研究;病毒感染和病毒性疾病的诊断;病毒变异的研究6.新发传染病多是动物源性病毒性传染病。

（）参考答案:对7.病毒的变异类型包括遗传漂变（genetic drift）和遗传转移（genetic shift）两种类型。

（）参考答案:对8.下列因素中能够影响新发传染病发生与传播的有（）。

参考答案:病毒变异;国际旅行和商务;气候变化;公共卫生投入不足9.使用分子生物学检测新病毒核算室，需要用到非序列依赖性的方法，下列属于上述方法的是（）。

参考答案:病毒宏基因组学;随机引物PCR;简并PCR;非序列依赖性单引物扩增技术第一章测试1.在细胞培养系统中，培养一代细胞需要经过四个阶段，下列不属于这这四个阶段的是（）参考答案:游离期2.细胞在冻存时要掌握的原则是（）参考答案:慢冻快融3.常作为细胞培养液的指示剂是（）参考答案:0.4％的酚红溶液4.因为细胞培养液的营养丰富，更易于发生微生物污染，如细菌、真菌、支原体等，加（）可控制支原体的污染.参考答案:卡那霉素5.实验室器材的清洗过程正确的是（）参考答案:浸泡→刷洗→酸浸→冲洗6.从组织分离的原代细胞是一群对原有组织有较好代表性的细胞，但细胞间存在异质性，即差异性。

（）参考答案:对7.用胰蛋白酶做消化液时，浓度越大作用越强，对细胞的培养越有利。

宏基因组学的PPT宏基因组学是通过收集宿主的粪便里的微生物、以及培养皿中的微生物，利用专业的宏基因组技术进行分析。

它能够获得宏基因组信息和相关序列，从而为疾病相关症状的诊断和治疗提供依据。

随着人类健康问题愈演愈烈，为了降低成本，并能通过生物技术进行治疗，研究人员开发了宏基因组学技术。

其通过收集环境中存在的特定细菌，来分析它们在土壤、水源或大气中的分布，以了解它们在整个生态系统中所扮演的角色。

宏基因组学（宏测序法）是一种对人体和环境进行科学评价（包括微生物菌群与疾病之间关系）的工具。

它是一种高通量方法来鉴定微生物群落或疾病（包括寄生虫病等),并用于进行疾病和环境健康状态跟踪和诊断。

虽然宏基因组学可以通过分析病原体来诊断疾病——但目前还没有针对特定微生物群落或某一种病原体开展研究。

1.目的宏基因组学通过收集宿主的粪便和排泄物，以及在培养皿或土壤中的特定微生物群落来检测微生物菌群。

它们在宿主的整个生命周期中都是重要的，并且是许多宿主健康相关问题发生和治疗的潜在因素之一。

通过对宿主宏基因组学数据进行统计分析，可以更好地了解宿主微生物多样性与环境健康状况之间的关系；进而有助于了解宿主肠道微生物及其他微生物群落对人体健康所发挥作用；同时也有助于了解特定微生物群落与其健康状况之间的关系。

此外，还可以通过研究宿主体内微生物种群之间互相作用机制，从而更好地理解宿主微生物群落结构及疾病发生背后原因。

这为人类健康提供了新的见解。

在环境方面，宏基因组学可以从宿主微生物群落中发现与生态系统结构相关、通过检测宿主体内微生物群落来揭示生命现象本质和机制；还可以通过感染或死亡微生物群落以及与宿主相互交互作用规律来揭示微生物群落与疾病发生之间关系：同时宏基因组学还可以为相关研究人员提供研究资源、为治疗提供科学依据。

此外，宏基因组学还能为环境健康状态跟踪和诊断提供参考——为了解环境健康状态和健康风险提供科学依据。

2.方法原理在了解宿主肠道中的微生物群落的组成之后，宏基因组学可以分析宿主的粪便样本。

宏基因组学研究进展在生物学领域，宏基因组学作为一门新兴的前沿学科，为我们揭示了大量未知的生物世界奥秘。

本文将通过介绍宏基因组学的基本概念、研究现状、研究方法、研究成果及其局限性，带领大家全面了解宏基因组学的研究进展。

宏基因组学是一门研究存在于生物群落中的基因及其多样性的学科。

它通过运用高通量测序、生物信息学和系统生物学等技术手段，对整个生态系统中的微生物基因组进行深入研究，旨在揭示微生物群落中隐藏的生物多样性和生态功能。

随着16S rRNA基因测序技术的发展，宏基因组学研究取得了突破性进展。

尤其是近几年，宏基因组学研究在环境微生物多样性、病原菌感染机制以及生物医药等领域表现出巨大的应用前景。

发展趋势表明，宏基因组学将进一步推动生命科学领域的发展，为人类解决一系列生态和健康问题提供有力支持。

在宏基因组学研究中，实验设计、数据分析和模型构建等方面都至关重要。

实验设计需要考虑样品的采集、处理和文库构建等环节；数据分析则需借助一系列生物信息学技术和算法，对海量数据进行有效挖掘和精准解析；模型构建则需要以数据为基础，构建能准确描述微生物群落结构和功能的数学模型。

宏基因组学研究已经取得了一系列令人瞩目的成果。

例如，通过研究海洋微生物群落，科学家发现了许多新的微生物种类和基因，揭示了海洋生态系统的运行机制；同时，宏基因组学研究还在病原菌感染、生物医药等领域表现出极大的应用潜力，为解决一些重大疾病提供了新的思路和方法。

这些成果不仅丰富了我们对生物世界多样性的认识，也为我们提供了大量宝贵的生物资源。

然而，尽管宏基因组学研究已经取得了显著的成果，但仍存在一定的局限性。

例如，采样过程中可能会受到污染，导致结果出现偏差；另外，数据分析过程中可能存在技术难点，如噪声数据的处理、稀有物种的检测等。

此外，宏基因组学研究还面临着理论和方法上的挑战，例如如何构建更为精准的微生物群落模型，如何将宏基因组学研究成果应用于实践等等。

总之，宏基因组学作为一门新兴的生物学分支，为我们揭示了大量未知的生物世界奥秘。

宏基因组及其应用学习笔记吕涛15010906一、宏基因组及宏基因组学1.概念宏基因组( Metagenome)（也称微生物环境基因组Microbial EnvironmentalGenome, 或元基因组）是由Handelsman 等1998 年提出的新名词，其定义为“the genomes of the total microbiota found in nature” , 即环境中全部微小生物遗传物质的总和。

它包含了可培养的和未可培养的微生物的基因，目前主要指环境样品中的细菌和真菌的基因组总和。

2.宏基因组学宏基因组( Metagenome)（也称微生物环境基因组Microbial EnvironmentalGenome, 或元基因组）是由Handelsman 等1998 年提出的新名词，其定义为“the genomes of the total microbiota found in nature” , 即环境中全部微小生物遗传物质的总和。

它包含了可培养的和未可培养的微生物的基因，目前主要指环境样品中的细菌和真菌的基因组总和。

3.发展历程环境基因组学——微生物基因组学——宏基因组学——人类基因组学人类基因组学：把人体内所有微生物菌群基因组的总和称为“人体宏基因组”(humanmetagenome)。

人类宏基因组学(human metagenomics)研究人体宏基因组结构和功能、相互之间关系、作用规律和与疾病关系的学科。

它不仅要把总体基因组序列信息都测定出来，而且还要研究与人体发育和健康有关的基因功能。

人类宏基因组计划目标是：把人体内共生菌群的基因组序列信息都测定出来，而且要研究与人体发育和健康有关的基因功能。

4.研究步骤5.研究方法二、宏基因组学的应用1.水体宏基因组学●海表层水样为研究海洋生命的代谢潜力和海洋生态学提供了前所未有的原始素材；海洋蕴藏着巨大的生物多样性和复杂性，宏基因组学将极大地促进人们对他的认识。

病毒宏基因组学方法优缺点及意义病毒宏基因组学方法优缺点及意义随着时代的发展和生物科学技术的进步，新兴的病毒宏基因组学为解决这些问题提供了契机，以下是一篇关于病毒宏基因组学探究的论文范文，供大家阅读参考。

病毒个体微小，多数病毒直径在100nm(20~200nm)，较大的病毒直径300~450nm,较小仅为18~22nm,结构简单，不能独立复制需要依赖于宿主细胞复制繁殖，被许多生物学家认为是处于生命和非生命交叉区域的存在物。

据估计目前对病毒的发掘还不到1%[1],对病毒的研究具有广阔的前景和现实意义。

病毒独特的结构和特性给病毒的研究和鉴别带来许多困难，主要体现在两个方面：第一，病毒没有专门的宿主细胞系，60%以上的病毒无法成功的进行离体培养[2]或在培养中不能表达致病性;第二，病毒基因本身变异率高，通过与宿主间的相互作用进化，增加核酸多样性，产生新病毒，导致宿主范围扩大、跨物种传播[3].对细菌的研究可以通过保守的16sRNA的分析来定位分类信息、进化关系和种群多样性等。

对于真菌有18sRNA及ITS序列。

然而病毒不像细菌真菌，没有固定保守的进化标记基因。

所以一些传统研究方法的应用受到限制，不能完全满足病毒研究的需要。

如电镜观察病毒的灵敏性不高，细胞培养病毒可能观察不到细胞病变，血清学反应中不但难以获得高价抗体而且容易出现交叉反应导致错误结果，传统PCR方法对未知序列及高变异的病毒研究难以发挥作用。

加之近年来病毒流行病的频繁发生及其可怕的传染性，对人类及动植物的健康产生严重威胁，如HIV病毒、SARS病毒、禽流感病毒和在西非等地肆虐的埃博拉病毒[4]等，给人们造成了巨大的恐慌和经济损失。

因此，对病毒基因组的研究、致病源的探索、病毒在生物体和环境中如何存在及传播、病毒病防治的研究已迫在眉睫。

随着时代的发展和生物科学技术的进步，新兴的病毒宏基因组学为解决这些问题提供了契机，宏基因组学(Metagenomics)的概念是1998年由Handelsman[5]首次提出，对特定环境中基因组的总和进行研究，包括培养的和未培养的.微生物。

病毒宏基因组学在动物病毒研究中的应用及研究进展作者：廖勤丰李文娟向帮全来源：《湖北畜牧兽医》2014年第04期摘要：近年来，新发人畜共患病呈现逐年递增的趋势，人类想要征服新发人畜共患病，就必须提前发掘潜在的新的致病性病原，并针对新病原进行基因组分析、流行病学调查、致病机制及疫苗开发等方面的研究。

病毒宏基因组学是在宏基因组学基础上发展起来研究特定环境中病毒的新兴技术，该技术结合深度测序技术（第二代、第三代测序技术）已经在人类、动物、特定环境中挖掘出大量的新病毒，该技术不依赖于病毒培养及病毒序列，在国内外被广泛应用于新发人畜共患病病原的挖掘与临床诊断。

就病毒宏基因组学在动物病毒研究中的应用及研究进展进行了介绍。

关键词：病毒宏基因组学；动物病毒；应用；进展中图分类号：S852.65；Q78文献标识码：B文章编号：1007-273X（2014）04-0076-03病毒是引发人畜共患病的主要病原体之一，伴随环境、生态和人类行为等各方面因素的变化，新发人畜共患病也呈现逐年递增的趋势，它们极大地威胁着人类和动物的健康和生命，并给畜牧业和农业的健康发展以及自然界生态链的平衡带来危害及灾难。

然而，许多新发人畜共患病的病原最初往往是未知的，如1986年的牛海绵状脑病[1]、1999年的尼帕病毒[2]、2003年的SARS冠状病毒[3]、1997至今不断变异的高致病性禽流感H5和H[4-7]7、2009年的甲型H1N[8]1、2010年的新型布尼亚病毒[9]，它们都经历了一个从未知到己知的探索过程。

为此，及早地发现，鉴别未知的或新出现的病原，是有效预防和控制传染病的先决条件之一。

传统的诊断技术已不能满足提前预警或快速诊断新发人畜共患病的需求。

近年来，病毒宏基因组学[10，11]的出现和兴起，为人类诊断新发人畜共患病和探索潜在的病原提供了巨大的帮助。

1病毒宏基因组学简介宏基因组学或元基因组（metagenomics），其定义为“The collective genomes of soil microflora”。

畜牧兽医学报 2023,54(7):2932-2941A c t a V e t e r i n a r i a e t Z o o t e c h n i c a S i n i c ad o i :10.11843/j.i s s n .0366-6964.2023.07.024开放科学(资源服务)标识码(O S I D ):宏基因组学技术分析山羊瘤胃病毒的多样性吴祎程1,2,冉 涛3,4*,周传社1,2*,谭支良1,2(1.中国科学院亚热带农业生态研究所亚热带农业生态过程重点实验室畜禽养殖污染控制与资源化技术国家工程实验室湖南省动物营养生理与代谢过程重点实验室农业部中南动物营养与饲料科学观测实验站,长沙410125;2.中国科学院大学,北京100049;3.兰州大学草地农业科技学院,兰州730020;4.兰州大学草种创新与草地农业生态系统全国重点实验室,兰州730020)摘 要:反刍家畜瘤胃内微生物丰富多样,病毒(主要是噬菌体)亦是其重要组成部分㊂瘤胃内所有的病毒可统称为瘤胃病毒组(r u m i n a l v i r o m e ),可以利用宏基因组学(m e t a ge n o m i c s )技术进行研究㊂解析山羊瘤胃病毒组的组分及功能有望更全面地了解其在瘤胃微生态区系中的地位和作用㊂为使测序结果能覆盖瘤胃中绝大部分病毒群落,不仅在样品的预处理阶段要尽量避免病毒样颗粒的损失,而且要保证瘤胃病毒组总D N A 的提取质量和产量均满足宏基因组测序的要求㊂本研究比较了制备瘤胃液病毒组分的4种流程:(P 1)离心+稀释㊁(P 2)离心+稀释+过滤㊁(P 3)离心+稀释+过滤+聚乙二醇沉淀㊁(P 4)离心+稀释+过滤+聚乙二醇沉淀+氯仿处理㊂提取核酸后采用I l l u m i n a N o v a s e q 6000平台对瘤胃病毒基因组D N A 进行测序,并对病毒群体结构进行分析比较,以筛选出瘤胃病毒组样品制备的最优流程㊂结果表明,聚乙二醇沉淀有助于病毒核酸提取,而氯仿处理过度影响病毒组分产量;山羊瘤胃内病毒群落主要是尾状病毒目的长尾病毒科㊁肌尾病毒科和短尾病毒科噬菌体㊂研究结果为深入分析噬菌体在山羊瘤胃微生态区系中的作用奠定了基础㊂关键词:瘤胃病毒;病毒宏基因组学;高通量测序技术;D N A 提取;多样性中图分类号:S 852.65 文献标志码:A 文章编号:0366-6964(2023)07-2932-10收稿日期:2022-08-30基金项目:国家自然科学基金(U 20A 2057);兰州大学 双一流 建设人才项目(561120213)作者简介:吴祎程(1997-),女,湖北武汉人,硕士生,主要从事瘤胃环境病毒提取及功能研究,E -m a i l :w u y i c h e n g19@m a i l s .u c a s .a c .c n ,T e l :0731-*********通信作者:周传社,主要从事反刍家畜蛋白质营养调控与农牧复合生态系统研究,E -m a i l :z c s @i s a .a c .c n ;冉 涛,主要从事传统动物营养学㊁分子营养学及胃肠道微生物组学研究,E -m a i l :r a n t @l z u .e d u .c nE v a l u a t i o n o f t h e V i r a l C o m m u n i t y C o m po s i t i o n i n G o a t R u m e n F l u i d ,B a s e d o n M e t a g e n o m i c A n a l ys i s WU Y i c h e n g 1,2,R A N T a o 3,4*,Z HO U C h u a n s h e 1,2*,T A N Z h i l i a n g1,2(1.S o u t h C e n t r a l E x p e r i m e n t a l S t a t i o n o f A n i m a l N u t r i t i o n a n d F e e d S c i e n c e i n t h e M i n i s t r y o fA g r i c u l t u r e ,H u n a n P r o v i n c i a l K e y L a b o r a t o r y o f A n i m a l N u t r i t i o n a l P h y s i o l o g y an d M e t a b o l i c P r o c e s s ,N a t i o n a l E n g i n e e r i n g L a b o r a t o r y fo r P o l l u t i o n C o n t r o l a n d W a s t e U t i l i z a t i o n i n L i v e s t o c k a n d P o u l t r y P r o d u c t i o n ,K e y L a b o r a t o r y f o r A g r o -E c o l o gi c a l P r o c e s s e s i n S u b t r o p i c a l R e g i o n ,I n s t i t u t e o f S u b t r o p i c a l A g r i c u l t u r e ,C h i n e s e A c a d e m y o f Sc i e n c e s ,C h a n g s h a 410125,C h i n a ;2.U n i v e r s i t y o f C h i n e s e A c ade m y of S c i e n c e s ,B e i j i ng 100049,Chi n a ;3.C o l l e g e o f P a s t o r a l A g r i c u l t u r e S c i e n c e a n d T e c h n o l o g y ,L a n z h o u U n i v e r s i t y ,L a n z h o u 730020,C h i n a ;4.S t a t e K e y L a b o r a t o r y o f H e r b a g e I m p r o v e m e n t a n d G r a s s l a n d A g r o -e c o s ys t e m s ,L a n z h o u U n i v e r s i t y ,L a n z h o u 730020,C h i n a )7期吴祎程等:宏基因组学技术分析山羊瘤胃病毒的多样性A b s t r a c t:V i r u s e s,m a i n l y b a c t e r i o p h a g e,a r e s i g n i f i c a n t c o m p o n e n t s o f t h e r u m i n a l m i c r o b i o t a i n r u m i n a n t s.A l l t h e r u m i n a l v i r u s e s a r e c a l l e d r u m i n a l v i r o m e,a n d c o u l d b e s t u d i e d b y m e t-a g e n o m i c s.U n d e r s t a n d i n g t h e c o m p o n e n t s a n d f u n c t i o n s o f g o a t r u m i n a l v i r u s e s i s e x p e c t e d t o p r o v i d e a m o r e c o m p r e h e n s i v e u n d e r s t a n d i n g o f r u m e n m i c r o e c o l o g y.A c c u r a t e p r o f i l i n g o f c o m-p l e x r u m e n v i r o m e r e q u i r e s D N A e x t r a c t i o n m e t h o d s t h a t p r o v i d e a d e q u a t e q u a l i t y a n d q u a n t i t y, a s w e l l a s s u f f i c i e n t c o v e r a g e o f t h e o r i g i n a l c o mm u n i t y.I n t h i s s t u d y,f o u r p r o c e d u r e s t o e x t r a c t v i r u s e s-l i k e p a r t i c l e s(V L P s)f r o m r u m e n f l u i d w e r e c o m p a r e d:(P1)c e n t r i f u g a t i o n+d i l u t i o n, (P2)c e n t r i f u g a t i o n+d i l u t i o n+f i l t r a t i o n,(P3)c e n t r i f u g a t i o n+d i l u t i o n+f i l t r a t i o n+p o l y-e t h y l e n e g l y c o l(P E G)p r e c i p i t a t i o n,(P4)c e n t r i f u g a t i o n+d i l u t i o n+f i l t r a t i o n+P E G p r e c i p i-t a t i o n+c h l o r o f o r m t r e a t m e n t.T h e n u c l e i c a c i d i n f o u r p r o c e d u r e s w a s e x t r a c t e d a n d D N A c o n-c e n t r a t i o n,p u r i t y a n d i n t e g r i t y w e r e c o m p a r e d.T h e n g e n o m i c D N A s e q u e n c i n g w a s p e r f o r m e d u s i n g I l l u m i n a N o v a s e q6000a n d v i r u s p o p u l a t i o n s t r u c t u r e w a s a n a l y z e d.T h e r e s u l t s s h o w e d t h a t t h e r e w e r e p o s i t i v e e f f e c t s o f f i l t r a t i o n a n d P E G p r e c i p i t a t i o n o n v i r a l n u c l e i c a c i d q u a l i t y. 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l:z c s@i s a.a c.c n;R A N T a o,E-m a i l:r a n t@ l z u.e d u.c n反刍家畜瘤胃是一个复杂且多样的微生态系统,其内栖息了细菌㊁真菌㊁原虫㊁古生菌和病毒等多种微生物,瘤胃内病毒主要由噬菌体(b a c t e r i o-p h a g e)构成[1]㊂在微生物生态系统中,病毒尤其是噬菌体的侵染作用会极大地影响微生物群落的结构及功能[2]㊂但由于病毒基因组缺乏合适标记基因和分析基准,且多数病毒无法被归类或找到对应宿主,因此,难以通过P C R等常规技术来检测未知病毒序列[3],以致病毒组研究相对滞后㊂近年来,宏基因组学和生物信息学的发展极大地促进了宏病毒组的研究,并已应用于研究不同环境样本中的病毒群落,如海洋[4]㊁土壤[5]㊁人类粪便[6]等㊂研究人员很早便关注瘤胃液中的病毒群落,陆续分离鉴定了多种瘤胃噬菌体,包括以坏死梭杆菌(F u s o b a c t e r i u m n e c r o-p h o r u m)㊁白色瘤胃球菌(R u m i n o c o c c u s a l b u s)㊁溶纤维丁酸弧菌(B u t y r i v i b r i o f i b r i s o l v e n s)和瘤胃拟杆菌(P r e v o t e l l a r u m i n i c o l a)等为宿主菌的10种噬菌体[7]㊂但是,目前仍缺乏对瘤胃病毒群落的整体认知㊂宏病毒组测序的关键在于从待测样品中富集病毒组分(v i r u s-l i k e p a r t i c l e s,V L P s),获取高质量的病毒核酸用于宏基因组测序㊂已有研究发现,D N A 病毒占据了病毒的绝大部分,本研究仅关注D N A 病毒㊂由于病毒的基因组非常小,如果直接对样品中所有的微生物组D N A进行宏基因组测序,虽然能够获得部分病毒的基因序列,但是容易丢失那些读长短㊁丰度低的病毒序列,不能真实反映病毒的群体构成[8]㊂同时,病毒组分中的噬菌体具有溶源性㊁溶菌性和慢性感染等生命周期,其中溶源性噬菌体在溶源性周期中将遗传物质整合到其细菌宿主的基因组中[9],通过生物信息学分析可以从细菌宏基因组数据中挖掘到溶源性噬菌体的基因序列,但是不能有效获取仅有溶菌性周期的噬菌体㊂因此,V L P s 的富集对全面解析样品中游离病毒组分尤为重要㊂由于瘤胃液样本具有特殊性,如存在饲料大颗粒㊁厌氧环境㊁中性偏酸环境,因此有必要建立专门的瘤胃病毒颗粒分离方法[10]㊂理想情况下,该方法应能快速㊁高效获得病毒组分,易于在实验室中操作㊂氯化铯(C s C l)密度梯度离心是病毒浓缩和纯化的常用技术之一,但是该方法需要用到超速离心3392畜牧兽医学报54卷机,不仅价格昂贵,而且操作耗时较长,更重要的是可能导致大量病毒组分的损失[11]㊂氯仿处理被认为是一种可代替C s C l密度梯度离心的快速纯化病毒的方法,其可通过破坏细菌的胞膜结构,以达到有效去除细菌的效果[12]㊂鉴于此,本研究在提取瘤胃液病毒组分基因组D N A之前,参考C a s t r o-M e jía 等[13]对人粪便样品采用的聚乙二醇(P E G8000)沉淀法,设计4种流程瘤胃液病毒组分富集流程: (P1)离心+稀释㊁(P2)离心+过滤+核酸酶处理㊁(P3)离心+稀释+过滤+聚乙二醇沉淀㊁(P4)离心+稀释+过滤+聚乙二醇沉淀+氯仿处理㊂P E G 8000广泛应用于病毒(噬菌体)的纯化过程,可使病毒沉淀,而不受其他有机质的干扰㊂本研究旨在比较过滤㊁P E G沉淀以及氯仿处理对瘤胃液样品中游离病毒组分D N A质量(产量㊁纯度和完整性)的影响,并利用I l l u m i n a N o v a s e q6000平台对获得的瘤胃病毒基因组D N A进行测序,通过对瘤胃病毒群体结构进行分析来评价不同流程对瘤胃病毒组分富集的效果,以期为进一步研究瘤胃病毒功能提供技术支撑㊂1材料与方法所有动物程序均遵循动物护理和使用指南,并经中国科学院亚热带农业研究所动物护理委员会批准(批准号I S A-W-201609)㊂选用3只体重相近((31.13ʃ3.72)k g)㊁体况良好的成年雄性湘东黑山羊作为试验动物,安装永久性瘤胃瘘管,按本团队成员曾波等[14]的报道进行术后护理和饲喂㊂试验羊的基础日粮由52%玉米秸秆㊁21.52%玉米㊁16.96%麦麸㊁5.98%豆粕㊁0.86%菜籽饼㊁1.08%尿素㊁0.60%食盐以及1%预混料组成㊂日粮营养水平为10.72%粗蛋白㊁58.76%中性洗涤纤维以及27.79%酸性洗涤纤维㊂1.1瘤胃液样品采集步骤山羊晨饲后4h,通过瘤胃瘘管采集瘤胃内容物,用无菌搅拌棒搅动使瘤胃内容物样品混匀,经4层无菌纱布过滤至50m L无菌离心管,离心管装至2/3处后立刻盖严,投入液氮罐中速冻,置于干冰上迅速转移至实验室,于-80ħ冰箱中保存备用㊂1.2瘤胃液病毒组分制备试验流程参考C a s t r o-M e jía的方法[13],并加以修改,以有效分析瘤胃液病毒组㊂为消除动物个体差异,将3头黑山羊的瘤胃液等体积混合,分成3份,操作流程如图1所示㊂离心:将解冻瘤胃液在4ħ下以5000ˑg离心15m i n,将液体部分转移至新的无菌离心管中,以去除瘤胃液样品中的饲料残渣;接着在4ħ下以15000ˑg转速离心30m i n,以去除其他小颗粒碎片,收集上清液㊂稀释:将上述含有游离病毒样颗粒的上清液与预冷的S M缓冲液(200m m o l㊃L-1N a C l,10m m o l㊃L-1 M g S O4,50mm o l㊃L-1T r i s p H7.5)进行1ʒ2稀释㊂过滤:通过1.0μm的玻璃纤维滤纸(W h a t-m a n,G F/C,U K)过滤,以去除瘤胃液中的粒径较大的细菌㊁原虫等,随后经过孔径为0.45μm的P V D F无菌滤膜(M i l l i p o r e B i l l e r i c a,MA,U S A)过滤,进一步去除细菌等㊂P E G沉淀:将200g P E G8000与146.1g N a C l 溶于1L蒸馏水中,经高压蒸汽灭菌后获得P E G-N a C l溶液㊂将过滤步骤后得到的上清液转移到新离心管中,向每个样品中加入25%(v/v)的P E G-N a C l溶液,于4ħ下震荡孵育22h,孵育结束后将样品于4ħ㊁13000ˑg离心45m i n,弃上清,沉淀即为病毒组分,并将其溶解于1m L预冷的0.01m o l㊃L-1磷酸盐缓冲液(P B S)中㊂氯仿处理:向获得的病毒组分浓缩液中加入等体积的氯仿,涡旋1m i n,使氯仿与样品均匀混合,形成乳状物,于4ħ㊁15000ˑg离心5m i n,小心吸取上清液至新的无菌离心管,即为病毒组分㊂1.3瘤胃液基因组D N A提取核酸酶处理:在提取D N A之前,用1.25μL D N a s e I和1.25μL R N a s e A处理样品30m i n,以消除游离D N A和R N A污染,随后在37ħ水浴中孵育10m i n,接着加入1μL100mm o l㊃L-1E D T A 使核酸酶失活,最后在65ħ下水浴孵育10m i n终止E D T A反应㊂使用D N A提取试剂盒(O m e g a D3892-01V i r a l D N A K i t,U S A)提取制备的瘤胃液病毒组分样品的核酸,提取步骤严格按照试剂盒说明书进行㊂完成病毒基因组D N A抽提后,使用Q u b i t D N A广谱分析仪(T h e r m o F i s h e r S c i e n t i f-i c)测定浓度㊁O D260n m/280n m及O D260n m/230n m,并使用1.0%(w/v)琼脂糖凝胶电泳检测基因组D N A的完整性㊂提取的D N A样品储存在-20ħ,直至文库制备及测序㊂检测合格的D N A样品采用C o v a-r i s M220超声破碎仪将样品D N A随机打断成长度43927期吴祎程等:宏基因组学技术分析山羊瘤胃病毒的多样性将瘤胃液混合后,分成三份按照四组流程进行处理,命名为P 1至P 4,下同㊂步骤1(离心)㊁2(稀释)为所有流程的共同步骤,且P 1只执行步骤1和2,P 2执行步骤1㊁2和3(微孔滤膜过滤),P 3执行步骤1㊁2㊁3和4(聚乙二醇沉淀),P 4执行步骤1㊁2㊁3㊁4和5(氯仿处理)T h e r u m e n f l u i d o f t h r e e g o a t s w e r e c o l l e c t e d a n d m i x e d ,t h e n d i v i d e d i n t o t h r e e p a r t s a n d p r o c e s s e d a c c o r d i n gt o f o u r r o u t e s n a m e d P 1t o P 4,t h e s a m e a s b e l o w.S t e p s 1(c e n t r i f u g a t i o n )a n d 2(d i l u t i o n )a r e t h e c o mm o n s t e p s o f a l l pr o c e s s e s ,a n d P 1o n l y p e r f o r m s s t e p s 1a n d 2,P 2p e r f o r m s s t e p s 1,2a n d 3(m i c r o p o r o u s m e m b r a n e f i l t r a t i o n ),P 3p e r f o r m s s t e ps 1,2,3a n d 4(P E G p r r e c i p i t a t i o n ),a n d P 4p e r f o r m s s t e ps 1,2,3,4a n d 5(c h l o r o f o r m t r e a t m e n t )图1 从山羊瘤胃液中分离富集病毒组分的流程示意图F i g .1 S c h e m a t i c r e pr e s e n t a t i o n o f t h e p r o c e d u r e s f o r t h e e x t r a c t i o n o f v i r u s e s f r o m g o a t r u m e n f l u i d 约为450b p 的片段,经末端修复㊁加入A 尾㊁加测序接头㊁纯化㊁P C R 全基因组扩增等步骤完成文库制备,质检合格的文库将采用I l l u m i n a N o v a s e q 6000平台进行测序(上海凌恩生物技术有限公司)㊂1.4 数据质控由于I l l u m i n a N o v a s e q 6000的原始测序数据中包含测序接头序列㊁低质量读段㊁N 率较高序列及长度过短序列,这将严重影响后续组装的质量㊂为保证后续的生物信息分析的准确性,首先对下机的原始测序数据进行质控,过滤掉低质量片段和宿主片段从而得到高质量的测序数据(c l e a n d a t a),以保证后续分析的顺利㊂原始数据已递交G e n B a n k ,登录号为P R J N A 788346㊂1.5 生物信息学分析按照R o u x 等[15]描述的方法,使用M e ga h i t (h t -t p s ://g i t h ub .c o m /v o u t c n /m e ga h i t )对高质量序列进行拼接㊁组装,挑选ȡ2000b p 的组装序列,使用如下软件进行病毒序列鉴定:V i r F i n d e r (h t t ps ://g i t h u b .c o m /je s s i e r e n /V i r F i n d e r )㊁V i r S o r t e r 2(h t -t p s ://g i t h u b .c o m /s i m r o u x /V i r S o r t e r )㊁C A T (h t -t p s ://gi t h u b .c o m /d u t i l h /C A T ),并对初步鉴定为病毒的序列进行v O T U s (v i r a l o pe r a t i o n a l t a x o -n o m i c u n i t s)分析㊂鉴定得到病毒序列后,获得其物种分类学信息,并使用V P F -C l a s s 工具对病毒进行物种注释和宿主预测㊂挑选置信度(C o n f i d e n c e _S c o r e )>0.36的结果,进行病毒科水平物种注释;挑选置信度(C o n f i d e n c e _S c o r e )>0.5且成员比对率(M e m b e r s h i p_R a t i o )超过0.3的结果,进行病毒(噬菌体)潜在宿主预测[16]㊂1.6 数据分析利用M i c r o s o f t E x c e l (M i c r o s o f t I n c .,W a s h -i n gt o n ,U S A )对数据进行初步统计,随后用S P S S 19.0(S P S S I n c .,C h i c a go ,U S A )对不同流程提取的基因组D N A 质量相关指标进行单因素方差分析(A N O V A )[17]㊂对宏基因组数据进行正态检验和方差齐性检验,符合方差分析的数据用S P S S 进行5392畜牧兽医学报54卷A N O V A分析,不符合方差分析的数据用S P S S软件进行非参数分析,P<0.01表示差异极显著, 0.01ɤP<0.05表示差异显著,0.05ɤP<0.10表示存在趋势㊂瘤胃液病毒相对丰度图㊁箱线图分别利用凌恩生物在线云平台(h t t p://c l o u d.b i o m i c r o-c l a s s.c o m/C l o u d P l a t f o r m)和联川生物在线云平台(h t t p s://w w w.o m i c s t u d i o.c n/t o o l)的工具在线绘制㊂2结果2.1不同提取流程对瘤胃病毒核酸提取质量的影响各流程提取的基因组D N A质检结果见图2㊂由图2a可知,P2流程中D N A产量显著高于P1㊁P3和P4处理流程(P<0.001)㊂P1㊁P2与P3流程获得的D N A的O D260n m/280n m均>1.90,说明提取的核酸相对纯净(图2b)㊂经氯仿处理(P4)的基因组核酸D N A,因产量过低(图2a)而不满足高通量测序需求,故没有进行后续上机建库及组学分析㊂a.核酸浓度;b.核酸纯度㊂*表示P<0.05,**表示P<0.01a.C o n c e n t r a t i o n o f n u c l e i c a c i d s;b.Q u a l i t y o f n u c l e i c a c i d s.*P<0.05a n d**P<0.01图2四种流程处理后所提取的山羊瘤胃液病毒组分的核酸质量(n=3)F i g.2Q u a l i t y o f n u c l e i c a c i d s o f r u m i n a l v i r a l-l i k e p a r t i c l e s e x t r a c t e d f r o m t h e g o a t r u m e n f l u i d i n f o u r g r o u p s(n=3)2.2不同提取流程对瘤胃病毒群落α多样性的影响使用I l l u m i n a N o v a s e q6000平台对符合测序要求的9个样本进行了病毒宏基因组学测序,共获得1058773724个r e a d s,每个样品的平均r e a d s数为117641525,范围为105495627至125358829㊂不同提取流程的瘤胃病毒α多样性指数见图3,不同提取流程对测序时获得的g o o d s_c o v e r a g e比例没有显著影响(图3a),同时不同流程间C h a o1指数(P=0.834)和S h a n n o n指数(P=0.255)均无显著差异㊂a.g o o d s_c o v e r a g e;b.C h a o1指数,用于估计群落中v O T U丰度;c.S h a n n o n指数,用来描述群落中病毒多样性a.g o o d s_c o v e r a g e;b.C h a o1i n d e x,r e p r e s e n t s t h e r i c h n e s s o f v O T U;c.S h a n n o n i n d e x,r e p r e s e n t s t h e d i v e r s i t y o f v i r u s 图3不同处理流程获得的瘤胃液病毒的α多样性指数F i g.3A l p h a d i v e r s i t y i n d e x e s o f r u m i n a l v i r o m e o b t a i n e d f r o m d i f f e r e n t p r o c e s s i n g p r o c e d u r e63927期吴祎程等:宏基因组学技术分析山羊瘤胃病毒的多样性2.3不同提取流程对瘤胃病毒群落β多样性的影响为评估不同样品处理流程对瘤胃病毒群落组成的影响,进行了基于B r a y-C u r t i s距离的P C o A分析及A N O S I M分析㊂在P C o A图中,P2流程与P1和P3在P C o A2上分开(26.01),但差异不显著(A N O S I M R=0.695,P>0.05;图4)㊂结果表明,虽然不同D N A提取流程会导致病毒群落组成的差异,但对群落组成的影响较小㊂2.4不同提取流程对瘤胃病毒群落分类学特征的影响宏基因组测序结果表明,不论采用何种瘤胃液样品病毒组分富集流程,均显示山羊瘤胃中的D N A 病毒主要为噬菌体(图5)㊂其中,绝大多数噬菌体序列来自长尾病毒科(S i p h o v i r i d a e,63.29%)㊁肌尾病毒科(M y o v i r i d a e,11.87%)和短尾病毒科(P o d o v i r i d a e,5.64%),这3个病毒科同属于有尾病图4不同处理流程对瘤胃病毒组分的主坐标分析(基于B r a y-C u r t i s距离,n=3)F i g.4P r i n c i p a l c o-o r d i n a t e s a n a l y s i s b a s e d o n B r a y-C u r t i sd i s t a n ce s of r u m i n a l v i r o m e o b t a i n e d f r o m d i f f e r e n tp r o c e s s i n g p r o c e d u r e(n=3)毒目(C a u d o v i r a l e s)㊂进一步分析了不同富集流程对瘤胃病毒相对丰度的影响,结果表明P E G处理对S i p h o v i r i d a e(P<0.05)及A c k e r m a n n v i r i d a e科(P<0.01)的病毒有显著富集效果(图6)㊂a.总体瘤胃微生物组成;b.总体病毒组分组成;c.不同处理流程瘤胃液中病毒相对丰度(科水平)a.O v e r a l l c o m p o s i t i o n o f r u m e n m i c r o b i a l;b.O v e r a l l c o m p o s i t i o n v i r u s-p a r t i c l e s;c.R e l a t i v e a b u n d a n c e o f v i r u s e s i n d i f-f e r e n t p r o c e s s i n g p r o c e d u r e s(f a m i l y l e v e l)图5黑山羊瘤胃液中微生物组成F i g.5C o m p o s i t i o n o f r u m e n m i c r o b i a l o f b l a c k g o a t*表示P<0.05,**表示P<0.01*m e a n s P<0.05a n d**m e a n s P<0.01图6在不同流程中病毒相对丰度(n=3)F i g.6R e l a t i v e a b u n d a n c e o f v i r a l f a m i l y i n d i f f e r e n t p r o c e s s i n g p r o c e d u r e s(n=3)7392畜牧兽医学报54卷2.5瘤胃病毒群落宿主预测利用V P F-C l a s s工具对山羊瘤胃中最丰富的4个D N A病毒科噬菌体成员进行了宿主预测,并列出了噬菌体与宿主间的对应关系(图6)㊂结果显示瘤胃病毒的宿主多为细菌,优势宿主预测排序结果为:节杆菌属(A r t h r o b a c t e r)㊁芽孢杆菌属(B a c i l-l u s)㊁噬纤维素属(C e l l u l o p h a g a)㊁梭菌属(C l o s-t r i d i u m)㊁乳酸球菌属(L a c t o c o c c u s)㊁分岐杆菌属(M y c o b a c t e r i u m)㊁绿脓杆菌属(P s e u d o m o n a s)㊁里氏杆菌属(R i e m e r e l l a)㊁链球菌属(S t r e p t o c o c c u s)㊂其中,M y o v i r i d a e科的噬菌体主要侵染芽孢杆菌属(B a c i l l u s)细菌,P o d o v i r i d a e科的噬菌体主要侵染噬纤维素属(C e l l u l o p h a g a)的细菌,而S i p h o v i r i d a e 科的噬菌体主要侵染芽孢杆菌属(B a c i l l u s)㊁梭菌属(C l o s t r i d i u m)㊁里氏杆菌属(R i e m e r e l l a)和噬纤维素属(C e l l u l o p h a g a)等属的细菌㊂图7山羊瘤胃病毒群落的潜在宿主种类预测F i g.7P r e d i c t i o n o f p o t e n t i a l h o s t s o f r u m i n a l v i r u s e s i n r u m e n f l u i d o f g o a t s2.6不同生境病毒群落比较本研究将山羊瘤胃病毒群落与其他环境,如人类粪便[4]㊁海洋[5]或土壤[6]病毒群落进行比较(图8)㊂结果表明,不同生境中病毒群落构成存在很大差异:在生境病毒群落多样性方面,以土壤生境最高;在病毒群落相对丰度方面,人类粪便和山羊瘤胃病毒群落的相似性更高,均为以S i p h o v i r i d a e科的病毒为主,但二者又有区别,体现在山羊瘤胃病毒群落具有更高丰度的M y o v i r i d a e科病毒;在病毒核酸类型方面,人类粪便和山羊瘤胃中的D N A 病毒以双链D N A(d o u b l e-s t r a i n D N A,d s D N A)病毒为主,而土壤生境中还含有微病毒科(M i c r o v i r i-d a e)㊁球状病毒科(G l o b u l o v i r i d a e)㊁矮化病毒科(N a n o v i r i d a e)等单链D N A(s i n g l e-s t r a i n D N A,s s-D N A)病毒㊂3讨论瘤胃微生物组成十分复杂,绝大多数瘤胃细菌是严格厌氧或兼性厌氧,且目前仅有很少的瘤胃细菌被分离培养,这导致基于传统培养手段的瘤胃病毒(主要是噬菌体)研究开展起来困难重重㊂近年来宏基因组学广泛运用于动物胃肠道微生态的研究,可规避体外培养微生物的限制㊂该技术也逐步应用于病毒组的研究,借助各种生物信息学分析工具,极大地推进了病毒特异性序列数据集(病毒组)的获取和分析[18]㊂高通量测序过程中,样品D N A的质量尤为关键,提高瘤胃病毒组分基因组D N A的产量及质量,可以有效地提高后续生物信息学分析的准确性㊂在核酸提取和上机测序之前,病毒组分预处理的主要作用为病毒富集和病毒纯化[11]㊂具体步83927期吴祎程等:宏基因组学技术分析山羊瘤胃病毒的多样性图8 山羊瘤胃液㊁人类粪便[4]㊁海水[5]及土壤[6]中的病毒相对丰度F i g.8 R e l a t i v e a b u n d a n c e o f v i r a l c o m m u n i t i e s i n g o a t r u m e n f l u i d ,h u m a n f a e c e s [4],s e a w a t e r [5]a n d s o i l [6]骤需要根据所研究的样本类型进行调整㊂本研究参考C a s t r o -M e jía 等[13]提出的方法,设置了4种流程来评估过滤步骤㊁P E G 沉淀以及氯仿处理对D N A 提取质量以及宏基因组测序结果的影响㊂O D 260n m /280n m 是衡量DN A 提取质量的重要指标,会受R N A 污染以及D N A 降解的影响[19]㊂P 3流程所获得的核酸产量并不是最高的,但P 3流程O D 260n m /280n m在数值上最高,P 4流程所获得的核酸产量最低㊂病毒学研究过程中常使用传统的苯酚-氯仿提取法对病毒基因组进行提取[20],而如今市场上已经出现了多款用于从环境样品中提取病毒基因组D N A 的试剂盒[9,21]㊂本研究选用了价格为Q i a ge n 试剂盒1/5的O m e g a 病毒D N A 提取试剂盒,该试剂盒原用于提取血清病毒基因组,本研究表明,该试剂盒也能用于提取瘤胃液样品中的病毒基因组,且满足测序需求㊂不同流程间瘤胃病毒多样性并没有显著差异,这可能是由于病毒组在整体微生物组中所占比例过小,正如H e s s 等[22]报道的,即使在大多数环境中噬菌体的数量级为细菌的10倍,但由于宿主D N A (细菌和真核生物)的污染,病毒r e a d s 只占可注释D N A 的2%~5%㊂病毒群落结构分析表明,本试验选用的山羊瘤胃中的优势病毒群落依次为长尾病毒科(S i ph o v i r i -d a e )㊁肌尾病毒科(M yo v i r i d a e )和短尾病毒科(P o d o v i r i d a e ),这与前人发表的瘤胃病毒群落以长尾病毒科㊁肌尾病毒科和短尾病毒科占主导地位一致[9]㊂过滤步骤需考虑滤膜孔径大小,常用微孔滤膜孔径为0.22或0.45μm ㊂先前研究表明胃肠道中最丰富的长尾病毒科(S i ph o v i r i d a e )及肌尾病毒科(M yo v i r i d a e )都大于0.22μm [9],故本研究选用了孔径为0.45μm 的微孔滤膜㊂本研究中丰度最高的为长尾病毒科(S i ph o v i r i d a e ),也证明了0.45μm 滤膜的有效性㊂由于病毒颗粒小,在核酸提取之前,通常使用P E G 配合N a C l 来沉淀样品中的V L P s 以实现病毒的浓缩㊂本研究表明,P E G 可显著富集有尾病毒目中的长尾病毒科(S i ph o v i r i -d a e )及A c k e r m a n n v i r i d a e 科噬菌体㊂本研究还发现疱疹病毒科(H e r p e s v i r i d a e )的病毒在该瘤胃液样本中的存在,但丰度十分低㊂C s C l 密度梯度离心步骤被认为是纯化病毒的最佳方法[12],此法可对特定密度范围内的噬菌体进行纯化,并根据密度将V L P s 与其他组分分离㊂但这一技术耗时㊁昂贵且需要特定的技术技能和实验室设备㊂有研究发现,氯仿处理能代替氯化铯密度梯度离心步骤用于纯化病毒[23],此方法已成功用于9392畜牧兽医学报54卷血清病毒纯化和发酵食品病毒纯化[24-25]㊂但本研究发现,氯仿处理在瘤胃液病毒纯化中会造成大量颗粒损失,以至于不能满足高通量测序的需求㊂这是因为瘤胃细菌仍为瘤胃液的主要部分,氯仿会严重干扰包膜类物质,比如细菌,而且有些病毒也存在膜结构,膜结构被破坏后,病毒的蛋白质外壳会变得不稳定[26]㊂而部分病毒蛋白质外壳也对氯仿十分敏感,氯仿处理则造成这类病毒的大量丢失[27]㊂D N A产量也因此出现显著差异,P4提取流程的核酸因产量过低,不适用于高通量测序建库㊂因此,氯仿处理代替C s C l密度梯度离心步骤用于纯化瘤胃病毒还有待后续试验进一步研究㊂环境中病毒的多样性和丰度与微生物群落息息相关㊂有研究表明同一环境中病毒群落具有很高的相似性,而来自不同环境的病毒及其宿主分布的相似性较低[28-30]㊂反刍动物会从外界摄入大量食物,瘤胃作为一个天然发酵罐,微生物群落共生于一个相对封闭的容器中,这导致瘤胃微生物具有非常独特的群落特征[1],瘤胃液中病毒的丰富度反映了瘤胃微生物宿主的多样性㊂由于病毒宏基因组学建库限制以及测序平台对核酸样品扩增的需求,本研究主只检测了山羊瘤胃液中的D N A病毒,发现样品中主要为d s D N A病毒,它们都属于有尾病毒目㊂之前的大量研究也表明瘤胃病毒以d s D N A为主,其中大部分为有尾病毒目的噬菌体[9,21,31-32]㊂另外,由于技术的局限性,本方法提取的D N A不一定满足长读长测序平台,例如P a c B i o(w w w.p a c b.c o m) o r O x f o r d N a n o p o r e(h t t p s://n a n o p o r e t e c h.c o m)㊂此外,本试验只关注了病毒组分中d s D N A的核酸,此病毒组分富集方法是否适用于s s D N A或R N A 病毒尚不清楚[33]㊂4结论本研究比较了不同D N A提取流程对核酸产量㊁质量㊁病毒多样性以及病毒概况的影响,表明了P E G沉淀步骤对长尾病毒科及A c k e r m a n n v i r i d a e 科噬菌体具有富集作用㊂研究人员可根据试验需求进行选择,当需要重点关注这类噬菌体的情况下,可采用P3流程,即对瘤胃液进行离心㊁稀释以及微孔滤膜过滤操作,若对特定病毒没有富集需求,则采用P2流程即可,即无需进行微孔滤膜过滤步骤,此两种流程均能达到病毒宏基因组测序要求㊂基于以上结果,本试验构建了提取瘤胃液中病毒组分D N A 的流程,此方案可大大促进反刍动物瘤胃液中噬菌体群落的研究进程㊂参考文献(R e f e r e n c e s):[1] D E N G W D,X I D M,MA O H M,e t a l.T h e u s e o fm o l e c u l a r t e c h n i q u e s b a s e d o n r i b o s o m a l R N A a n dD N A f o r r u m e n m i c r o b i a l e c o s y s t e m s t u d i e s:Ar e v i e w[J].M o l B i o l R e p,2008,35(2):265-274. 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中国科学家Cell重要评述文章：宏基因组学成为病毒分类新方法无处不在，纷繁多样，变化莫测，病毒是地球上最多样的遗传资源库。

传统方法中新病毒发现是基于复杂耗时的分离培养、PCR等实验室操作，因此人类对于病毒（尤其是RNA病毒）的认识极为有限。

作为最高效的病毒鉴定方法之一，宏基因组学可以无偏性地反映完整病毒组信息，涵盖丰富的进化，遗传和功能等信息，甚至帮助发现新型RNA病毒，弥补了以往病毒发现及分类中存在的大量间隙。

自然界的病毒：千姿百态、多种多样宏基因组学在病毒基因组方面的研究应用加速甚至是变革了人们对病毒多样性的认知。

基于宏基因组学，无脊椎动物的病毒多样性被扩展的最多，协助科研工作者洞悉了动物病毒的起源及进化，探究无脊椎动物病毒是脊椎动物病毒先祖的假说；脊椎动物病毒研究样本主要取自哺乳动物（人类疾病诊断），其次是鸟类，对感染两栖动物等的病毒研究极少；虽然采用宏基因组技术发现的病毒仍面临病毒分类的巨大挑战，但宏基因组学数据仍有望成为病毒分类研究的新标准。

探究RNA病毒世界的三种方法涵盖的范围(黄色：宏基因组学、红色：病毒培养、蓝色：PCR)溯觅寻因：为何RNA病毒如此多样基于宏基因组的研究帮助人类一方面了解病毒基因组的大小和结构，也对导致病毒多样性的进化因素有了新的见解。

RNA病毒基因组普遍较小，但同样经历了复杂的进化过程。

RNA病毒基因组具有如片段化、非片段化和环状片段的混合体等复杂的结构以及更大范围的基因组长度。

同时，研究者发现RNA病毒的基因重复和丢失、基因重排和水平基因转移发生频率要远高于之前的预期。

因此，RNA病毒基因组是动态和灵活变化的实体，同时，与脊椎动物病毒相比，无脊椎动物病毒基因组多样性更高、结构更复杂。

RNA病毒基因组进化原理：不同颜色的框代表不同进化起源的RNA病毒基因。

RNA病毒基因组在进化过程中会经历基因转移、丢失、重组、倒置、片段化等变化。

RNA病毒和宿主：互相作用、共同进化宏基因组学同时也为研究者们探究宿主-病毒的相互作用提供了一些新思路。

宏基因组学：探索海洋病毒世界的新工具作者：汪俭来源：《科教导刊·电子版》2015年第08期摘要海洋病毒，主要是感染微生物的噬菌体，是海洋世界中最丰富的生物体。

由于大于99%的微生物宿主不能被培养，并且病毒基因组没有一个通用的标记基因，利用传统的培养和PCR的方法不能够完全了解环境中病毒群落的多样性和动态学性质。

病毒宏基因组学（metagenomics）研究突破了这些方法的限制，直接以环境样品中病毒群体的基因组为研究对象，探究环境中病毒群落结构和功能，极大地丰富了对海洋病毒多样性及其功能的认识。

关键词海洋病毒宏基因组学多样性病毒是海洋生态系统中数量最庞大的生物体，在生物地球化学循环中起着重要作用，可以影响微食物环中的C、N流，调节水体中的微生物群落结构，维持微生物的多样性，介导微生物之间的基因转移。

传统的研究病毒的方法是通过培养分离的方法，得到纯种的病毒，但是这种方法由于大部分的病毒不可培养，导致对自然环境中整个病毒群落的了解知之甚少。

另外，由于病毒没有像原核生物和真核生物16sRNA、18sRNA一样的标记基因去鉴别它的多样性，而病毒宏基因组学（metagenomics）研究突破了这些限制，直接以生境中整个病毒群落的基因组为研究对象，探究环境中病毒群落结构和功能，极大地丰富了对海洋病毒多样性及其功能的认识。

病毒宏基因组学可以研究各种环境下的病毒群落，阐明环境病毒的遗传潜力、群落结构和生物地理学，提高我们对病毒生态学的认识。

其次，病毒群落尤其是噬菌体群落的宏基因组学分析，为我们研究微生物生态和环境动力学提供了一个有效的工具。

病毒编码的功能基因代表着环境中最重要的代谢过程，并且病毒代谢过程在不同的环境中也是不同的。

在海洋环境中，噬菌体和藻类病毒都携带有光合基因，能够使它们的宿主在强光下进行光合作用。

还有许多噬菌体编码抗生素基因、宿主免疫抗性基因和毒力因子例如毒素，能增加其宿主的致病性。

病毒宏基因组学研究还能够向我们提供相关环境信息，因为丰富的病毒很可能代表着丰富的宿主群落，并且病毒多样性与环境的复杂性息息相关。

宏基因组学名词解释宏基因组学名词解释1. 引言宏基因组学是一门研究关注复杂生态系统中多个物种的基因组结构和功能的新兴学科。

宏基因组学通过高通量测序技术和先进的生物信息学工具，使我们能够更全面地了解和研究整个生态系统中的多样性和相互作用。

本文将探讨宏基因组学的定义、意义和应用领域，帮助读者对这一学科有更深入的理解。

2. 宏基因组学的定义宏基因组学（metagenomics）是对自然环境中所有微生物群体的基因组进行大规模研究的学科。

与传统基因组学研究个体生物的基因组不同，宏基因组学通过直接从环境样品中提取DNA，而无需进行单个细菌或真核生物的纯化和分离。

这使得研究者可以全面了解整个生态系统中的微生物多样性和功能。

3. 宏基因组学的意义宏基因组学的出现革新了我们对微生物的认知。

过去，研究人员主要通过培养和分离单个微生物来了解其特性和功能。

然而，只有少部分微生物可以被培养和分离，这限制了我们对微生物世界的认知。

宏基因组学的发展使我们能够研究那些无法在实验室中培养的微生物，扩大了我们对微生物多样性和功能的认识。

4. 宏基因组学的应用领域宏基因组学在众多领域中有着广泛的应用。

宏基因组学有助于了解和保护环境。

通过分析环境样品中的基因组数据，可以评估环境中的生物多样性和生态系统功能。

宏基因组学对人体健康也有着重要意义。

通过分析人体内微生物群落的基因组，可以研究微生物与人体健康之间的关联，并筛选潜在的微生物治疗方法。

宏基因组学还在药物发现、农业生产和食品安全等领域发挥着重要作用。

5. 个人观点和理解宏基因组学的出现和发展为我们揭示了微生物世界的奥秘，对科学研究和应用有着重要的意义。

通过研究宏基因组学，我们不仅能够更好地了解生态系统中的微生物多样性和功能，还能够应用于环境保护、医学健康、农业和食品安全等领域。

然而，它也面临一些挑战，如巨大的基因组数据处理与分析、难以获取全面和准确的样本等。

我认为在未来的发展中，宏基因组学需要更加注重生物信息学、数据挖掘和新的实验技术的研究，以应对这些挑战。

宏基因组学和微生物组学的研究随着技术的不断发展和突破，宏基因组学和微生物组学成为了迅速发展的新兴领域，并具有着广泛的应用前景。

这两个领域对于探究生命科学中的各种微观机理具有重要意义，尤其是在生物学、环境科学和医学等方面。

一、宏基因组学的概念宏基因组学指的是对所有生物DNA进行研究的一种新型技术，它是基因组学的一个分支。

与传统的基因组学研究方法不同的是，宏基因组学研究是利用高通量测序技术，直接从自然环境或宿主生物中提取大量不同种类的DNA全基因组序列，并通过计算比对和注释等方式进行分析和解读。

宏基因组学的应用非常广泛，它可以用来研究各种生态系统、环境样品和微生物以及宏体的基因组组成等。

同时，它也可以被用来识别和分类具有重要意义的基因和代谢途径，以及对科学研究和产业应用有着重要意义的微生物群落。

二、微生物组学的概念微生物组学是研究微生物的基因组、组成和功能，以及微生物的角色和影响力。

微生物是指包括细菌、真菌、古菌和病毒在内的生物群体。

微生物在生物圈中具有重要的生态地位，它们能够维持和调控细菌的平衡，也是许多重要生物过程的关键组成部分。

微生物组学以微生物的DNA测序分析为基础，将微生物分类和鉴定工作推向了一个新的高度。

通过分析微生物的基因组序列和代谢通路，微生物组学可以揭示微生物群落的形成和演化过程，同时也有助于发现和利用新的微生物资源。

三、宏基因组学和微生物组学的应用宏基因组学和微生物组学的应用非常广泛，从生态学、医学、食品科学到环境科学等各个领域，都有着重要的应用价值。

1. 生态学领域生态学中，宏基因组学和微生物组学的研究可以帮助研究者深入了解环境中微生物群落的组成和功能，以及微生物和生态系统之间的相互作用模式。

同时，它也能够对环境的变化进行监测和预测，并探究生态系统的恢复和调整机制。

2. 医学领域微生物组学的研究对于临床医学的发展和进步具有非常重要的作用。

通过对宏体和微生物群体的分析和研究，可以更好地了解人体内微生物群落的组成和功能，探究与疾病相关的微生物群落改变机制，发现新的病原体，并且可以用于筛查和开发新的治疗方法和药物。

近年来，新发、突发传染病不断出现，由于其不可预知性和突发性，同时具有病死率高、危害性大等特点，因而引起社会恐慌。

然而，现有的常规检测只能针对我们已知的病原微生物，对于未知病原体仍然缺乏相应的鉴别手段。

传统的诊断技术已不能满足或很难适应提前预警或快速诊断新发传染性疾病的需求。

挖掘潜在的新病毒或未知病原体将是人类预防、诊断和治疗新发传染病的最有效的途径。

现有的病毒检测技术受多方面的限制。

病毒宏基因组学（viral mretagenomics ）是在宏基因组学（metagenomics ）理论的基础上，结合现有的病毒分子生物学检测技术而兴起的一个新的学科的分支，近年来，其在医学及公共卫生领域显示了巨大的优越性。

本文主要对近10年来病毒宏基因组的兴起、优势及策略、在临床检测及公共卫生领域的应用进展作一综述。

1病毒宏基因组的兴起宏基因组学是由Schmidt 等［1］和Handelsman等［2］于20世纪90年代提出的一门应用学科，迄今为止，其研究对象已从最初的土壤微生物发展到水体浮游微生物、海水及海底沉积物、空气悬浮物以及动植物体附生微生物等。

目前99%以上微生物在现有实验室条件下都无法进行培养，所以利用宏基因组技术来研究那些大量未知的微生物序列信息，可以跨越微生物研究的初始瓶颈，在很大程度上改变人们对微生物世界的传统认识。

而病毒宏基因组学是以微生物中的病毒为研究对象，近年来随着高通量测序技术的不断发展，尤其是新二代测序仪的出现，使病毒宏基因组学发展尤为迅速。

从2002年至今，许多研究成果及重大成就的取得都离不开该技术的运用，见图1。

近年来，该技术的应用的范围也不断扩大，涵盖了农业、林业、环保、医药、公共卫生安全等多个领基金项目：863计划（2012AA022006）.通讯作者：夏咸柱，E -mail ：xiaxzh@病毒宏基因组学在医学领域的应用范胜涛1，2，高玉伟2，夏咸柱1，21.中国医学科学院北京协和医学院医学实验动物研究所，北京100021；2.军事医学科学院军事兽医研究所，吉林长春130122摘要：新发、再发病毒性传染病不断出现，如何快速鉴别致病病原显得尤其重要。