应用PRVVP6蛋白McAb间接免疫荧光法检测猪轮状病毒_边亚娟
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应用PRV VP6蛋白McAb间接免疫荧光法
检测猪轮状病毒
边亚娟1,3,林长水3,田志军2,唐丽杰1,王玉玲1,张海峰1,张炳丽1,李一经2
(1.东北农业大学动物医学院,黑龙江哈尔滨150030; 2.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所,黑龙江哈尔滨150001;
3.黑龙江生物科技职业学院,黑龙江哈尔滨150003)
中图分类号:S858.285.3 文献标识码:B 文章编号:0529-6005(2007)04-0036-01
猪轮状病毒病是由呼肠孤病毒科的猪轮状病毒(PRV)引起以腹泻和脱水为特征的一种急性肠道传染病。
本试验利用已研制的抗PRV V P6蛋白单克隆抗体(Mo noclona l Antibody Mc Ab)采用间接免疫荧光试验对接种PRV的细胞培养物进行了病原检测,并与PRV全病毒制备的抗血清进行比较,以评价抗PRV V P6蛋白单克隆抗体在PRV快速检测的潜在应用价值。
1 材料与方法
1.1 材料 (1)猪轮状病毒JL94株,本教研室分离保存的强毒细胞培养物。
(2)传代细胞Ma rc-145非洲绿猴肾细胞,由中国农科院哈尔滨兽医研究所提供。
(3)抗PRV V P6蛋白M cAb,本教研室制备保存的杂交瘤上清液。
(4)抗PRV全病毒抗血清,由中国农科院哈尔滨兽医研究所提供。
(5)羊抗鼠Ig G荧光
收稿日期:2005-10-17
基金项目:黑龙江十五攻关课题(GC01B510)
通讯作者:李一经抗体,购自北京中山生物技术有限公司,用前以0.01%伊文思蓝0.01m ol/L p H7.2PBS稀释成所需要的浓度。
1.2 病毒培养 病毒培养物与30μg/m l胰蛋白酶按1∶1混合,37℃处理1h,取24h生长良好的Ma rc-145单层细胞,弃去培养液,用PBS清洗细胞单层3次,按照原培养液量的1/10加入胰酶处理过的病毒液,37℃静止吸附1h,其间轻摇2次,之后加入维持液(3%胰蛋白酶的DM EM),37℃培养,逐日观察,在48～72h出现病变后,收获细胞培养物进行免疫荧光检测。
1.3 间接免疫荧光检测 取接种病毒和未接种病毒的细胞培养物,倒去培养上清液,刮取培养物单层,涂于玻片上,自然干燥后,用预冷的丙酮液固定40min,挥干后,用0.01mol/L p H7.2PBS洗涤3次,每次3 min,自然干燥后,滴加抗PRV V P6蛋白McAb杂交瘤上清液,37℃湿盒作用30min后,用0.01mol/L p H 7.2PBS冲洗后,在装有0.01m ol/L pH7.2PBS 的3个缸内依次浸泡,每个缸浸泡5min,期间不时
以上中和试验结果表明该病毒为类4/91株。
4 预防与治疗
4.1 疫苗选择 我们选择了一株国内某疫苗厂生产的针对肾病变型传支的IB活毒疫苗—HK株,用已知的传支抗血清进行病毒中和试验,结果表明该疫苗株和类4/91株存在部分相关性。
4.2 根据疫病的流行情况,选择适当的疫苗制订相应的免疫程序,同时完善各项生物安全措施。
4.3 治疗方案 对于发病鸡群采用肾传支疫苗HK 株4～5倍量饮水,同时用中药复方制剂肾肿解毒散拌料,可以收到了较好的效果,治愈率达到70%～80%。
值得重视的是在治疗肾传支同时一定要控制好大肠杆菌的继发感染,否则效果不理想。
5 小结与讨论
5.1 传支疫苗的免疫应提前到1日龄用喷雾的方法进行,以求在野毒最早感染的部位-上呼吸道尽早形成局部免疫力。
同时考虑到传支血清型很多,不同血清型之间的交叉保护力差,在首日龄进行Mass株喷雾免疫的基础上,在10日龄左右再使用其他毒株的疫苗(如HK株、4/91株)免疫,可以扩大保护范围。
5.2 病毒中和试验表明本次流行肾病变型传支为类4/91毒株,所以4/91疫苗可能是控制本病的最佳选择。
如果现行免疫程序仍不能很好保护,可以考虑使用相关疫苗对种鸡进行免疫,以求获得一定的母源抗体来保护商品代雏鸡在早期免受野毒感染。
5.3 因本病水平传播速度极快,综合生物安全措施十分重要,包括舍内外环境的消毒、鸡群饲养环境的控制、粪便及病死鸡的处理、避免或减缓一切可能的应激因素的发生,尤其是应做好其他呼吸道疾病的预防。
5.4 对发病鸡群采取上述的治疗方案,虽然取得了比较好的结果,但治疗效果还需要在更多的实践中进一步核实,同时通过实验室工作进一步了解以上方案的机理。
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震荡几次。
玻片从玻缸取出后,用滤纸吸干,滴加0.01%伊文思蓝稀释的荧光素标记的羊抗鼠Ig G 后,将玻片放入湿盒,37℃作用30min 后取出,用相同方法洗涤3次,挥干后,滴加磷酸甘油封片,镜检观测。
2 结果
应用抗PRV V P 6蛋白的Mc Ab 对接种PRV 的细胞培养物和未接种病毒的对照细胞培养物所进行的间接免疫荧光试验表明,接种PRV 的细胞培养物多数细胞在其胞浆和细胞膜上出现绿色闪亮荧光(图1);未接种病毒的细胞培养物,未见有绿色荧光染色的细胞存在(图2)。
利用PRV 全病毒制备的抗血清对接种病毒和未接种病毒的细胞培养物进行间接免疫荧光试验表明,接种病毒的细胞培养物染色后,亦呈现亮绿色荧光(图3),但对照未接种PRV 的细胞培养物进行染色结果观察亦具有一定的非特异性荧光反应(图4)。
比较Mc Ab 和多克隆全病毒抗血清对PRV 细胞培养物间接免疫荧光染色的结果表明,利用抗PRV V P6蛋白Mc Ab 对病原的检测与多克隆抗血清比较,其非特异性大大减小。
图1
抗PRV V P6蛋白M c Ab 杂交瘤上清液对未感染PRV M a rc -145细胞系进行间接免疫荧光染色结果。
感染细胞
胞浆及细胞膜呈闪亮绿色荧光反应
图2
抗PRV V P6蛋白M c Ab 杂交瘤上清液对未感染PRV M a rc -145对照细胞进行间接免疫荧光染色结果。
细胞未见有亮绿色荧光染色细胞。
图3 抗P RV 全病毒制备的抗血清对感染P RV M arc-145细胞进行间接免疫荧光染色结果。
感染细胞出现亮绿色荧光反应。
图4 抗PRV 全病毒制备的抗血清对未感染PRV M arc-145细胞进行间接免疫荧光染色结果。
未感染细胞未出现明亮荧光反应,细胞背景有一定的非特异性反应。
3 讨论
免疫荧光技术因其直观性强和操作简便成为实验室常用的快速检测手段,间接免疫荧光法更扩大了抗体的应用范围,通过荧光素标记二抗的结合,将信号进行放大,在一定程度上提高了检测的灵敏度,但随之带来的高背景也增加了检测的非特异性。
因此如何降低间接免疫荧光检测的非特异性,提高其检测的准确性在实践上具有重要意义。
目前对PRV 检测所用的抗体制剂多为全病毒制备的抗血清,在抗血清的制备过程中,因抗原的纯度,不同的免疫批次以及免疫动物的个体差异均会影响免疫血清的质量和检测的稳定性。
本试验利用已建立的抗PRV V P 6蛋白M cAb 与全病毒抗血清分别对感染和未感染PRV 的细胞培养物进行间接免疫荧光试验的比较研究结果表明,Mc Ab 鉴定的PRV 感染细
胞培养物间接免疫荧光染色结果特异性强,排除了高
背景的非特异荧光影响,对结果的判定更为准确。
利用抗PRV V P6蛋白M cAb 建立的间接免疫荧光检测方法,为PR 感染的病原快速检测提供了重要手段。
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