高速逆流色谱法纯化制备蜜桔黄素
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FOODSCIENCEANDTECHNOLOGY食品科技2009年第34卷第1期
图1蜜桔黄素的化学结构式4OCH3
56H3CO
7H3CO8OCH3910321,2,3,4,
5,6,
OCH3
OCH3
O
O
高速逆流色谱(High-speedcountercurrentchromatography,HSCCC)技术是一种无固体载体的连续液-液分配色谱技术，它通过重力场和离心力场的作用将固定相保留在分离柱内[1-2]，其优点是消除了传统柱色谱固体载体作为固定相时对样品的吸附现象。目前已被广泛应用于食品、生物工程、医药、有机合成、环境分析及地质材料等领域[3]，在分离天然产物方面具有一般色谱技术不可比拟的优势[4]。蜜桔黄素是柑橘中一种多甲氧基黄酮，在食品添加剂领域有广泛的应用，其化学结构式见图1。蜜桔黄素具有减少人体中红细胞聚集和降低血液细胞沉淀速率的作用[5]，可诱导白细胞抑制HL－60白血病细胞的生长[6]。另外蜜桔黄素还具有溶解
高速逆流色谱法纯化制备蜜桔黄素
张良华，杜琪珍*
(浙江工商大学食品与生物工程研究所，杭州310012)
摘要：建立高速逆流色谱法纯化制备蜜桔黄素的方法。高速逆流色谱溶剂系统为乙酸乙酯-石油醚-甲醇-水(1∶1∶1∶1，v/v)，下相为固定相，上相为流动相，从柑橘皮中纯化制备出蜜桔黄素，经高效液相色谱分析纯度为96.2%。关键词：高速逆流色谱；蜜桔黄素；核磁共振中图分类号：TS202.3文献标志码：A文章编号：1005-9989(2009)01-0156-03
Preparativepurificationofnobiletinbyhigh-speedcountercurrentchromatography
ZHANGLiang-hua,DUQi-zhen*
(InstituteofFoodandBiologicalEngineering,ZhejiangGongshangUniversity,Hangzhou310035)
Abstract:Anewmethodforpreparativepurificationofnobiletinwasestablishedbyusinghigh-speedcoun-
tercurrentchromatography(HSCCC).TheHSCCCseparationusedethylacetate－petroleumether-methanol－water-(1∶1∶1∶1,v/v)asasolventsystem.Finally,thenobiletinproductwithapurityof96.2%wasobtained.Keywords:high-speedcountercurrentchromatography;nobiletin;NMR
收稿日期：2008-04-18*通讯作者作者简介：张良华(1983—)，男，硕士研究生，研究方向为天然产物提取与分离。
提取物与应用·156·FOODSCIENCEANDTECHNOLOGY
食品科技
2009年第34卷第1期
癌细胞的性质，并对冠心病病人的血液循环起作用。本文首次运用高速逆流色谱对柑橘皮中的蜜桔黄素进行了纯化。
1实验材料与设备
1.1实验材料
衢州椪柑；20cm×20cmSillcagel60F254薄层层析色谱板：Merck德国；甲醇、石油醚、乙酸乙酯、乙酸：分析纯；娃哈哈纯净水。1.2主要仪器设备
HSCCC-D1000制备型高速逆流色谱仪：浙江工商大学逆流色谱研究室；Waters510恒流泵：Waters美国；BSZ-100自动部分收集器：上海沪西分析仪器厂；N-1000旋转蒸发仪：上海爱朗仪器有限公司；Waters－AcquityUPLC：America；电子天平：AY-120，Shimadzu，Japan；BrukerA－VANCEDMX500核磁共振仪。
2实验方法
2.1样品的预处理
衢州椪柑剥皮，烘干，取2kg破碎成2～5mm直径大小。用90%的乙醇在60℃下提取2h，减压蒸发得浸膏，将浸膏溶于5L蒸馏水中，分别用等体积石油醚、乙酸乙酯、氯仿、正丁醇萃取，萃取物减压蒸发得石油醚浸膏10g、乙酸乙酯浸膏15.5g、氯仿浸膏30g，正丁醇浸膏35g。取其中的乙酸乙酯相浸膏进行高速逆流色谱分离。2．2高速逆流色谱分离条件的摸索
对于逆流色谱仪而言，影响分离效果的主要因素是螺旋管柱中固定相保留值SF的大小。固定相在逆流色谱仪转动过程中的保留值除受到溶剂系统本身性质的影响外，主要与逆流色谱仪的转速和流动相的流速有关。本实验对溶剂系统达到平衡状态时，不同的逆流色谱仪转速和流动相的流速条件下，对溶剂系统在色谱中的固定相的保留值进行了研究，从而确定高速逆流色谱分离的最佳条件。2.2.1色谱仪转速对溶剂系统固定相保留值的影响在保持流动相流速不变时(1.0mL/min)，改变逆流色谱仪的转速(200～1000r/min)，溶剂系统达到平衡状态时，固定相的保留情况如图2所示。由图2可知，当转速达到600r/min以上时，溶剂系统的保留值保持在60%以上，可以得到较好的分离效果；随着逆流色谱转速的增大，溶剂
系统在色谱柱中达到平衡时的固定相保留值会逐渐增大，当转速为800r/min时，固定相保留值可达到86%；当转速达到1000r/min时，固定相保留值增加到89%。但是转速过快，会影响仪器的平衡，甚至损坏仪器，不利于实验的顺利进行。因此，本次实验逆流色谱仪的转速定为800r/min。2.2.2流动相流速对溶剂系统固定相保留值的影响固定逆流色谱仪转速为800r/min，进样量保持在2g，设定流速为0.3、0.6、0.9、1.2、1.5mL/min的条件下，观察溶剂系统在逆流色谱仪中达到动态平衡时，固定相保留值的变化情况，结果如图3所示。
由图3可知，转速固定时，流动相的流速增大，会导致固定相的流失加快，从而保留值降低。当流动相的流速为0.9mL/min时，固定相保留值为75%；当流动相的流速增加到1.2mL/min时，固定相的保留值降低到50%。虽然流速逐渐降低，会有较为满意的保留值，但是流速太慢，必然会影响到分离的速度，导致分离时间的延长。综合上述因素，选定HSCCC分离实验的流动相流速为0.9mL/min。综合以上因素，最终确定高速逆流仪器转速800r/min，溶剂系统为乙酸乙酯-石油醚-甲醇-水-(1∶1∶1∶1，v/v)，上相做固定相，下相做流动相，流动相流速0.9mL/min。馏分经薄层色谱TLC分析后用15mL试管收集，真空浓缩干燥。2.3高效液相色谱分析
采用高效液相色谱法检测高速逆流色谱分离后的产品纯度。HPLC分析条件：YMCODSC18色谱柱(5μm，250mm×4.6mmi.d.)；检测波长为254nm；流动相为甲醇∶水=75∶25(v/v)，流速1mL/min。
100806040200保
留值/%
02004006008001000转速/(r/min)图2不同转速条件下固定相的保留值
保留值/%10080604020000.30.60.91.21.5流速/(mL/min)图3不同流速对固定相保留值的影响
提取物与应用
·157·FOODSCIENCEANDTECHNOLOGY
食品科技
2009年第34卷第1期
图4乙酸乙酯提取物的HPLC分析图谱蜜桔黄素2000.00AU
0.005.0010.0015.0020.0025.0030.00
2468101214161820242628303234363840424446图5逆流色谱纯化后各组分的TLC分析图谱
图6逆流色谱纯化后蜜桔黄素的高效液相色谱图
2.4核磁共振鉴定单体结构通过BrukerAVANCEDMX500核磁共振仪对单体结构进行鉴定。3结果与分析3.1乙酸乙酯提取物的高效液相色谱分析图4是乙酸乙酯提取物的HPLC分析图谱，结果表明乙酸乙酯提取物中除蜜桔黄素外仍存在大量的其他成分，因此需要进一步纯化制备出蜜桔黄素。3.2逆流色谱分离图5是乙酸乙酯提取物经高速逆流色谱分离收集的馏分经TLC分析的图谱，分别收集2~8管、10~14管、16~42管中的馏分。最终结果表明，16~42管含有蜜桔黄素，2~8管、10~14管为其他成分。16~42管经高效液相色谱分析其纯度为96.2%(面积归一法)如图6，已经到达了通过核磁共振鉴定单体结构的要求。3.3核磁共振图谱解析化合物为针状结晶，Mp134℃，质谱APCI—MS：m/z403，[M+H]+，结合数据确定分子式为C21H22O8，不饱和度为11。化合物在254nm紫外灯下和碘蒸气下均能显色，说明分子中含有苯环、共轭烯键等有紫外吸收的或易氧化的官能团。化合物的1H-NMR、13C-NMR核磁数据归属表明其为多甲氧基黄酮。1H-NMR显示有6个甲氧
基，位于δH3.70到4.10之间，13C-NMR也能显示
有6个甲氧基信号δc62.28、62.17、61.89、61.79、
56.05、56.02；图谱上没有出现黄酮类化合物A环质子共振信号，表明在C-5、C-6、C-7、C-8位上均为甲氧基。化合物B环区域的图谱显示有3个质子，具有ABX系统信号特征：δH7.49(C-2＇)、
7.10(C-5＇)、7.59(C-6＇)，其中δH7.10(C-5＇)、7.59(C-6＇)互相偶联，耦合常数J=8.0Hz，是苯环上典型的邻位氢原子特征值，因此推断出分子中有两个氢原子在邻位。化合物的13C-NMR数据归属显示该化合物分
子中含有21个碳原子，应为4个CH(δc106.66、
109.20、112.21、119.67)、11个季碳原子(δc160.63、176.20、147.95、143.92、1521.33、138.07、147.57、114.72、123.52、149.40、152.14)和6个甲氧基碳原子(δc62.28、62.17、61.89、61.79、
56.05、56.02)。
综合分析化合物的1H-NMR、13C-NMR数据
归属及相关参考文献[7]，表明其为蜜桔黄素(No－biletin)。
4结论
2kg椪柑皮在经过高速逆流色谱法纯化制备后得到纯度为96%的蜜桔黄素0.53g，实现了椪柑
0.005.0010.0015.0020.0025.0030.001.501.000.500.00A
U
实验号1HδH(mult.,J)/Hz13Cδc(mult.J)/Hz
2160.63(s)36.80[1H,S]106.66(d)4176.20(s)5147.95(s)6143.92(s)7151.33(s)8138.07(s)9147.57(s)10114.72(s)1123.52(s)27.49[1H,S]109.20(d)3149.40(s)4152.14(s)57.10[1H,d,J=8.0Hz]112.21(d)67.59[1H,d,J=8.0Hz]119.67(d)
