地高辛标记系统

Specificity: DIG antibodies do not bind other substrates. Versatility: Use DIG labeled probes for filters and in situ hybridization. Proven: Thousands of publications show why DIG is superior to radioactivity.
Labeling
PCR DIG Probe Synthesis Kit DIG Northern Starter Kit In Vitro Transcription DIG RNA Labeling Kit (SP6/T7) DIG RNA Labeling Mix
according to the current quality procedures. With DIG-labeled probes, you can easily detect single-copy genes on Southern blots, unique mRNAs on northern blots, or rare recombinants in bacterial colonies or viral plaques.
The DIG System
Labeling and Detection of Nucleic Acids
The DIG System Specifically Label and Detect Nucleic Acids
Publishable results require high level specific detection and low background. Do your hybridizations have nonspecific signals and high background? The DIG System is ideal for nucleic acid labeling. Flexibly use colorimetric, luminescent or fluorescent signal detection. Achieve high sensitivity and low background in very short exposure times

DIG-dUTP:dTTP的理想比例1：3 20-25bp 可插入一个DIG-dUTP
随机引物法标记的探针是基于模板的不同 区段、不同长度的DNA 片段
可以探测0.03-0.1pgDNA
标记步骤(20µl)
将10ng-1µg 模板DNA用无菌去离子水补足至16µ l。 沸水浴或干浴98 ºC 10分钟，使DNA变性成单链并
Maleic acid buffer: 0.1M Maleic acid, 0.15M NaCl; adjust with NaOH(solid) to pH 7.5(20℃)0 15-25℃ stable. Dilution of Blocking solution.
Detection buffer: 0.1M Tris-HCl, 0.1M NaCl, pH 9.5(20℃). 15-25℃ stable. Ajustment of pH to 9.5.
用作探针模板的DNA应是线型的，大于100bp，如果模板 DNA >5kb则应用4碱基的限制性内切酶切割成较小片段 （切割后要纯化）
模板的量：10ng-3μg，如果要检测复杂基因组中的单拷贝 基因，标记模板的最低量要300ng（探针浓度：25ng/ml 杂交液）
如果做基因组DNA southern blotting, 应将克隆倒载体上 的DNA 酶切后琼脂糖电泳分离或PCR扩增，得到的片段 都需要用试剂盒纯化
操作基本要求
工作环境及试剂要干净：（1）试剂要高 压灭菌；（2）含有SDS 的试剂要过滤灭 菌；（3）TWEEN20应加到预先灭菌过的 试剂中
用具要干净：用之前一定要清洗得非常干 净
操作尼龙膜时要小心（1）戴无尘手套； （2）用干净的镊子夹取膜的边缘

尼龙膜上 固定：2 × 的SSC短暂洗涤膜后 120ºC 30
min 或80ºC 2h；或者将膜放在用10× 的 SSC 浸湿的滤纸中UV-Crosslinkering 不马上使用的尼龙膜放在2-8 ºC干燥保存
电泳、转膜、预杂交注意事项
电泳时最好点上约5µl的地高辛标记的marker 电泳时DNA 的量不要过大，否则部分降解的DNA 片段就会与探针杂
探针标记效率低的原因及解决办法
1. 标记条件不合适
重新标记，但将标记时间延长至过夜 用相同量的模板标记，但体系放大，体系 中的其它成分相应放大 模板放在沸水中变性
2. 模板不纯
只用高纯度模板 用推荐的试剂盒准备模板 纯化模板：用苯酚/氯仿抽提后用酒精沉淀
DNA 的转移和固定
基因组按常规方法酶切、电泳 用20× 的SSC 将DNA 转移至带正电荷的
Maleic acid buffer: 0.1M Maleic acid, 0.15M NaCl; adjust with NaOH(solid) to pH 7.5(20℃)0 15-25℃ stable. Dilution of Blocking solution.
Detection buffer: 0.1M Tris-HCl, 0.1M NaCl, pH 9.5(20℃). 15-25℃ stable. Ajustment of pH to 9.5.
TE buffer: 10mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH 8.0. 15-25℃ stable. Stopping color reaction.
试剂准备（2）
Blocking solution :用Maleic acid buffer 10×稀释试剂6# （10×Blocking solution ），成1×的工作液，即每9ml Maleic acid buffer中加入1ml 10×Blocking solution 混匀， 现配现用。封闭膜上非特异性结合位点

地高辛标记的dUTP
地高辛标记系统的特点
标记和检测技术安全 标记的探针稳定可以保存一年 杂交液可以反复使用数次
与放射性同位素标记方法相同之处
标记和杂交技术相似 高灵敏度 低背景 可以标记DNA、RNA 或Oligonucleotides
与放射性同位素标记方法不同之处
TE buffer: 10mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH 8.0. 15-25℃ stable. Stopping color reaction.
试剂准备（2）
Blocking solution :用Maleic acid buffer 10×稀释试剂6# （10×Blocking solution ），成1×的工作液，即每9ml Maleic acid buffer中加入1ml 10×Blocking solution 混匀， 现配现用。封闭膜上非特异性结合位点
根据地高辛抗体连接的偶合物不同，利用荧光检 测（anti-DIG-fluorescein，rhodamine)、化学发 光检测(anti-DIG-AP and CSPD or CPD-star)或显 色（anti-DIG-AP and NBT/BCIP or other substrates))的方法将探针杂交的位置显现出来
Antibody solution(Ab) solution : 将4#试剂离心，按1： 5000或1：10000加入Blocking solution，2-8 ºC可放12小 时。（每10ml Blocking solution 加1ul Ab抗体即可）.与 地高辛标记的探针结合。
Color-substrate solution（显色液）：从试剂 5#(NBT/BCIP)中取100ul到5ml Detection buffer，要避光， 现配现用。显示抗体结合的位点