ELISA试剂盒问题解答手册

技术问题问答序言为了更好的让广大客户了解ELISA试剂盒操作过程中出现问题及原因，特将大家普遍认为比较容易出现的问题进行归纳、整理成册，并回馈给广大的客户。

本手册提到的问题均为分析手段，并未牵涉到具体实例，您可以根据相应的具体问题进行具体分析。

在具体实验操作中，如本手册中未体现，希望大家及时与我们取得联系。

贵州勤邦食品安全科学技术有限公司问题与解答1.药物残留实验前处理过程中实验耗材（如离心管、玻璃管）重复使用最理想的洗涤方法是什么？实验完成后,先用流动自来水冲洗干净,再加入洗涤剂超声2h, 然后再用自来水冲洗干净，最后用去离子水清洗1到2次，60℃完全烘干后待用。

建议：超高阳性样本所使用的离心管或玻璃试管不再重复使用。

2.药物残留检测实验中对水质的要求：三蒸水、蒸馏水、纯净水还是去离子水？理论来说这几种水都可以满足分析要求,但对于某些项目来说还是有一定的区别,最好使用去离子水和三蒸水，蒸馏水和纯净水一般仅用于洗涤液的配置。

3.器具污染所造成的途径有那几种？①检样过程中出现含量较高的阳性样品;②实验器具没有清洗干净;③高浓度标品贮备液保存不当造成污染。

建议：容易被污染或者使用周期较长的实验器具, 定期（3-5个月）更新一次。

4.ELISA方法可用于检测药粉样品吗？针对不同成分的样品, 通过对应的样品前处理方法,消除干扰后, 可以用ELISA方法进行检测，但应防止与药残实验交叉污染。

5.同样一个样品，称取两个样检测两次，两次值差别较大，是取样原因还是板间的变异？正常情况下,板孔间的变异不会对样本的检测结果造成绝对的影响；样品的取样、前处理过程和分析过程中的操作误差是影响结果差别较大的主要原因。

6.药物残留实验前处理样品过程中所用的氮气是不是可换用压缩空气？空气中的氧气是否会对药物产生氧化作用，进而影响试验结果？一般情况下需要检测的目标物是非常稳定的药物，可以用压缩空气替换氮气, 药物的氧化在此不会产生，如有特殊药物有氧化情况，说明书上会有明确标注。

7.将肉中药物残留成份转移到提取液中，最佳的离心力、离心时间是多少（不同的试剂盒离心时间不一样）？一般情况下，转速4500r/min, 离心时间5min到10 min ,离心力大于3000g即可。

8.呋喃四项检测是衍生化孵育时间和孵育温度多少为最佳？37℃过夜孵育14到16h为最佳孵育环境,有实验证明过最低可以缩短至12小时,但对于高阳性样本来说可能会出现差异,建议使用14-16h.60℃孵育3h需严格遵守孵育时间。

若时间允许的情况下，建议使用37℃过夜孵育，以便使药物冲分衍生化，能有效提高高阳性样本检测结果的准确性9.添加回收率的测定方法是什么？添加回收实验时，添加浓度多少为好？添加回收实验是验证整个实验过程检测结果的准确度。

不同的试剂盒的不同种类的样本, 按照说明书中对应的样本前处理方法进行实验。

在添加的时候尽量避免在最低检测限以内或者超出试剂盒曲线外的添加，建议添加的最适浓度参照所需检测目标药物在相应组织中的判定限或定量限。

同时，添加时根据具体的添加浓度对添加的高标进行适当的稀释,保证添加的准确性。

如硝基呋喃类药物组织的定量限为0.5ppb，添加回收时0.5ppb为最适添加浓度。

添加回收的体积公式:V=C*1000M/P,其中:V为添加的高标准体积（ul）,C为添加的浓度,P为高标准的浓度(ppb),M为样本的质量(g)。

10.脂肪存在为什么会造成试验的假阳性率比较高？在提取过程中, 容易造成乳化, 对样本进行不正常的浓缩，易与杂质混合难以分离。

乳化后一般利用60℃水浴加热半小时,最好是先把上层有机相去除后再利用水浴加热较好.第二种解乳化的方法是把整个乳化后的样本全部放入冰箱-20℃急冻室急冻30min或更长，回温后去除上层有机相再次离心后去上清液，取下层进行分析。

如氯霉素或其他在加入正已烷再加入复溶液进行操作时，可在加入正已烷后充分涡动1-2分钟，然后加入复溶液后涡动5-10s，即可在一定程度上防止乳化造成。

又如硝基呋喃类代谢物的前处理中加入乙酸乙酯后形成乳化层，不易取到相应的量，可以在加入乙酸乙酯时，放大加入的量，然后取液相应增加，保证稀释倍数不变，也可在一定程度上防止乳化形成。

11.样品OD值落在药残标准曲线的那一区间值精确度最高？一般在第三和第四标准之间精确度较高, 但是不同的试剂盒曲线的局部差异, 精确区间会稍有变化。

一般在曲线上的近似直线段范围内较为准确．12.OD值偏低由什么因素引起的?整板ＯＤ值偏低:✓反应温度偏低;✓反应时间不够;✓洗板时间过长或次数过多;✓点板时环境温度过低；✓酶标仪故障波长错误；钨光灯寿命将近,导致光强变弱)；✓试剂盒有效期已过或将过；✓某些试剂盒标准品需要稀释才能使用或试剂稀释倍数错误（如四环素类）；✓试剂盒中的某些试剂变质或污染；✓不同试剂盒混用，✓试剂盒的回温时间较短；✓试剂盒保存未按规定的方法或环境保存；✓试剂盒处于极端条件下，比如放在贴着冰箱壁，试剂冻伤。

样本的ＯＤ值偏低:✓样本的阳性太高（可做空白样本及阳性样本对照试验），✓某些试剂盒的样本需要调节ＰＨ的没有调节到需要的ＰＨ范围；✓某些试剂盒的复溶液需要稀释后才能使用的没有经过稀释；✓样本前处理时没有去掉上层有机相，加样吸取到上层有机相；✓样本被污染；✓样本与标准品的温度相差太多（样本温度低）；✓样本前处理时使用的水质量不合格；✓样本前处理过程中所使用的试剂质量有问题（可做试剂空白对照）；13.样本的吸光度值为什么会超出曲线上最大ＯＤ值？✓标准品回温时间不够；✓样本中含有非样本基质的物质，如有机溶剂；✓样本复溶液稀释错误或直接利用去离子水作为复溶液；✓标准１被污染；✓反应时间错误，导致标准品的ＯＤ值不上升而样本的ＯＤ值继续上升，注：此种情况下，样本的抑制率在100%--110%范围内，一般可以初步判断样本为阴性样本。

若大部分样本的抑制率远超过110%，建议电话咨询或者重复实验。

14.氮吹仪为什么需要水浴或者铁浴？氮气或空气主要吹主要增加了液体与气体的接触面积，水浴或者铁浴加热是为了使有机溶剂挥发的速度更快一些，以达到节约时间的目的。

15.样本检测结果在曲线之外如何判定?把处理好的样本液用复溶液进行梯度稀释后，再进行检测.使之OD值在曲线近似直线段范围内为最佳。

16.氮吹仪吹干步骤为什么要50-60℃进行水浴或铁浴?有机溶剂的沸点一般在60-90℃不等,而水浴的温度一般较溶剂的沸点略低为佳,故对于一般的有机溶剂,可以选用50-60℃的水浴进行加热.但对于某些沸点较高的试剂,比如乙腈等沸点在80℃以上的有机溶剂吹干的时候可选用65-70℃水浴进行加热.但是温度不宜过高.注：对于混合有机溶剂一般来说沸点会有所降低.相应的水浴温度也应稍微降低。

17.勤邦公司ELISA试剂盒的洗板液是否可以通用？勤邦ELISA试剂盒内20X洗涤液成份是相同的，不同试剂盒之间可以通用。

但是，建议不使用相隔时间较长的洗液，同时配置好的洗液在室温下放置一周后需重新配置。

建议:首先明确该试剂盒说明书上是否是20X洗涤液。

18.样本吹干后保存问题。

样本吹干后建议立即进行复溶后点板，尽量不进行保存，如果确实需要进行保存的，首先请电话咨询，若能保存，最好是选择吹干后放置于2-8℃冰箱进行保存，如果是已经复溶好的样本，需要用封口膜进行封口后方可放置于2-8℃冰箱保存。

另外有些样本是不能放置在玻璃里面进行保存的，如喹诺酮类药物吹干后不能进行保存，如果需要保存，则要复溶后转移到塑料瓶中方可放置于2-8℃冰箱进行保存。

一般说来，样本保存时间不超过12小时。

19.试剂盒在保质期内OD值偏低，但标准品有梯度，可否继续使用？试剂盒在保质期内OD值偏低可能是保存环境影响所致。

若实验数据标准品有梯度、标准品1的OD值大于0.5，可以分析实验结果，但是实验结果只可做为相对判定依据，而不能做为定量检测结果。

20.回收率长期偏高或偏低，是否正常？国家对试剂盒的回收率范围要求较宽（40%-130%），如果在稳定的前提下出现试剂盒的回收率长期偏高或偏低是正常的，也可以做为判定依据。

需要在检测结果的检测值除上回收率即是该样本的相对准确检测结果。

如果有阳性样本的情况下，最好是使用确证后的阳性样本进行复核实验为佳。

21.ELISA方法在方法及操作均无问题的情况下，能否出现假阳性或假阴性？ELISA方法本身的特点是具有半定量的性质，一般允许有一定比例的假阳性（国家要求在10%以下），但是不能出现假阴性检测结果。

22.样本处理过程中出现稀释倍数问题时，如何计算？样本处理过程中出现的稀释均为：在无损失的情况下，每毫升样本液中溶解的样本质量或体积，如2g样本在无损失的情况下处理完成后溶解于1ml样本液中，则表示该方法的稀释倍数为0.5倍，如0.5g样本在无损失的情况下处理完成后溶解于1ml样本液中，则表示该方法的稀释倍数为2倍，如2g样本在无损失的情况下处理完成后溶解于0.5ml样本液中，则表示该方法的稀释倍数为0.25倍。

23.没有结晶水的试剂在配置溶液时，该如何换算？没有结晶水的试剂在配置溶液时，应该取该试剂需要的物质的量乘上分子量后才是需要的试剂的重量。

如：说明书上需要n g分子量为M1的有结晶水的物质，如果在没有的情况下，需要用分子量为M2的没有结晶水的物质代替时，则需要的分子量为M2的物质重量为n*M2/M1。

24.配置好的试剂保存问题。

配置好的无机试剂一般可以保存2-3个月，保存环境可以选择在室温，避光，阴凉处进行密封保存;洗液、复溶液等与抗原抗体直接接触的试剂选择在2-8℃冰箱里进行保存；有机混合溶液或有机和无机混合溶液保存的时间原则上不能超过1个星期，室温保存，最好是现配现用。

25.标准曲线的线性要求达到多少为好？标准曲线的线性直接反应该实验的优劣，理论上应该无限接近1。

在实际操作中主要还是以标准曲线判定为主，相关系数判定为辅，在曲线较好的情况下，相关系数只要能达到0.98以上即可做为半定量检测结果判定依据。

如果低于0.98，如果标准曲线没有问题的情况下也是可以作为相对定性进行判定。

26.点板时，加样量错误会导致结果如何？由于该方法为生物法，其反应基理非常复杂，如果加样的量错误，可能会导致不可预料的结果，建议具体问题具体分析，可电话咨询。

27.怎样降低实验器材对实验带来的干扰？严格按照国家规定对相应的实验器材进行实验操作。

28.如何根据颜色深浅进行延时或缩短时间？对于有经验的实验员来说，颜色与OD值的关系很容易进行把握，如果颜色所示的OD值达到一定的程度即可进行终止。

如果颜色过早达到一定的OD值范围，即可提前进行终止，反之则延长反应时间，但不得超过10分钟。