ELISA试剂盒实验教程

ELISA检测试剂盒操作流程1.准备实验材料和试剂-检验样本：例如血清、尿液、细胞上清液等。

-ELISA试板：根据样本数量选择96孔或384孔的板。

- 试剂盒：包括标准品、washes缓冲液、检测抗体、底物等。

2.样本处理-对于血清等生物液体样本，可用离心将固体物质沉淀并分离下清液。

-样本需储存或运输途中应避免反复冻融。

3.实验板的板液处理-将实验板从包装中取出，将不需要的孔进行盖膜封闭。

- 根据试剂盒说明书，添加适量的板液（Coating Buffer）到每个孔中，使其充分覆盖孔内壁。

-封闭板液的孔，将实验板在2-8℃下放置静置一夜或在37℃下1-2小时孵育。

4.样本添加-倒掉盘液，用PBS或TBST洗板3次，去除残留物。

-将样本加到每个孔中，根据需要添加正样本、负样本和待测样本。

-注意每个样本的剂量和添加的体积，通过试剂盒说明书和实验设计标准控制。

5.抗体添加-清洗步骤同上，将洗板缓冲液加到孔中，重复3次。

-加入检测抗体，根据试剂盒说明书的建议将其添加到孔中。

-要确保抗体的浓度和添加的体积适宜。

6.洗涤-洗涤步骤同上，用洗涤缓冲液洗板，重复3次。

-每次洗涤时，将洗液完全加满孔，静置1分钟，然后倒出洗液。

-注意洗涤时间和洗涤次数的准确控制，以将非特异性结合物质彻底清除。

7.底物添加-清洗步骤同上，将洗液加到孔中，重复3次。

-加入底物，根据试剂盒说明书的建议将其添加到孔中。

-底物液体应完全覆盖孔底，防止反应过程中氧化。

8.反应停止-根据试剂盒说明书，将反应停止液加入到孔中，停止底物的反应。

-注意反应停止液的体积和浓度，以保证反应的准确停止。

9.色谱分析-用ELISA板读板仪读取各个孔的OD值。

-根据试剂盒说明书和实验设计的标准曲线确定样本中目标物质的含量。

-注意设置适当的控制组和标准曲线来保证测量结果的准确性。

总结：ELISA检测试剂盒的操作流程主要包括实验板处理、样本添加、抗体添加、洗涤、底物添加、反应停止和色谱分析。

ELISA试剂盒操作方法Elisa试验广泛应用在免疫学检验的各领域中，那么Elisa试验有没有简单便捷的操作方法呢？ELISA试剂盒操作方法具体如下：ELISA试剂盒操作方法一:用于检测未知抗原的双抗体夹心法:1.包被：用0.05MPH9.牰碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1～10μg／ml。

在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜。

次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。

（简称洗涤，下同）。

2.加样：加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时。

然后洗涤。

（同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔）。

3.加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体（经滴定后的稀释度）0.1ml。

37℃孵育0.5～1小时，洗涤。

4.加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分钟。

5.终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。

6.结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。

也可测OD值：在ELISA检测仪上，于450nm（若以ABTS显色，则410nm）处，以空白对照孔调零后测各孔OD值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。

ELISA试剂盒操作方法二：用于检测未知抗体的间接法：1.用包被缓冲液将已知抗原稀释至1～10μg／ml，每孔加0.1ml，4℃过夜。

次日洗涤3次。

2.加一定稀释的待检样品（未知抗体）0.1ml于上述已包被之反应孔中,置37℃孵育1小时,洗涤。

（同时做空白、阴性及阳性孔对照）3.于反应孔中，加入新鲜稀释的酶标第二抗体（抗抗体）0.1ml，37℃孵育30-60分钟，洗涤,最后一遍用DDW洗涤。

4.于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分钟5.于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml6.可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。

ELISA试剂盒操作方法ELISA（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay）是一种常用的免疫学试验技术，用于检测体内或体外的蛋白质、抗体、抗原等物质。

ELISA试剂盒是用于进行ELISA实验的一种常见装置。

下面将为您介绍ELISA试剂盒的操作方法。

1.准备工作a.预热-将试剂盒中的所有试剂预热到适当的温度，通常为室温至37°C之间。

b.样品处理-准备好待测样品，可以是血清、细胞上清液、组织提取物等。

如果样品中含有大量的蛋白质或杂质，可以进行样品处理，如稀释、蛋白质去除等。

c.标准品准备-试剂盒通常包含一系列浓度已知的标准品，用于制作标准曲线。

按照说明书的要求，用缓冲液或适当的稀释液将标准品稀释为不同浓度的工作液。

2.涂膜板的处理a.涂膜板选择-根据实验需求选择合适的涂膜板，通常有96孔、384孔等。

b.板钉定位-使用板钉或其他适当的方法将涂膜板固定在适当的工作台上。

c.预涂底物溶液加入-将试剂盒提供的预涂底物溶液加入涂膜板的孔中，注意保持各孔液面平整。

3.样品与试剂添加a.标准品和样品加入-按照实验设计的需要，将标准品和待测样品分别加入涂膜板的孔中。

b.阳性对照和阴性对照加入-根据试剂盒的要求，加入阳性对照和阴性对照。

c.洗涤液加入-在每次试剂或样品加入后，使用专用的洗涤液将孔洗涤，以清除无关物质。

4.反应与显色a.结合抗体加入-按照试剂盒说明书要求，加入适当的结合抗体，用于与待测物质结合形成复合物。

b.二抗加入-加入带有底物标记的二抗，与结合抗体结合形成复合物。

c.显色底物加入-加入含有适当底物的显色底物试剂，使底物与酶结合并发出信号。

5.反应停止与测量a.反应停止液加入-在适当的时间点，根据试剂盒的说明，加入反应停止液，停止底物的酶反应。

b.光密封膜或保护板加盖-加盖光密封膜或保护板，防止溶液蒸发或污染。

6.读取和数据处理a.读取吸光度-使用ELISA读板仪读取各孔的吸光度值。

E L I S A试剂配制及实验流程—B D YThe document was finally revised on 2021ELISA试剂配制及实验流程ELISA是酶联接免疫吸附剂测定(( Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay )的简称。

以双抗体夹心法举例说明。

试剂配制：(1) 包被缓冲液 + 碳酸盐缓冲液)：Na2CO3NaHCO3加蒸馏水至1000ml。

（用时稀释成1x，加%BSA）(2) 洗涤缓冲液 0.15M PBST)：%Tween-20加在PBS缓冲液1000ml中。

PBS缓冲液：KH2PO40.27gNa2HPO4·12H2O 3.58gNaCl 8gKCl加蒸馏水至1000ml。

(3) 封闭缓冲液：牛血清白蛋白(BSA) 2% 2g（或5%脱脂奶粉）加洗涤缓冲液100ml。

(4) 稀释液：牛血清白蛋白 %加PBS 缓冲液100ml。

(5) 底物缓冲液：Na2HPO4(无水L，带12结晶水L) 取柠檬酸(无水L，带1结晶水L) 取加蒸馏水至100ml。

(或Na2HPO4·12H2O 1.84g柠檬酸·H2O 0.51g加蒸馏水至100ml)(6) TMB(四甲基联苯胺)显色液（显蓝色）：HRP-TMB(2mg/ml水)底物缓冲液30% H2O 2总体积1ml。

TMB, 1mg/ml-DMSO溶解(7) 或配OPD(邻苯二胺)显色液（显黄棕色）（现配避光）：OPD（干粉） 0.004g底物缓冲液 10ml30% H2O2总体积10ml。

(8) 终止液(2M H2SO4)：在水中，逐滴加入浓硫酸(18M，约98%)，边加边摇。

操作步骤：1. 包被：用包被液将抗体（一抗）稀释至蛋白质含量为1~10μg/ml。

在每板的反应孔中加，4℃过夜（或37℃温育2~3小时）。

次日，弃去孔内溶液，用洗涤液冲洗3次，中间振荡。

(简称洗涤，下同)。

ELISA试剂配制及实验流程ELISA(酶联免疫吸附实验)是一种常用的免疫学实验技术，用于检测抗体或抗原的存在与浓度。

ELISA试剂是ELISA实验中的关键组成部分，正确配制试剂和正确的实验流程对于实验结果的准确性和可靠性至关重要。

一、ELISA试剂的配制1. 背景缓冲液（Coat buffer）：该缓冲液用于包被酶标板上的抗原或抗体，并且用于洗涤步骤中的洗板缓冲液。

配制方法：将10 mL Tris缓冲液（100 mM，pH 9.6）加入0.15 g NaCl，搅拌溶解，最后加入一滴Tween-20或其他润湿剂。

2. 试样稀释液（Sample buffer）：该缓冲液用于稀释试样，使其适应ELISA实验的测量范围。

配制方法：根据试样的含量和要求进行合适的稀释，一般可选择PBS （含0.05% Tween-20) 来稀释。

3. 标准品（Standard）：该物质用于建立标准曲线，以根据样品的读数来确定样品中目标物的浓度。

配制方法：首先通过相关实验确定标准品的初始浓度，使用稀释液进行逐步的2倍稀释，以获得不同浓度的标准溶液。

4. 酶标抗体（Enzyme labeled antibody）：该抗体与目标物结合，可与酶底物发生反应产生荧光或颜色。

配制方法：根据抗体的浓度和信号放大的要求，将抗体稀释在稀释液中。

5. 底物液（Substrate solution）：在酶底物的作用下产生颜色，用于测定目标物的浓度。

配制方法：根据酶底物的要求和实验条件，按照相应的方法配制底物液。

二、ELISA实验流程1.包被抗原或抗体：加入适量的抗原或抗体至酶标板孔中，在4°C 下静置一夜或在37°C下孵育数小时，使其吸附到酶标板表面。

吸附后，将酶标板孔洗涤干净以去除未结合的物质。

2.阻断：将阻断液加入酶标板孔中，避免非特异性结合，阻断剂一般为牛血清蛋白、鱼胶蛋白等。

孵育一段时间后，洗涤酶标板孔以去除阻断液。

ELISA操作规程一、实验目的本实验旨在通过酶联免疫吸附试验（ELISA）的操作，检测目标物质的存在与浓度，以实现对生物样本中特定抗原或抗体的定量分析。

二、实验材料1. 96孔ELISA板2. 目标抗原或抗体样本3. 特异性一抗和二抗4. 辅助试剂：洗涤缓冲液、稀释缓冲液、底物和停止液5. 高精度微量移液器和相应的移液器头6. 高精度电子天平7. 显微镜和酶标仪三、实验步骤1. 预处理：将96孔ELISA板放置在实验台上，加入稀释缓冲液，轻轻震荡混合，然后倒掉液体。

重复此步骤3次。

2. 样本添加：将待测样本加入96孔ELISA板中，每孔加入相同体积的样本。

3. 孵育：将ELISA板盖上密封膜，置于恒温箱中孵育一定时间，使样本中的抗原或抗体与固相特异性一抗结合。

4. 洗涤：将洗涤缓冲液加入96孔ELISA板中，轻轻震荡混合，然后倒掉液体。

重复此步骤3次，以洗去未结合的物质。

5. 二抗结合：将特异性二抗加入96孔ELISA板中，轻轻震荡混合，然后盖上密封膜，继续孵育一定时间，使二抗与固相特异性一抗结合。

6. 洗涤：重复步骤4。

7. 底物添加：将底物加入96孔ELISA板中，轻轻震荡混合，然后暗处孵育一定时间，使底物与二抗结合的酶发生反应。

8. 反应停止：加入停止液，终止底物与酶的反应。

9. 测量：将96孔ELISA板放入酶标仪中，根据实验要求选择相应波长进行测量。

记录各孔的吸光度值。

10. 数据分析：根据实验目的，利用标准曲线或其他方法，计算出目标物质的浓度。

四、实验注意事项1. 实验前需准备好所有试剂和材料，确保实验环境清洁和无尘。

2. 操作过程中需佩戴手套，避免污染样本和试剂。

3. 洗涤步骤中，确保洗涤缓冲液充分覆盖每个孔，且每次洗涤液倒掉后，孔内无残留液体。

4. 孵育和暗处孵育步骤中，需控制好时间和温度，以确保反应的充分进行。

5. 底物和停止液需按照说明书的要求配制和使用，避免使用过期或变质的试剂。

ELISA操作步骤（双抗体夹心法）ELISA操作步骤（双抗体夹心法）1. 包被过程(注意设置空白对照,阴性对照):将所用抗原用包被稀释液稀释到适当浓度，每孔抗原加入100μl, 置37℃,4h,或4℃,24h;弃去孔中液体，(为避免蒸发,板上应加盖或将板平放在底部有湿纱布的金属湿盒中)。

2 PBS洗3次，每次3分钟。

具体为.吸干或甩干孔内反应液；.用洗涤液过洗一遍（将洗涤液注满板孔后，即甩去）；浸泡，即将洗涤液注满板孔，放置1-2分钟，间歇摇动，浸泡时间不可随意缩短；吸干孔内液体，可甩去液体后在清洁毛巾或吸水纸上拍干；.重复操作涤3次。

3. 加入待检测样品(建立合适的浓度梯度):检测时一般采用1:50-1:400的稀释度, 应采用较大稀释体积进行,一般保证样品吸取量>20μl。

将稀释好的样品加入酶标反应孔中，每样品至少加双孔，每孔100μl，置于37℃,40-60min。

4 PBS洗3次，每次3分钟。

5. 加入酶标抗体:酶标抗体: 根据酶结合物提供商提供的参考稀释度进行或建立浓度梯度，37℃,30-60min之间，短于30min往往结果不稳定，每孔加100μl。

6 PBS洗3次，每次3分钟。

7. 加入底物液(现用现配):TMB(四甲基联苯胺)使用液:TMB(10mg／5ml无水乙醇) 0.5ml底物缓冲液(PH5.5) 10ml0.75％H2O2 32μl，底物加入量每孔100μl （TMB空白显色孔除外）,置37℃避光放置20-25分钟。

8. 终止反应:每孔加入终止液50μl(2M H2SO4)终止反应, 此时蓝色立转黄色，于20min内测定实验结果。

9 结果判断:可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅。

也可测吸光值：在ELISA检测仪上，TMB反应产物检测需要450nm波长，检测时一定要首先进行空白孔系统调零。

用测定标本孔的吸收值与一组阴性标本测定孔平均值的比值(P/N)表示，当P/N大于2时作为抗体的效价即大于阴性对照吸光值的2倍，(数值的大小依具体检测要求而定)。

操作步骤1．取出试剂盒室温平衡30min，取出血样放至室温。

2．配标准品：取150uL标准品加入150uL标准品稀释液稀释，依次稀释5次。

3．加样：分别于各反应孔中加入标准品50uL，样品40UL，标准品做复孔，样品做3孔。

4．分别于样品孔中加入10UL抗体。

5．标准品和样品孔中分别加入50uL链酶亲和素-HRP，盖上封板膜,轻轻震荡混匀，37℃温育60min。

6．配洗涤液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用。

7．洗涤：小心揭开封板膜，弃去液体，甩干，每孔加200uL洗涤液，静置30s后弃去，如此重复5次，拍干。

8．显色：每孔先加入显色剂A 50uL，再加显色剂B 50uL，轻轻震荡混匀，37℃避光显色6min。

9．终止：每孔加入终止液50uL，终止反应（此时蓝色立即转为黄色）。

10．测定：以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度。

测定应在加终止液10min 之内进行。

22．保存结果，收拾桌面。

12．分析处理数据注意事项1. 取出板条前恢复到室温后再打开外包装袋，实验中不用的板条立即放回包装中，密闭封口，其余不用试剂应盖好。

2. 实验操作中请使用一次性的吸头，避免交叉污染。

3．实验板孔加入试剂的顺序应一致，以保证所有反应孔的孵育时间一致。

4．洗涤过程中反应孔中残留的洗涤液应在滤纸上充分拍干，勿将滤纸直接放入反应孔中吸水。

5．试剂盒内试剂请在保质期内使用，不同批号试剂不要混用。

6．1000pg/ml以上的结果为非线性的，根据此标准曲线无法得到精确的结果。

大于1000pg/ml 的样品应以标准稀释缓冲液稀释后重做。

在结果分析时，结合考虑相应的稀释度。

ELIS操作流程ELISA操作流程（一）、基本操作流程方法一双抗体夹心法（用于检测未知抗原的）1. 包被：用包被液将抗体稀释至蛋白质含量为0.5～20μg／ml，按100ul/孔加入酶标板，4℃包被过夜。

2. 洗板：次日弃去孔内液体，在纸巾上轻轻扣打以吸去残留液体，加入洗涤液（约280-300ul/孔），漂洗2-3次，每次3-5min；3. 封闭：按200-250ul/孔加入封闭液，室温2-3小时或37℃1-2小时，也可4℃封闭过夜，然后弃去孔内封闭液；4. 样品处理：用洗涤液或样品稀释液将待检样品(含未知抗原)稀释至所需浓度；5. 标准液：用洗涤液或样品稀释液将标准液稀释至所需浓度（定性分析可省略本步骤）；6. 加样：按排列顺序依次加入50-100ul/孔稀释好的标准液、处理过的待检样品、阴性对照及阳性对照，室温或37℃孵育30-60min；7. 洗板：同步骤2；8. 加酶标抗体：酶标抗体的稀释按产品说明书，按50-100ul/孔加入新鲜配制的酶标抗体，室温或37℃孵育1小时；9. 洗板：同步骤2；10. 加底物液显色：按100-150ul/孔加入新配制的TMB底物溶液，室温避光反应15～30分钟。

11. 终止反应：于各反应孔中加入50ul的终止液。

12. 结果判定：可于白色背景上，直接用裸眼观察结果，反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。

也可在酶标仪上于450nm(若以ABTS 显色，则410nm)处测OD值。

检测时以空白对照孔调零后测各孔OD 值，若样品孔中的OD值大于阴性对照孔的2.1倍，即为阳性。

方法二间接法（用于检测未知抗体）1. 包被：用包被缓冲液将已知抗原稀释至0.5～20μg／ml，按100ul/孔加入酶标板，4℃包被过夜，次日洗涤2-3次；2. 洗板：次日弃去孔内液体，在纸巾上轻轻扣打以吸去残留液体，加入洗涤液（约280-300ul/孔），漂洗2-3次，每次3-5min；3. 封闭：按200-250ul/孔加入封闭液，室温2-3小时或37℃1-2小时，也可4℃封闭过夜，然后弃去孔内封闭液；4. 样品处理：用洗涤液或样品稀释液将待检样品稀释致所需浓度；5. 标准液：用洗涤液或样品稀释液将标准液稀释至所需浓度（定性分析可省略本步骤）；6. 加样：按排列顺序依次加入50-100ul/孔稀释好的标准液、处理过的待检样品(含未知抗体),阴性对照及阳性对照，室温或37℃孵育30-60min；7. 洗板：同步骤2；8. 加酶标抗体：按50-100ul/孔加入新配制的酶标抗体（抗抗体），室温或37℃孵育1小时；酶标抗体的稀释按产品说明书；9. 洗板：同步骤2；10. 加底物液显色：按100-150ul/孔加入新配制的TMB底物溶液，室温避光反应15～30分钟。

【检验方法】1.试验前准备（1）缓冲液使用前用蒸馏水或去离子水5倍稀释每瓶样本浓缩缓冲液，最终稀释体积为100ml。

冷藏存储：配好的溶液在2-8℃放置，30天内有效，或标签标注的有效期。

（2）洗液使用前用蒸馏水或去离子水50倍稀释每瓶洗板浓缩缓冲液，最终稀释体积为1000ml。

冷藏存储：配好的溶液在2-8℃放置，30天内有效，或标签标注的有效期。

（3）样本检测前，将所有病人的样本用样本缓冲液1:100稀释。

因此在聚苯乙烯板上应混有10μl的样品和990μl的样品缓冲液。

质控品不需要稀释。

2.试验步骤（1）按需要准备好足够微孔反应板条。

（2）用100μl移液器把质控品和稀释后的病人样本加入到微孔中。

（3）在室温（20-28℃）温育30分钟。

（4）吸取300μl洗液冲洗微孔物质，冲洗3次。

（5）吸取100μl每份酶结合物分加到微孔中。

（6）在室温下温育15分钟。

（7）吸取300μl洗液冲洗微孔物质，冲洗3次。

（8）吸取100μl TMB底物溶液加入到微孔当中。

（9）在室温下温育15分钟。

（10）在每个微孔中加入100μl终止液，在室温下温育5分钟。

（如果酶标仪为读数之前震荡方式可不经5分钟温育后直接进行读数）（11）在450nm波长读取光密度读数并计算结果，如果采用双波长测定，参考波长为600-690nm。

3.程序注意事项（1）试剂的组分应在有效期内使用。

（2）试剂盒各组分不能互换。

（3）所有的实验材料应在室温（20-28℃）下操作。

（4）为了得到稳定和连续性的结果，在测试之前要准备好所有的检测样本，一旦测试开始就不要中断。

（5）严格按标准检测顺序进行检测分析。

（6）使用刚稀释的新鲜样本。

（7）所有的试剂和样本都要加入到微孔底部。

（8）不同样品和不同试剂之间要更换枪头以避免污染。

（9）彻底清洗微孔、除去最后的洗涤缓冲液对得到一个良好结果是非常重要的。

（10）所有的温育过程必须精确计时。

（11）质控品要定期进行检测以保证试剂和检测结果的可信性。

ELISA试剂及溶液配制及实验步骤ELISA（酶联免疫吸附实验）是一种广泛应用于生物化学和生物医学研究领域的分析技术。

它通过酶标记的抗体与目标物结合，并利用酶的催化作用来测量目标物的含量。

下面将介绍ELISA实验所需的试剂及溶液配制以及实验步骤。

一、试剂及溶液配制1.涂板液：将PBS溶液（1X，pH7.4）加入10%胎牛血清（FBS）中，最终浓度为1%。

用该液体涂覆96孔酶标板，在4℃下静置过夜。

涂板液的制备可以在使用前一天进行。

2.阻断缓冲液：根据实验需求选择合适的阻断缓冲液，常用的有3%BSA（牛血清蛋白）或者5%乳清。

3.洗涤缓冲液：配制PBS-T缓冲液（PBS中加入0.1%的Tween-20）。

4.标准曲线样品：按照实验需要选择合适的标准品，并按照厂家提供的方法配制标准曲线样品浓度序列。

5.样品：收集待测物样品，如血清、尿液、细胞上清等。

将样品离心去除杂质，获得清洁的上清液。

6.酶标记的一抗：选择特异性强、纯度高的一抗，如兔抗体、小鼠抗体等。

根据实验目的和待测物的性质选择合适的抗体。

7.酶标记的二抗：选择与一抗宿主不同的宿主动物制备的酶标记二抗。

根据一抗的种类和宿主动物选择相应的二抗。

8.辣根过氧化物酶标记物质（HRP）：将HRP与一抗或者二抗结合，用于检测目标物的存在。

二、ELISA实验步骤1.将涂板液倒出，用PBS-T洗板3次，每次将洗液孔内保持在饱和状态，吸尽孔内液体。

2.加入阻断缓冲液100μL/孔，孵育1小时，此过程是为了避免非特异性结合。

3.吸尽阻断缓冲液，加入稀释好的标准品和样品，每孔100μL，通常每个样品需要取3个重复孔。

同时，加入相同体积的PBS作为空白对照。

4.孵育2小时，室温孵育条件可在37℃下进行。

5.吸尽样品/标准品，用洗涤缓冲液洗板3次，每次将洗液孔内保持在饱和状态，吸尽孔内液体。

ELISA试剂用洗涤缓冲液洗涤是为了去除非特异性结合物质。

6.向每个孔中加入适量的酶标记的一抗，孵育1小时。

ELISA步骤、试剂及注意事项操作步骤方法一用于检测未知抗原的双抗体夹心法：1.包被：用0.05M PH9。

牰碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1～10μg／ml。

在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0。

1ml,4℃过夜。

次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次,每次3分钟。

（简称洗涤，下同)。

2.加样:加一定稀释的待检样品0。

1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时。

然后洗涤.（同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔）。

3。

加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体（经滴定后的稀释度)0。

1ml。

37℃孵育0.5～1小时，洗涤。

4.加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0。

1ml,37℃10～30分钟。

5.终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。

6.结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深,阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。

也可测O·D值：在ELISA检测仪上，于450nm （若以ABTS显色，则410nm）处，以空白对照孔调零后测各孔O·D值，若大于规定的阴性对照OD值的2。

1倍，即为阳性.方法二用于检测未知抗体的间接法:用包被缓冲液将已知抗原稀释至1～10μg／ml，每孔加0。

1ml，4℃过夜.次日洗涤3次。

加一定稀释的待检样品(未知抗体)0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时，洗涤。

(同时做空白、阴性及阳性孔对照)于反应孔中，加入新鲜稀释的酶标第二抗体(抗抗体）0。

1ml,37℃孵育30—60分钟，洗涤,最后一遍用DDW洗涤。

其余步骤同“双抗体夹心法”的4、5、6。

试剂器材1.试剂（1）包被缓冲液（PH9。

6 0。

05M碳酸盐缓冲液)：NaCO3？1.59克NaHCO32。

93克加蒸馏水至1000ml（2）洗涤缓冲液(PH7。

4 PBS）:0.15M KH2PO4 0.2克Na2HPO4·12H2O 2.9克NaCl 8。

ELISA检测试剂盒使用指南ELISA（酶联免疫吸附试验）是一种常用的免疫学实验方法，用于检测病原体、抗体或其他分子的存在和浓度。

它具有高灵敏度、高特异性、易操作和较低成本的优势，被广泛应用于生物医学研究、临床诊断和免疫学领域。

本篇文章将介绍ELISA检测试剂盒的使用指南，包括实验准备、试剂的使用步骤和结果解读。

一、实验准备1.阅读检测项目的说明书：在使用试剂盒前，仔细阅读说明书，了解试剂的使用方法、灵敏度和特异性等关键信息。

2.样本准备：根据实验要求，准备样本。

如果需要检测血清中的抗体水平，可以采集血液样本，离心分离血清；如果需要检测细胞培养上清中的分子，将上清收集，并使其清晰，避免细胞或杂质的污染。

3.样本预处理：根据实验需求，对样本进行必要的预处理。

例如，可以通过加热、稀释、酶解等方式来处理样本，以改变样本组分和浓度。

4.准备品质控制样品：制备阳性和阴性控制样品，用于评估试剂盒和实验操作的稳定性和准确性。

5.实验器材准备：准备所需实验器材，如酶标板、移液器、微孔板洗涤仪等。

确保器材的干净和完整，并按照说明书要求对其进行预处理。

二、试剂使用步骤1.试剂准备：根据说明书要求，将试剂从冰箱中取出，并在室温下放置一段时间使其恢复到室温。

确保试剂瓶盖紧闭，并避免暴露在直接阳光下。

2.实验操作：按照说明书的要求，将试剂加入到酶标板中，并根据实验设计进行标准曲线的设置。

标准曲线用于测量未知样品的数量，并计算出浓度。

3.孵育：根据试剂盒的要求，将酶标板放入孵育箱中进行孵育。

孵育温度和时间应根据实验要求进行调整。

4.洗涤：使用洗涤缓冲液对酶标板上的不特异性结合物进行洗涤。

洗涤过程应准确控制洗涤孔板次数和洗涤液的体积。

5.补液：在洗涤完成后，加入辣根过氧化物酶标况稀释液，促进酶标物与特异性结合物的反应。

6.孵育：根据试剂盒的要求，将酶标板放入孵育箱中进行二次孵育。

7.反应停止：根据试剂盒的要求，加入相应的停止液，停止酶反应。

ELISA试剂盒操作方法ELISA（酶联免疫吸附法）是一种常用的实验技术，用于检测目标物（如蛋白质、抗原或抗体）的存在和浓度。

ELISA试剂盒是ELISA实验的核心，包括特定的试剂和材料，用于执行特定的步骤和操作。

以下是一般ELISA试剂盒的操作方法，包含以下步骤：1.准备实验样品：收集所需分析物的样品（例如血清、细胞上清液或组织提取液等），并适当保存或稀释以便后续操作。

2.预处理步骤：根据实验的目的和试剂盒的要求，进行样品的预处理。

这可能包括去除干扰物质、离心、稀释或加热等处理步骤。

3.涂覆酶联免疫板：打开试剂盒中提供的酶联免疫板，将其放置在工作台上。

将涂覆物质（如抗体或抗原）加入到每个酶联免疫孔中，通常使用多通道移液器或微量移液器进行操作。

涂覆后，尽量避免泡沫和交叉污染。

4.触发剂孵育：将涂覆后的酶联免疫板放入孵育箱或板上孵育器中，在适当的温度下孵育一段时间。

此步骤的目的是固定涂覆物质，并优化其活性。

5.洗涤：将试剂盒中提供的缓冲液加入酶联免疫孔中，并倾斜孔盘轻轻敲打或使用洗板仪进行洗涤，以去除未结合的物质和杂质。

通常，洗涤液需要多次更换，充分洗涤以获得更好的准确性和灵敏度。

6. 过量引物（Block）：加入试剂盒提供的阻断缓冲液至孔中，目的是防止非特异性结合的发生。

阻断时间可以根据试剂盒的要求进行调整。

7.加入样品和控制物质：将处理好的样品和控制物质，如阳性对照和阴性对照，加入到各个酶联免疫孔中。

注意要根据试剂盒的要求进行适当的稀释。

8.孵育和洗涤：将孔盘放回孵育箱或板上孵育器中，按照试剂盒的要求进行孵育。

完成孵育后，继续进行洗涤步骤，以去除未结合的物质。

9.检测剂加入：将检测试剂（通常是特异性抗体或酶标记物质）加入酶联免疫孔中。

如有需要，可以进一步稀释试剂以适应实验要求。

10.再次孵育和洗涤：将孔盘放回孵育箱或板上孵育器中，对要求进行的步骤进行孵育。

完成孵育后，进行洗涤步骤以去除未结合的物质。

酶联免疫（ELISA）实验操作具体步骤及详细说明一、试剂和溶液10 X PBS: 80g NaCl，2g KCl, 14.4g Na2HPO4 和2.4g KH2PO4 加1 L 纯水，调pH 至7.4 包被液：1X PBS 洗涤液：含0.05% Tween-20 的1X PBS（1X PBST）或纯水封闭液：10 mg/ml BSA(1% BSA，1X PBS 配置) 抗体稀释液：一抗、二抗均用1%BSA-PBS 2M H2SO4 终止显色：108ml 98%H2SO4，加纯水稀释到1L二、实验步骤1.组织固定：烘箱温度65-75℃ 30min 或者65℃过夜；2.脱蜡：二甲苯浸泡三次，每次10 分钟；3.水化：依次经过无水乙醇，95%乙醇，85%乙醇，70%乙醇浸泡，每次5min；4.洗涤：自来水冲洗1 次，PBS 浸泡3min；5.抗原修复：放入稀释100 倍的柠檬酸盐缓冲液(pH6.0) 中，高压锅煮沸10min，常温冷却30min；6.洗涤：纯水浸泡2 次，PBS 浸泡1 次，每次3min；7.灭活酶：室温下3%过氧化氢-甲醇暗处处理切片15min；8.洗涤：纯水浸泡1 次，PBS 浸泡2 次，每次3min；9.封闭：加入适当体积的super block（KT1002a Reagent A），37℃温箱孵育5min；10.洗涤：纯水浸泡1 次，PBS 浸泡2 次，每次3min；11.一抗：加入反应体积为0.15ml，适合浓度的一抗, 37℃ 湿盒孵育60min。

12.洗涤：PBST 浸泡3 次，PBS 浸泡1 次，每次3min；13.加入适当体积生物素标记的UltraTek Anti-Polyvalent 的二抗（KT1002aReagent B），37℃湿盒孵育10min；14.洗涤：PBST 浸泡3 次，PBS 浸泡1 次，每次3min；15.加入适当体积酶标亲和素UltraTek HRP（KT1002a Reagent C）, 37℃湿盒孵育10min；16.洗涤：PBST 浸泡3 次，PBS 浸泡1 次，每次3min；17.显色：滴加适量DAB 显色液(KT1003a)至切片上，室温显色1~5min，自来水冲洗；18.复染：苏木素染色5min，蒸馏水冲洗5min；19.分化：0.5%盐酸乙醇混合液中分化，自来水冲洗3-4 次，PBS 中浸泡10-20 秒返蓝，自来水冲洗2 次。

elisa实验操作步骤
ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。

结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。

在测定时，受检标本（测定其中的抗体或抗原）与固相载体表面的抗原或抗体起反应。

操作步骤:
1．从已平衡至室温的密封袋中取出试验所需板条，未用的板条和干燥剂请放回铝箔袋内压实自封条，密封口袋，放回4℃。

2．空白孔加标准品和标本稀释液，其余相应孔中加标本或不同浓度标准品(100ul/孔)，用封板胶纸封住反应孔，36℃孵箱孵育90分钟。

3．提前20分钟准备生物素化抗体工作液。

4．洗板5次。

5．空白孔加生物素化抗体稀释液，其余孔加入生物素化抗体工作液(100ul/孔)。

用新封板胶纸封住反应孔，36℃孵箱孵育60分钟。

6．提前20分钟准备酶结合物工作液。

避光室温(22-25 ) ℃放置。

7．洗板5次。

8．空白孔加酶结合物稀释液，其余孔加入酶结合物工作液(100ul/孔)。

用新封板胶纸封住反应孔，36℃孵箱，避光孵育30分钟。

9．打开酶标仪电源，预热仪器，设置好检测程序。

10．洗板5次。

11．加入显色底物(TMB)100ul/孔，避光36℃孵箱，避光孵育15分钟。

12．加入终止液100ul/孔, 混匀后即刻测量OD450值(3分钟内)。

在仪器保存读数结果并打印一份纸质结果。

13．实验完毕后将未用完的试剂按规定的保存温度放回电冰箱保存至有效期结束。

ELISA试剂及溶液配制及实验步骤一、ELISA试剂及溶液的配制：1. 淋洗缓冲液（Washing buffer）的配制：将20倍浓度的淋洗缓冲液稀释至适当浓度，一般浓度为1×淋洗缓冲液。

淋洗缓冲液的配制方法是将1份浓缩淋洗缓冲液加入19份去离子水中。

2. 反应底物（Substrate）的配制：根据试剂商提供的说明书配制相应的底物。

不同的ELISA实验可能要求使用不同的底物，常见的有TMB （3,3',5,5'-四甲基苯基丙二胺）、ABTS（2,2'-联氨基双叔丁酸）等。

3. 试剂盘（Plate）的包装打开：将试剂盘从密封袋中取出，避免试剂盘受到灰尘或其他污染物。

4. 标准品（Standard）的配制：先将标准品重新悬浮均匀，然后按照试剂商提供的说明书中所述的浓度进行适当倍数的稀释，以得到一系列浓度的标准曲线。

5. 吸收剂（Coating buffer）的配制：根据试剂商提供的说明书配制相应的吸收剂。

吸收剂的配制方法是将1份浓缩吸收剂加入9份去离子水中。

二、ELISA实验步骤：1.试剂准备：将ELISA试剂和溶液按照上述步骤进行配制，确保试剂的浓度、摄取方式和平衡温度等参数符合实验要求。

2.板预处理：用淋洗缓冲液洗涤孔板，每孔洗涤3次，倒掉洗涤液后用吸水纸吸干。

3.标准曲线制备：在孔板的一列孔中加入不同浓度的标准品，通常是0、1、2、5、10等倍数的浓度，每个标准品重复做3次。

将每个标准品孔封闭，孵育一段时间。

4.样品处理：将待测样品依次加入其它的孔中，每个样品重复做3次。

同时将一些空白对照（不加样品）进行处理。

将每个样品孔封闭，孵育一段时间。

5.淋洗步骤：用淋洗缓冲液洗涤孔板，每孔洗涤3次，倒掉洗涤液后用吸水纸吸干。

6.探针孵育：将酶标抗体溶液加入每个孔并封闭，孵育一段时间。

7.淋洗步骤：用淋洗缓冲液洗涤孔板，每孔洗涤3次，倒掉洗涤液后用吸水纸吸干。

8.底物加入：将已配制好的底物加入每个孔中，孵育一段时间，使酶标物与底物发生反应。

ELISA操作规程一、引言ELISA（酶联免疫吸附实验）是一种常用的免疫测定技术，用于检测和定量分析特定抗原或抗体的存在。

本操作规程旨在详细描述ELISA实验的步骤和操作要求，确保实验结果的准确性和可重复性。

二、实验材料和仪器1. 实验材料：- 微孔板：96孔的ELISA板- 抗原或抗体样品- 酶标记的二抗或底物- 洗涤缓冲液：含有洗涤剂的缓冲液- 反应缓冲液：用于稀释样品和试剂的缓冲液- 底物缓冲液：用于溶解底物的缓冲液- 停止液：用于停止反应的液体- 正负对照样品- 试剂盒说明书2. 仪器：- 微孔板读数仪- 洗板机或多道洗涤器- 离心机- 定量移液器和吸头- 恒温培养箱或恒温水浴三、实验步骤1. 准备工作：- 将所有试剂和样品从冰箱中取出，并等温至室温。

- 根据试剂盒说明书，准备所需的稀释液和缓冲液。

- 预热微孔板读数仪至所需的波长。

2. 样品和试剂的加入：- 将96孔微孔板的标签面朝上，用定量移液器向每个孔中加入50μL的样品或稀释液。

- 加入正负对照样品，作为比较和验证实验结果的参考。

3. 孔洗涤：- 将洗涤缓冲液加入洗板机或多道洗涤器的洗涤槽中。

- 将微孔板放入洗涤器中，按照设备说明进行洗涤，一般为洗涤3-5次。

4. 底物加入：- 将底物缓冲液加入每个孔中，使其完全覆盖样品。

- 在避光条件下，将微孔板放置在恒温培养箱或恒温水浴中孵育一定时间，通常为15-30分钟。

5. 反应停止：- 加入适量的停止液到每个孔中，停止底物的反应。

- 轻轻摇晃微孔板，使停止液均匀混合。

6. 测量吸光度：- 将微孔板放入预热好的微孔板读数仪中。

- 选择所需的波长，并记录吸光度值。

四、数据分析1. 样品浓度计算：- 使用正负对照样品的吸光度值作为参考，根据试剂盒说明书中的标准曲线，计算样品的浓度。

2. 数据处理：- 根据实验设计和目的，进行数据的统计分析和图形展示。

- 使用适当的统计学方法，如t检验或方差分析，对实验结果进行验证和比较。

ELISA试剂盒protocol
一.试剂准备：
使用前,将所以时间放置室温15min，可以缓慢的摇晃加速沉淀溶解，稀释的工作液，需要立即使用；
二.标准品准备：用Reagent Diluent稀释
三.实验方法
1．用PBS稀释Capture Antibody 至工作浓度，马上用100ul/孔稀释的抗体铺平板,密封平板至室温抚育过夜;
2．吸干平板,每孔用400ul Wash buffer清洗,反复洗三次,最后一次洗版,倒置平板,放置于吸水纸上,充分吸干剩余的Wash buffer;
3．每孔中加入300ul Reagent Diluent 封闭板子至少1h;
4．重复步骤2,此时板子可以用于检测样品;
5．加100ul样品,标准品/孔,封板,室温抚育2h;
6．重复步骤2的洗板子过程;
7．加100ul detection Antibody(预先稀释),封闭,室温抚育20min(避光)；
8．重复步骤2的洗板子过程;
9．加100ul Streptavidin‐HRP 工作液，封闭，室温抚育20min(避光)；
10．重复步骤2的洗板子过程;
11．加100ul Substrate solution,室温抚育20min(避光)
12. 加50ul stop solution,彻底混合；
13. 用450nm测OD，540nm，570nm可以做校准波长；。