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结核病的实验室诊断方法及评价耐多药结核病的实验室诊断条件：因耐多药结核分枝杆菌的生物危险性，1）需P2及以上实验室，目前我院实验室条件基本具备即将投入运行，2）日常培养及涂片用的生物安全柜滤膜已超出使用年限，工作人员生物安全得不到保障，应定期予以更换。
耐多药结核分枝杆菌主要以结核分枝杆菌体外药物敏感性测定作为其诊断依据。
因此其基础是培养，只有培养出阳性结核分枝杆菌才能进一步通过结核分枝杆菌体外药物敏感性测定诊断是否为耐多药结核分枝杆菌。
1.已进人临床常规应用的测定方法:目前包括绝对浓度法、比例法及应用BACTEC460、BACTEC 960、BacT/ ALERT 3D、ESPII等仪器系统快速检测结核分枝杆菌的药物敏感性。
其中:绝对浓度法以最低抑菌浓度或以无生长为终点作为判断标准，是我国目前普遍采用的方法;比例法以是否能够抑制99%的细菌生长作为判断标准，是世界卫生组织推荐使用的方法;后四种仪器方法则是比例法的特化，其特点是以细菌的代谢过程指示细菌生长状况。
2.处于研究探索阶段的测定方法:此类方法很多，抗性比例法、Etests法、噬菌体生物扩增法、液体变色培养基测定法、荧光素酶测定法、硝酸盐还原试验等。
3分子生物学方法对结核分枝杆菌耐药性检测已有一些进入临床检测。
基因突变是引起抗结核药物耐药性的最主要的原因。
多种以PCR 为基础的分子生物学技术用于检测与耐药相关基因的突变，作为快速耐药性检测方法在实验室或临床得到开展。
这些方法具体包括：主要是DNA序列分析法，聚合链反应-单链构象多态性分析（PCR-SSCP），另外还包括基因芯片技术、异质性双链构象分析、变性梯度凝胶电泳、线性探针杂交技术、RNA/RNA错配检测技术和分子灯塔技术等。
由于结核分枝杆菌的耐药性与基因突变的确切关系未完全阐明，检测耐药相关基因的分子生物学方法虽然能快速准确地检测到耐药相关基因的突变，但由于判断药物敏感性时存在固有的缺陷，检测结核分枝杆菌耐药性的基因型鉴定法不能完全替代表型鉴定法。
微量刃天青显色法快速测定结核分枝杆菌MIC及菌型鉴定陈军;陈志飞;饶有益;陈丽峰;王飞;肖勇【摘要】目的用刃天青显色法快速测定结核分枝杆菌(MTB)MIC及菌型初步鉴定,并确定抗结核药物折点浓度.方法用30株国家结核参比实验室熟练度测试质控菌株和64株临床分离菌株为试验菌株,在96孔培养板中,用Middlebrook 7H9液体培养基将抗结核药物进行连续双倍稀释后,加入一定浓度菌液,用刃天青显色法测定MIC.根据罗氏培养基药敏比例法结果,用ROC曲线分析建立显色法药物折点浓度.同时选择24株非结核分枝杆菌(NTM),用对硝基苯甲酸(PNB)进行初步的菌型鉴定.结果刃天青显色药敏试验5种抗结核药物链霉素、异烟肼、利福平、乙胺丁醇和氧氟沙星的折点浓度分别为1、0.5、0.5、2、2μg/mL,其敏感性分别为100%、97%、97%、88%和100%,特异性分别为100%、100%、100%、91%和100%.在菌型鉴定中,94株MTB在PNB中均未生长,24株NTM均生长.结果刃天青显色法测定MIC具有操作简便、快速、成本低廉和准确的优势,且能进行初步的菌型鉴定,适于结核病专业实验室应用.【期刊名称】《临床检验杂志》【年(卷),期】2011(029)003【总页数】2页(P174-175)【关键词】结核分枝杆菌;最低抑菌浓度;刃天青【作者】陈军;陈志飞;饶有益;陈丽峰;王飞;肖勇【作者单位】武汉市结核病防治所检验科,武汉,430030;武汉市结核病防治所检验科,武汉,430030;武汉市结核病防治所检验科,武汉,430030;武汉市结核病防治所检验科,武汉,430030;武汉市结核病防治所检验科,武汉,430030;武汉市结核病防治所检验科,武汉,430030【正文语种】中文【中图分类】R378.91结核病是严重威胁公共卫生安全的慢性传染性疾病。
传统罗氏培养基药敏方法需时较长，而商品的液体培养基快速药敏方法如BACT/ALERT 3D系统[1]，不仅需要仪器，而且成本高昂，难以推广使用。
1．结核分枝杆菌鉴定方法1. 1萋尼氏抗酸染色痰涂片显微镜检查目前萋尼氏抗酸染色痰涂片显微镜检查是我国结核病实验室使用最为普遍的方法，其操作简单快捷，特异性高，设备要求低，但是灵敏度较低，不能及时发现病人。
1.2 发光二极管荧光显微镜（LED荧光显微镜）发光二极管荧光显微镜管利用二极管光源，延长了显微镜使用寿命，不需要暗室，且价格低廉，可以提高涂片的阳性检出率。
目前在国内应用评估结果显示灵敏度较明场显微镜明显提高，已在部分区县开始使用。
1.3 交叉引物恒温扩增结核病诊断技术在恒定温度下，特殊的引物和特异性探针在酶的作用下，反应体系在一个密闭的反应管内反应。
扩增反应一般不超过一个小时，最短半小时。
目前应用玻璃化试剂，稳定性好，便于运输。
目前在国内区县级应用评估。
1.4 夹层杯结核病诊断方法将痰标本（或其它标本）用专用消化灭活液充分消化，完全暴露并保留抗酸杆菌，通过自动离心涂片机（或半自动制片染色机）对消化后的标本进行充分集菌。
直接在夹层杯装置中进行抗酸染色，取出基片或膜片置于普通显微镜进行观察。
夹层杯法操作方便快捷，便于标准化操作，通过消化灭活，安全性改善，阳性检出率也比直接涂片法大大提高。
夹层杯的装置有沉降式和虑过式，适用于不同工作量的医疗机构。
1.5 环介导等温扩增方法采用2对引物在等温条件下即可完成DNA的扩增，扩增结果通过肉眼观察荧光进行判定，诊断是否为结核病。
同时整个反应体系采用封闭系统减少了工作区域扩增子的污染，整个反应过程只需一个小时即可完成，通过肉眼观察荧光判读结果。
2．结核分枝杆菌培养方法2.1 固体培养培养是结核病诊断的精标准，也是获得分离菌株开展耐药检测的前提，我国结核病实验室最常用的是固体罗氏培养法，包括简单法和中和离心法。
虽然培养是诊断的精标准，但是花费时间长，需要4-8周时间。
2.2 液体培养液体培养通过添加生长刺激剂，改变检测方法提高检测灵敏度等方式缩短了阳性报告时间。
BACTEC MGIT 960快速培养及药敏在肺结核诊治中的应用评价彭亦平;谭彩萍;熊国亮【摘要】目的：探讨BACTEC MGIT-960全自动分枝杆菌检测技术在结核病诊断中的应用价值。
方法用BACTEC MGIT-960对1538例肺结核患者的痰标本进行分离培养及药敏实验，并与痰涂片抗酸染色及罗氏培养法对比。
结果 BACTEC MGIT-960培养阳性率为42.85%，显著高于涂片阳性率25.42%；BACTEC MGIT-960培养及药敏时间分别为12.5d和8.3d，显著短于罗氏培养法的34.6d和31.2d；BACTEC MGIT-960法与罗氏培养法总的培养及药敏符合率分别为91.02%（kappa=0.82）和96.02%（kappa=0.82），两者具有高度的一致性。
结论BACTEC MGIT-960培养及药敏技术是一种比较理想的快速结核菌检测方法，在肺结核诊治中具有良好的应用价值。
%Objective To evaluate the application of the BACTEC MGIT 960 system for mycobacterial culture and drug sus-ceptibility test in patients with pulmonary tuberculosis. Methods 1538 sputum samples from patients with pulmonary tuberculosis were collected for mycobacterial culture and drug susceptibility testing by BACTEC MGIT 960 system ,and compare with the result by L-J (Lowenstein-Jensen) culture method and sputum smear for acid-fast staining method. Results The positive rate of culture by BACTEC MGIT 960 system was42.847%,significantly higher than that of 25.42%by sputum smear method. The report time of culture and drug susceptibility testing by BACTEC MGIT 960 system were 12.5d and 8.3d,significantly less than that of 34.6d and 31.2d by L-J method. The results of culture and drug susceptibility testingby BACTEC MGIT 960 system and L-J method showed high coincidence (kappa=0.82). Conclusions BACTEC MGIT 960 system is a ideal rapid method for mycobacterial culture and drug susceptibility test and has good application value.【期刊名称】《江西医药》【年(卷),期】2016(000)001【总页数】3页(P21-22,30)【关键词】BACTEC MGIT 960;结核分枝杆菌;肺结核【作者】彭亦平;谭彩萍;熊国亮【作者单位】江西省胸科医院内三科，南昌 330000;江西省胸科医院内三科，南昌 330000;江西省胸科医院检验科，南昌 330000【正文语种】中文【中图分类】R521目前临床用于结核分枝杆菌检测的主要方法是痰涂片抗酸染色、L-J培养（慢培）及药敏试验。
结核病诊断细菌学检验规程一、样本采集结核病诊断细菌学检验的样本主要包括痰液、肺泡灌洗液、血液等。
采集样本时应遵守无菌操作原则，避免交叉感染。
样本采集后应尽快送检，并注明采样时间、病人姓名、年龄、性别、疾病等信息。
二、样本处理1.痰液处理：将痰液放入无菌容器中，加入等量1%氢氧化钠溶液，混合均匀，作用15分钟后用无菌水冲洗2～3次，再取沉淀物涂片检查。
2.肺泡灌洗液处理：将肺泡灌洗液过滤后，离心沉淀，取沉淀物涂片检查。
3.血液处理：抽取病人静脉血5～10毫升，离心沉淀，取沉淀物涂片检查。
三、抗酸染色涂片染色采用萋-尼氏染色法，涂片干燥后用萋-尼氏染色液染色，然后用碳酸钠溶液冲洗，最后用无水乙醇脱色，晾干后镜检。
抗酸染色阳性表明涂片中有抗酸菌存在，可用于初步诊断结核病。
四、培养法将处理后的样本接种在罗氏培养基或改良罗氏培养基上，置37℃恒温箱中培养。
结核分枝杆菌在此培养基上生长缓慢，需时约6～8周。
培养阳性表明有结核分枝杆菌生长，可用于确诊结核病。
五、药敏试验药敏试验用于检测结核分枝杆菌对药物的敏感性。
试验方法有多种，如纸片法、比例法等。
药敏试验结果可作为选择和调整抗结核药物的依据。
六、鉴定与分型通过形态学、生化反应和基因鉴定等方法对结核分枝杆菌进行鉴定与分型。
这些方法有助于了解结核病的传播途径和特点，为预防和治疗提供依据。
七、质控与报告发放结核病诊断细菌学检验的质控包括室内质控和室间质评。
室内质控主要是对检验过程进行质量控制，包括试剂质量、仪器校准等；室间质评则是通过参加实验室间的比对试验来评估检验结果的准确性。
检验结果经审核后发放给临床医生或病人。
报告应包含样本采集时间、病人信息、检验方法、检验结果等内容。
结核菌药物敏感性测定标准化操作及质量保证手册国家结核病参比实验室2010年3月前言结核病细菌学检查是结核病控制规划重要的组成部分，随着现代结核病控制策略（DOTS）在我国的广泛实施，以及结核病控制三大目标的全面实现，结核病防治政策与技术策略有了很大的发展，在继续扩展高质量的DOTS的基础上，积极应对耐多药肺结核（MDR-TB）、结核菌/艾滋病病毒（TB/HIV）和其他挑战。
为满足当前结核病防治工作的需要，结核病实验室的工作任务也从之前的以痰涂片镜检发现传染性肺结核病人为重点，扩展到细菌学诊断、耐药结核病诊断等更加广泛的服务领域。
结核分枝杆菌药物敏感性测定（简称）是耐（多）药结核病防治中必不可少的重要工具，其主要作用是诊断耐药结核病、选择和调整耐药结核病治疗方案、开展耐药监测以了解某一地区结核分枝杆菌的耐药水平。
目前耐多药结核病规划性管理（PMDRTB）已在我国部分地区开展了试点，并将以较快的速度在全国扩展。
但在我国公共卫生领域，分枝杆菌药敏试验开展得并不普遍，大部分结核病防治机构的结核病实验室没有相应的经验和技术，缺乏系统的标准化文件，存在标准不一致、操作不规范、质量良莠不齐的问题。
为进一步规范药敏试验的操作，保证工作质量和试验人员安全，国家结核病参比实验室与世界卫生组织合作，编制了本册《结核分枝杆菌药物敏感性测定标准化操作手册》，详细描述结核菌药敏试验各个过程的操作程序。
目前世界卫生组织推荐的药敏试验方法包括比例法、绝对浓度法和液体培养法。
其中比例法为目前我国流行病学监测和耐多药结核病规划管理项目所采用的方法，将在本手册中重点介绍。
绝对浓度法是我国三十多年沿用的药敏试验方法，为目前我国大多数结核病专科医院常规使用的用于临床检测的方法，本手册也有独立章节进行描述，方法引自《中国防痨协会结核病诊断实验室检验规程》。
本手册参考世界卫生组织系列的结核病实验室标准化操作程序（SOP）的主要框架和内容，按照我国结核病规划的实际情况和具体要求进行了调整，并通过在部分省份的试点进一步进行了修改和完善，使之更具有可操作性，供开展药敏试验的实验室使用。
结核分枝杆菌L型的研究进展临床1班 王小蕾 90301136结构严谨，内容翔实，但缺少英文文献是为憾事9分细菌L型，即细菌细胞壁缺陷型，是指细菌细胞壁的肽聚糖结构受到理化或生物因素的直接破坏或合成被抑制，而能够继续生长和分裂的菌株。
[1]1935年klieneberger首先从念珠状链杆菌的菌落中发现，并以她工作的Lister研究院命名为“L型”。
迄今为止, 几乎所有的细菌、螺旋体和真菌中都发现L 型的存在。
[2]结核分枝杆菌L型的发现实际上要早于细菌L型概念的提出。
1908年，Much在结核性冷性脓肿、浆液性渗出液、淋巴结和痰液中发现了结核分枝杆菌非抗酸染色的微小颗粒样异常,被后人称为Much 颗粒。
一般认为, Much 颗粒是结核杆菌的非耐酸性细胞, 有感染豚鼠并发育成正常抗酸杆菌的能力。
有人认为Much粒可能是个体发育过程中的一个阶段。
结核杆菌L型主要有三种形态：球菌相、颗粒相和滤过相。
球菌相: 1936年由Steenken发现，杆菌在某些因素作用下,失去细胞壁成分而形成球状体。
球状相结核菌由双层质膜包裹, 原生质中核糖体丰富, 间体消失。
在适宜条件下可以发生返祖。
颗粒相:即Much颗粒。
滤过相: Khomenko 于1991 年发现，是形态小于常杆菌20 倍的超小型结核杆菌,具有电子致密的外壳和很低的蛋白含量,可以通过除菌滤膜,并可在宿主体内持续存在。
[3]随着研究工作的开展，对结核分枝杆菌L型的研究逐渐深入，该菌与一些疾病的关系也逐渐明朗，现将结核分枝杆菌L型的产生原因、生物学特性、致病性和检查、治疗方法方面的进展综述如下：一、结核分枝杆菌L型的诱导产生结核分枝杆菌既可以体外诱导产生也可以在患者体内产生。
已知的诱导剂及其作用机制概括起来有: (1) 使细菌细胞突变, 如物理因素的紫外线, 化学因素的人胆汁, 尿素, 微量元素铁、锌、镁。
(2) 干扰细菌细胞壁的合成, 如氨基酸类的甘氨酸、蛋氨酸、苏氨酸等, 抗菌药物如青霉素、先锋霉素、万古霉素、异烟肼、链霉素、环丝氨酸等。
一、实验室生物安全实验室环境安全：根据我国《病原微生物实验室生物安全管理条例》、《实验室生物安全通用要求》、《人间传染的病原微生物名录》和《医疗机构临床实验室管理办法》的规定，结核分枝杆菌大量活菌操作须在符合生物安全三级（Laboratory Biosafety Level 3）的环境中进行；样本检测（包括涂片、显微镜观察、样本的病原菌分离纯化、药物敏感性试验、生化鉴定、免疫学实验、PCR 核酸提取等初步检测活动），可以在符合生物安全二级（Laboratory Biosafety Level 2）的环境中进行。
实验室所用设施、设备和材料（含防护屏障）均应符合国家相关的标准和要求。
实验室操作安全：由具有相关专业知识和操作技能的工作人员进行实验室操作，实验人员应该认真负责，严格按照标准化、规范化的操作程序进行各项实验室操作。
菌种或样本运输安全：为保障人体健康和公共卫生安全，在运输可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本时，须按照《可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本运输管理规定》的要求进行包装、运输、操作、保藏和管理。
废弃物处理安全：为防止疾病传播，保护环境，保障人体健康，医疗废弃物的处理应严格按照《中华人民共和国传染病防治法》和《中华人民共和国固体废物污染环境防治法》，以及《医疗废物管理条例》的相关规定妥善处理。
（一）痰涂片镜检实验室基本要求1.实验室应分区（痰涂片染色区域和读片镜检区域），布局应符合生物安全二级防护的要求。
2.准入规定，在实验室门上应标有国际通用的生物危害警告标志，未经批准任何人不得进入实验室工作区域，实验室的门应随时关闭。
3.个人防护，在实验室工作时，应穿防护服、隔离衣，并佩戴口罩（面具）和手套等。
4.实验室墙壁、天花板和地板应易清洁、不渗液，并耐化学品和消毒剂的腐蚀，地面应防滑。
5.实验操作台面应耐热、防水，耐消毒剂、酸、碱和有机溶剂的腐蚀。
6.实验室内应保证操作时的照明，避免不必要的反光和闪光。
肺结核的传染途径与诊断方法肺结核是一种由结核分枝杆菌引起的传染病，其传播途径多样，诊断方法也有多种。
本文将详细介绍肺结核的传染途径和常用的诊断方法。
一、肺结核的传染途径1. 空气飞沫传播：肺结核最主要的传播途径就是通过空气中飞沫进行传播。
当一个患有开放性肺结核病变的患者咳嗽、打喷嚏或说话时，就会释放含有结核分枝杆菌的小颗粒并悬浮在空气中。
其他人吸入这些含有病原体的飞沫后，也可能感染上肺结核。
2. 长期近距离接触：除了空气飞沫传播外，长期与患者近距离接触也是导致肺结核传播的重要原因。
例如，在家庭、学校或工作场所里与活动性肺结核患者密切接触，并且共用相同的生活设施和餐具等，会增加感染机会。
3. 其他途径：除了空气飞沫和近距离接触之外，肺结核还可以通过食物、饮水和乳制品等途径传播。
然而，这些途径相对较少见，并且不是主要的传播途径。
二、肺结核的诊断方法1. 结核杆菌素试验（TST）：结核杆菌素试验是最常用的肺结核诊断方法之一。
它通过皮内注射结核分枝杆菌蛋白衍生物，观察注射部位是否发生局部化学反应来确定感染情况。
如果患者已经感染过结核分枝杆菌，注射部位会出现红肿和硬结。
2. 胸部X光：胸部X光检查是帮助医生确定肺结核病变的重要工具。
在X光片上，活动性肺结核通常呈现为多发小斑点或磨玻璃影，也可能出现空洞和淋巴结增大等病变。
3. 痰液检测：痰液检测是直接检测口腔、咽喉或肺部分泌物中是否存在结核分枝杆菌的方法。
通常采用抗酸染色、培养和PCR等技术来检测痰液中的病原体。
这是确诊肺结核的重要手段。
4. 高分辨率计算机断层扫描（HRCT）：HRCT可以提供更加详细和准确的肺部影像学信息，有助于确定肺结核的病变范围和性质。
通过HRCT扫描，医生可以观察到病变的形态、大小、位置等特征，以便选择最合适的治疗方法。
5. 结核菌培养及其药敏试验：结核菌培养是从临床标本中直接培养出结核分枝杆菌，并对其进行鉴定和药敏试验，以确定感染的菌株类型和药物敏感性。
结核分枝杆菌培养步骤
结核分枝杆菌是导致肺结核的细菌，在诊断和治疗肺结核时起着至关
重要的作用。
其培养是结核病的基础检查方法之一。
以下是结核分枝
杆菌培养的详细步骤：
1.样本的采集和处理：结核分枝杆菌可从患者的唾液、痰液、胸腔积液等体液中分离得到。
采集样本的时间、采集方式和处理方式都可能影
响分枝杆菌的分离效果。
因此，应严格按照相关规定采集和处理样本。
2.选择适当的培养基：结核分枝杆菌在不同种类的培养基上生长情况不同。
因此，选择适宜的培养基非常重要。
常用的结核分枝杆菌培养基
包括罗氏培养基、勃氏液体培养基、勃氏固体培养基等。
3.制备培养基：制备培养基应严格按照国家标准或相关指南，在无菌条件下进行。
制备好的培养基应该及时使用，过期了就不能使用了。
4.接种：用杆菌种搅拌器将样品混匀，然后将其接种到已经制好的培养基中。
接种时需避免产生气泡，并且将接种匀密均匀。
5.培养条件：结核分枝杆菌的培养需要一定的条件，如适宜的温度、湿度和酸碱度等。
常温下结核分枝杆菌生长缓慢，所以需要在温度为37℃
的恒温箱中进行培养。
保持培养条件的稳定性和质量是培养成功的关键。
6.处理结果：培养结果一般需要5-12周，要根据培养结果来判断是否检测到结核分枝杆菌。
如果可以检测到结核分支杆菌，可以进行药敏试验，了解分枝杆菌的敏感性和耐药性。
以上就是结核分枝杆菌的培养步骤。
需要注意的是，结核分枝杆菌在培养过程中的生长情况可能受到多种因素的影响，因此严格遵循培养步骤并保证培养条件的合适和稳定，才能提高分离率和检测准确性。
