8_9个月SD大鼠小胶质细胞的纯化分离培养

大鼠脊髓小胶质细胞体外纯化培养方法的建立陈雪;张婷;李彩红;王伟;骆翔;喻志源【摘要】Objective: To establish a simple and highly efficient primary culture method for microglia from rat spinal cord. Methods: Mixed glial cells were obtained from the spinal cord of newborn SD rats. On day 3, the culture medium was changed until the cultured microgila became fused on day 10. The microglia were purified using shocking methods (37 ℃, 180 rpm, 1~2 h) with different adhesion time (20~40 min). The isolated and purified microglia were identified with Iba1 and CD11b after 24 h. Results: The rat spinal cord microglia were successfully isolated and purified. The cultured microglia presented round or fusiform, highly refractive morpholo-gy. Iba1 and CD11b fluorescence tests showed that the purity of microglia was more than 95%. Conclusion:Using nutrition deprivation, Shock and different adhesion time methods, a primary spinal cord microglia culture method with high yield and purity was established, providing a useful tool for studying rat spinal cord microglia in vitro.%目的：建立一种简易高效的大鼠脊髓小胶质细胞原代培养方法。

SD大鼠类胚胎干细胞(rESCs)的分离与初步培养的开题报
告
研究目的：
本研究旨在分离和初步培养SD大鼠类胚胎干细胞(rESCs)，为深入研究该细胞的分化、应用和疾病机制提供实验材料。

研究方法：
1. 制备培养基：采用DMEM/F12（1:1）为基础，添加15%胎牛血清（FBS）、1%非必需氨基酸、1%L-谷氨酰胺、1%β-巯基乙醇、10 ng/ml LIF、2 mM L-脯氨酸和1%青霉素/链霉素混合抗生素。

2. SD大鼠类胚胎的分离：由6-8周大的SD雌鼠配对，自然交配，怀孕1
3.5 d
时处死母鼠，取出子宫，找到胚胎，取出放在PBS中，去掉头、内脏和四肢，取其体
细胞做为来源。

3. rESCs的分离：将胚体细胞放入0.25%胰蛋白酶1-EDTA中消化，加入培养基，放入生物安全柜中，避免污染，将细胞均匀涂布在明胶涂层的96孔板上，放入主要培养基，一定时间后观察到单个、圆形、紧密粘附的细胞集群，即可进行进一步培养。

4. rESCs的初步培养：活细胞用PBS冲洗一遍，再用0.05%胰酶-EDTA与PBS 1∶2的混合液消化断裂，离心2 min(1000r/min)，吸掉上清液，用10 ml保护性培养液(MEF+LIF+胰岛素+VEGF)将细胞复悬后，均匀分配在25cm2培养瓶中，为初级培养（P0）。

保持在5%CO2条件下进行培养。

预期结果：
通过本研究，我们将成功分离和初步培养SD大鼠类胚胎干细胞，获得高质量的
细胞材料，为进一步研究类胚胎干细胞分化、生长调节、功能鉴定等方面提供有效的
实验手段和平台。

大鼠脂肪干细胞的分离培养1.试剂配制1.1双抗培养基的配制用100万单位链霉素溶解在10ml去离子水中，抽出0.8ml以及用80万单位的青霉素溶解在8ml的去离子水中，抽出0.5ml，分别加入DM EM培养基中，即配成100U/m1青霉素，100U/m1链霉素双抗培养基。

1.2成骨诱导剂的配制地塞米松259溶解于100ml去离子水中，抽出10ul;10gβ一甘油磷酸钠溶解于6ml去离子水中，抽出lml;25g抗坏血酸溶解于100ml去离子水中，抽出100ul，分别加入100ml的培养基中，既配成了含1nmol/L 地塞米松，50ug/m1抗坏血酸，10mmol/Lβ一甘油磷酸钠的成骨诱导剂。

1.3 DMEM培养基的配制取一瓶DM EM溶解于1000ml去离子水中，搅拌均匀后，用7%NAHC03调节其PH值为7.2-7.4。

用滤器过滤，分装在100ml的清洁无菌生理盐水瓶中置4℃冰箱中。

1.4含10%胎牛血清的DM EM完全培养基的配制取10ml胎牛血清溶解于90mLDM EM培养基中，即可配成含10%胎牛血清的DM EM培养基，装在100ml的生理盐水瓶中置4℃冰箱中。

1.5 0.25%胰蛋白酶的配制用精确的天平称250mg胰蛋白酶，并溶解于100ml培养基中，即浓度为0.25%。

用7%NaHC03调节其PH值为7.2-7.4。

用滤器过滤后，分装在100ml的清洁无菌生理盐水瓶中置4℃冰箱中。

1.6 Ⅰ型胶原多克隆抗体配制I型胶原多克隆抗体用去离子水配成1:100工作浓度，置4℃冰箱中备用。

1.7 二氮联苯胺(diminob ℃nzidin ℃DAB)显色剂的配制分别取lml试剂A，50ul试剂B，50ul试剂按A到C加入，即配成lmLDAB显色剂。

在配制成30min内用于免疫细胞化学染色。

1.8 地塞米松(DXM)液的配制地塞米松25g溶解于100ml去离子水中，抽出10ul。

既配成了含1nmol/L地塞米松，使用时根据需要配制成不同浓度。

大鼠少突胶质细胞的纯化培养与鉴定
徐明杰;王玮
【期刊名称】《局解手术学杂志》
【年(卷),期】2008(17)6
【摘要】目的探讨新生2 d Sprague-Dawley(SD)大鼠脑少突胶质细胞的分离方法和生长条件,为少突胶质细胞损伤后髓鞘形成障碍或脱髓鞘疾病的研究奠定基础.方法根据星形胶质细胞和少突胶质细胞的生长时间差异、细胞生长方式及细胞对培养层粘附等特性的不同,采用两次恒温摇床振荡分离纯化法和条件限定培养基培养获取并鉴定高纯度的大鼠少突胶质细胞.结果培养出突起有如蜘蛛网状的成熟少突胶质细胞,半乳糖脑苷脂(Galactocerebroside,Gal)阳性.结论两次恒温摇床振荡分离纯化法和条件限定培养基培养可获取高纯度的大鼠少突胶质细胞.
【总页数】3页(P379-381)
【作者】徐明杰;王玮
【作者单位】福建医科大学神经生物学研究中心,福建,福州,350004;福建医科大学神经生物学研究中心,福建,福州,350004
【正文语种】中文
【中图分类】R651;Q813.11
【相关文献】
1.大鼠星形胶质细胞和少突胶质细胞的纯化培养与鉴定 [J], 伍亚民;马海涵;廖维宏
2.新生大鼠视神经少突胶质细胞体外培养纯化及鉴定 [J], 彭锡嘉;刘少章;叶剑;袁
容娣
3.大鼠脑皮质少突胶质细胞培养与鉴定 [J], 周静;谢骐骥;余资江;孙宝飞;戈果
4.少突胶质细胞体外培养、纯化、鉴定及缺氧模型建立 [J], 杨晖;王玮
5.新生大鼠大脑少突胶质细胞系的分离纯化和定向分化培养 [J], 何平;沈馨亚;杨勤;汪洋;邱云芳;刘才栋
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大鼠少突胶质前体细胞(OPCs)纯化培养及糖氧剥夺(OGD)模型的建立付佩彩;黄珊珊;唐荣华;赵东明【摘要】目的建立大鼠脑少突胶质前体细胞(oligodendrocyte precursor cells,OPCs)分离纯化培养及糖氧剥夺(oxygenglucose deprivation,OGD)模型.方法出生3d内的SD大鼠乳鼠取脑,经胰蛋白酶消化法培养混合胶质细胞,混合培养10d后,震摇及差速贴壁法分离纯化OPCs,纯化培养3d后鉴定、诱导分化OPCs 为少突胶质细胞(oligodendrocyte,OL)及进一步OGD干预.免疫荧光法鉴定OPCs纯度及分化为OL的能力;MTT法检测OGD(37℃,1％O2,5％ CO2)干预0.5h、1h、2h及4h时细胞活力改变,Edu染色检测细胞增殖情况.结果免疫荧光显示纯化培养的OPCs 95％以上表达NG2+ A2B5,且可分化为MBP阳性的OL.OGD 2h时,MTT显示细胞活力明显下降,EdU染色阳性率明显降低.结论震摇及差速贴壁法可获得高纯度的OPCs,且细胞具有分化为OL的能力.2h可作为OPCs OGD模型缺血缺氧损伤合适时间.【期刊名称】《中国组织化学与细胞化学杂志》【年(卷),期】2015(024)005【总页数】5页(P470-474)【关键词】少突胶质前体细胞;细胞培养;糖氧剥夺;EdU【作者】付佩彩;黄珊珊;唐荣华;赵东明【作者单位】华中科技大学同济医学院附属同济医院神经内科,武汉430030;华中科技大学同济医学院附属同济医院神经内科,武汉430030;华中科技大学同济医学院附属同济医院神经内科,武汉430030;华中科技大学同济医学院附属同济医院骨科,武汉430030【正文语种】中文【中图分类】Q813.11少突胶质前体细胞(OPCs)是近年来发现的神经胶质前体细胞，约占成年中枢神经系统(CNS)中所有胶质细胞的5%－8%。

#论 著#8-9个月SD 大鼠小胶质细胞的纯化分离培养耿 慧 钟 远=摘要> 目的 建立培养8-9个月SD 大鼠大脑皮层小胶质细胞的方法。

方法以M cCarthy 的方法为基础,并加以改进,采用振摇结合贴壁分离法纯化小胶质细胞;CD11b 免疫细胞化学染色对纯化的小胶质细胞纯度进行鉴定;相差显微镜下进行细胞形态观察和细胞计数;CCK-8比色法检测纯化的小胶质细胞在不同时间点的活力和增殖。

结果 培养的8-9个月SD 大鼠大脑皮层小胶质细胞,纯度达到95%,培养过程中未出现明显的增殖。

结论 8-9个月SD 大鼠大脑皮层的小胶质细胞在体外亦可成功培养,为小胶质细胞在老年疾病中的研究奠定了基础的。

=关键词>小胶质细胞;细胞培养;衰老;阿尔茨海默病中图分类号:R 331 文献标识码:A 文章编号:1006-351X (2010)02-0152-03The pr i m ary cu lture m e thod for isolation of m icrogli a fro m 8-9m on th rats GE N G H u i ,Z H ONG Yuan .D epart m entof G e ronti s m,the S i x t h P eop le s 'H osp ita l o f Shangha i Ji ao t ong U n i ve rs i ty ,Shangha i 200233,Ch i na Correspond i ng au thor : ZHONG Y uan ,Ema i:l zhongyuan60@yahoo =Abstract > O bjective T o se t up an easy and e ffecti ve m ethod for pr i m ary cu lti vate and pur ifi cation of the m i crog lia cells .M eth odsBased on class i ca lm i crog li a pri m ary cu lture m e t hod o fM cCa rt hy ,and w e i m proved th i sm ethod .In the l a ter pur ifi cation phase o f ce ll cu lti va tion ,m i crog lias w ere parall y ope ra ted and culti v ated w ith m echan ical separa ti on m ethod .M orpho log i c changes and the nu mber of ce lls were reco rded under the sa m e m agn ifi ed fi e l d o f scope .The acti v ity and t he pro liferati on w ere exam i ned by C ell Counting K it .R es u lts P resen t m od ifi edm ethod stead ily produced m icrog li a from 8-9m ont h SD rat w ith hi gh pur it y.N o sign ificant pro lifera ti on w as found i nnor m a l cu lt ura l cond iti on .Con clusi onThe m i crog lia ce lls i solated from 8-9m ont h SD rat can a lso be cu lti vatedsuccessfull y i n v itro ,prov i ding a basis f o r furt her research o f the m icrog lia i n A l zhe i m er d i sease .=K ey words >M icrog li a ;Ce ll culture ;A g i ng ;A lz he i m er s 'disease作者单位:200233上海,上海交通大学附属第六人民医院老年科通信作者:钟远,Em ai:l z hongyuan60@yahoo .co 小胶质细胞是脑内的免疫效应细胞,大约占中枢神经系统脑实质胶质细胞数量的10%。

SD大鼠少突胶质前体细胞系的分离、培养及鉴定唐军;钟琳;姚裕家;陈娟【期刊名称】《中华实用儿科临床杂志》【年(卷),期】2006(012)023【摘要】目的获取高纯度的少突胶质前体细胞系,并作鉴定.方法根据星形胶质细胞和少突胶质前体细胞系生长时间的差异,细胞黏附特性的不同,利用振荡分离纯化法获得纯化的SD大鼠少突胶质前体细胞,再用添加了神经营养因子(N2)、血小板衍生生长因子(PDGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的无血清培养基传代培养.免疫荧光法对表面抗原进行细胞鉴定.结果获得纯度95%以上少突胶质前体细胞,少突胶质祖细胞A2B5、O4抗体阳性;未成熟少突胶质细胞O4、O1阳性;胶质细丝酸性蛋白(GFAP)均为阴性.结论通过振荡分离纯化法及结合少突胶质细胞定向培养基是培养少突胶质前体细胞的可靠方法;N2、PDGF、bFGF的添加可显著提高细胞产量,并使细胞保持在未成熟阶段.【总页数】3页(P1657-1659)【作者】唐军;钟琳;姚裕家;陈娟【作者单位】四川大学华西第二医院,儿科,成都,610041;四川大学华西第二医院,儿科,成都,610041;四川大学华西第二医院,儿科,成都,610041;四川大学华西第二医院,儿科,成都,610041【正文语种】中文【中图分类】R729【相关文献】1.成年SD大鼠胃窦Cajal间质细胞分离、培养及鉴定 [J], 张程程;彭艳;陈海交;杨建文;刘薇薇;刘丽2.SD大鼠腹腔脂肪干细胞分离培养和鉴定 [J], 张洋洋;陈良安3.新生SD大鼠心肌细胞分离培养及纯化的快速便捷方法及鉴定 [J], 付微;刘飞;乔陆明;张绪东4.新生大鼠高纯度少突胶质前体细胞系细胞的培养与鉴定:改良振荡分离纯化法的特点 [J], 殷红兵;丁爱石;吴卫平;范明5.新生大鼠大脑皮层少突胶质前体细胞的培养分离及鉴定 [J], 吴波;任先军因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

ｃ ｌ ｅ ｒ ａ ｅ ｆｅ ６ ｈ Ｔ ｅ ｌｇ ｒ ｍｉ ｒ ｗ ｈ ｄ ｒ ｔ ｎ ｏ ｅｌ ｓｆ ｕ ｄ ｔ ｎ ｅ ｓ ｄ ｃ ｓ ｄ ａｔ ｒ９ ． ｈ ｏ ａ ｉ ｅ ｈ ｔ ｃ ｇ ｏ ｔ ｕ ａ ｉ ｆｃ ｌ ｗａ ｏ ｎ ｏ ｂ — ａ ｓ ａ ｏ ｎ ｎ ｖｔ ｇｏ ｕ ａｉ ｏ ｔ ｏ
ｔ ｎ ｕ ｉ ｇｔ ｒ ｅ ｅ ｚ ｍｅ ｄ ｄ ｆ ｒ ｎｉｔ ｄ ａ ｃ ｏ ｎ ｔ ０ ． ｈ ｈ ａ ｔ ｃｕ ｅ ｏ ｅ ｏ ｅ ａ ｄ ｎ ｉ ｅ ｓｎ ｉ ｓ ｅ ｎ ｙ ｓａ ｉ ｅｅ ｔ ｅ ｈ ｒ ｇ ｍｅｌ ｄ Ｔ ｅｕ ｒｓｒ ｔｒ ｆｓ ａ ｈ ｃ ｌ ｗ ｓ ｉｅ ｔ ｄ ｕ ｉｇ ＨＥ． ｌ ｏ ｎ ｈ ｎ ａ ｎ ｉ ｌ ｕ ｉ ｆ Ｏｉ
ｔ ｌ ｓｕ ｔ ｈ ｕ ｖｖ ａｅａ ｏ ｅ９ ％． ｅｃ ｌ ｂ ｇ ｎｔ ｎ ｈ ｒａｔｒ５ｈ ｕｓ／ ／ ｏｃ ｌ ｒ ． ｎ ｈ ｒｗ ｈｒｔ ｆ ｉ ｅｔ ｓ ｅｗｉ ｔｅｓ ｒｉａ ｒｔ ｂ ｖ ０ Ｔ ｅｌ ｅ ａ ａ ｃ ｏ ｆ ｏ ｒ ｎ ｖｔ ｕｔ ｅ ａ ｄｔｅｇｏ ｔ ａｅｏ ｃ ｉ ｈ ｌ ｈ ｏ ｅ ｒ ｕ
构与支持细胞 的形态特征一致 。 可见 ， 采用三酶两步消化法和差异贴壁法 ， 可达到分离 、 培养 、 纯化Ｓ 大鼠支持细胞 的 Ｄ
目的 。
关键词： 睾丸 ； 支持细胞 ； 体外培养 ； 鉴定 ； Ｄ 鼠 Ｓ大
中图分类号 ：８ ２１ Ｑ ５ ．— ３１ ￥ ５ ．； ９４６ ３ ＋ 文献标识码 ： Ａ 文章编号 ：０２ ８ ６ （０ ０ Ｏ — ２ ９ ０ １０ — １ １２ １ ）３ ０５ — ４
（ Ｃ ｒ ｇ ｆ ｎｍ ｌ ｃｅｃ ｎ ｅｈ ｏｏｙ Ｇ ａｇｉ ｎｖｒｔ， ａｎｎ ３０ ５ Ｃ ｉ ； ｉｅ Ｂｏ ｃ ｎｌ １ ｏ ｅｅ ｉ ａ Ｓ ｉ ｅａｄＴｃ ｎｌ ， ｕ ｎｘ Ｕ ｉ ｓｙ Ｎ ｎ ｉ ５ ０ ０ ， ｈｎ ２Ｗｅ ｉ ｉｅｈ ｏ ｇ ｔ ｏＡ ｎ ｇ ｅｉ ｇ ａ ｍ ｔ ｏ ｙ

大鼠小胶质细胞原代培养及分离纯化实验方案经过相关文献阅读，参考了众多对于小胶质细胞培养方案，对比了不同方案的利弊优缺，整合了相对符合本实验室条件和实验要求的方法，如有其他变更方案，以修改后为准。

1.实验材料剪刀、小镊子、小毛刷、DMEM/F12培养液、胎牛血清、0.05% 胰蛋白酶、PBS液、恒温细胞培养箱、倒青霉素、链霉素、培养皿离心管、50 mL 细胞培养瓶、CO2置相差显微镜、细胞板、小鼠抗大鼠OX42单克隆抗体、SP免疫组化试剂盒和新生SD大鼠等2.实验步骤2.1小胶质细胞的混合培养取新生SD大鼠若干只(出生24h内),在无菌条件下断头, 迅速剪开颅骨, 取出脑组织至盛有冷PBS 液的培养皿中反复冲洗以去除血污; 再把全脑移入另一盛有PBS 液的培养皿中, 用小毛笔轻轻刷去脑表面的脑膜和血管, 用PBS液冲洗后剪去脑干仅留大脑半球; 用小剪刀充分剪碎脑组织, 加入比组织块总量多30~50倍的0.05% 胰酶, 再移入50 mL 离心管, 用吸管反复吹打消化至肉眼观察无明显的脑组织团块; 加入DMEM/F12 完全培养基(含10%胎牛血清、100U/mL 青霉素和100 ug/mL 链霉素) 终止消化, 再次反复吹打制成单细胞悬液, 配平, 1000 r/ min, 离心5min, 弃上清; 加定量完全培养液再次制成细胞悬液, 更具实验需要接种入若干个50 mL细胞培养瓶或者培养皿中, 置于5%CO恒温细胞培养箱( 372度) 培养; 3 h 后更换1 次培养液, 以后每3 d 换1 次液, 并在镜下观察细胞的生长和存活情况。

2.2小胶质细胞的分离和纯化细胞培养18 d~20d左右, 在倒置相差显微镜下可观察到混和胶质细胞培养物中出现细胞分层现象, 即底层为扁平、多种形状的、具有多个突起的大细胞(星型胶质细胞) , 而上层细胞明显偏小呈类圆形、折光性强, 附着于星型胶质细胞表面生长(小胶质细胞) ; 倒掉培养液, 用0.05%胰酶2~ 3 mL 消化, 边观察边轻轻晃动培养瓶, 等到贴附在星形胶质细胞上的小胶质细胞脱离下来, 将含漂浮的小胶质细胞的消化液转入10 mL离心管, 立刻用完全培养基终止消化。

大鼠少突胶质细胞的纯化培养与鉴定【摘要】目的探讨新生2 d Sprague Dawley(SD)大鼠脑少突胶质细胞的分离方法和生长条件，为少突胶质细胞损伤后髓鞘形成障碍或脱髓鞘疾病的研究奠定基础。

方法根据星形胶质细胞和少突胶质细胞的生长时间差异、细胞生长方式及细胞对培养层粘附等特性的不同，采用两次恒温摇床振荡分离纯化法和条件限定培养基培养获取并鉴定高纯度的大鼠少突胶质细胞。

结果培养出突起有如蜘蛛网状的成熟少突胶质细胞，半乳糖脑苷脂（Galactocerebroside，Gal）阳性。

结论两次恒温摇床振荡分离纯化法和条件限定培养基培养可获取高纯度的大鼠少突胶质细胞。

【关键词】少突胶质细胞；细胞培养；纯化；鉴定Abstract: Objective To culture, purify and identify the astrocytes and oligodendrocytes from rat cerebral tissue. Methods Based on the different properties of developmental time courses，cellular adhesions and growth pattern of astroglial cells and oligodendrocytes，oligodendrocytes were cultured and purified by orbital shaking for twice and the defined culture medium and identified by immmunofluorescent staining. Results The ripe oligodendrocytes were cultured and identified by galactocerebroside. Conclusion The method we used was suitable and effective to obtain oligodendrocytes.Keywords: oligodendrocyte; cultivation; purification;identification少突胶质细胞是中枢神经系统的髓鞘形成细胞，它起源于胚胎神经管的神经上皮细胞，随着中枢神经系统的发育，逐步迁移到白质，并增殖、分化，形成髓鞘包裹轴突。

新生大鼠原代小胶质细胞分离培养方法的改良钱凯;唐琳俊;王希;杨坤;张开鑫;钱腾达;马涛;石晶;李立新【摘要】目的研究改良体外小胶质细胞分离培养的方法及效果.传统法存在动物用量大、成本高且细胞培养时间长等局限.方法结合消化试剂组合和手摇震荡法培养分离小胶质细胞;同时采用Iba-1免疫荧光法进行细胞鉴定和纯度分析, 台盼蓝染料法进行活力检测以及脂多糖刺激比较不同状态的小胶质细胞.结果改良法可在4 d 内稳定获得小胶质细胞＞1. 0×106个/60 mm培养皿, 纯度≥98％, 活力＞ 98％, 较传统法在动物用量、总成本和培养时间分别减少了2、3. 2、1. 5倍.结论改良法可减少动物用量、降低成本, 缩短细胞培养时间;为研究小胶质细胞的生物学功能和中枢神经系统疾病机制建立了一种稳定、简便、高效的细胞模型.%Objective Isolation and culture of microglia in vitro has been widely used to explore new therapeutic strategies for various central nervous system diseases, but the existing protocols need a large amount of animal, higher cost and long culture time. Methods Combination of a unique combination of digestive reagents and shaking by hand were used to isolate and purify microglia. The purity of isolated cells was identified by expression of Iba-1 utilizing immunofluorescence technique and the viability of microglia was determined with trypan blue exclusion. Meantime, comparing the different states of microglia using the lipopolysaccharide test.Results The present modified methodology steadily yielded 1. 0 × 106 microglia per 60 mm dish with high purity (≥ 98％) and high survival rate (＞ 98％) within four days. Compared to the existing protocols, the animal dosage, total cost and culture time were reduced by 2, 3. 2 and 1. 5 times, respectively.Conclusion The improved method establishes a stable, simple and efficient cell culture model for studying the biological functions of microglia and elucidating the mechanisms of related CNS diseases.【期刊名称】《临床神经外科杂志》【年(卷),期】2019(016)001【总页数】5页(P1-5)【关键词】小胶质细胞;原代培养;新生大鼠【作者】钱凯;唐琳俊;王希;杨坤;张开鑫;钱腾达;马涛;石晶;李立新【作者单位】南京医科大学第一附属医院神经外科,210029 南京;安徽省芜湖市第二人民医院神经外科;南京医科大学第一附属医院神经外科,210029 南京;南京脑科医院神经外科,210029 南京;南京医科大学第一附属医院神经外科,210029 南京;南京医科大学第一附属医院神经外科,210029 南京;南京医科大学第一附属医院神经外科,210029 南京;南京医科大学第一附属医院神经外科,210029 南京;南京医科大学第一附属医院神经外科,210029 南京【正文语种】中文【中图分类】RQ78;RQ-33小胶质细胞是一类起源于单核-巨噬细胞系、位居于中枢神经系统的细胞种群[1]。

小鼠星形胶质细胞原代培养及分离纯化实验方案小鼠星形胶质细胞（astrocytes）是中枢神经系统中一种重要的胶质细胞，主要起支持和维护神经元生存、供能以及调节神经元活动等功能。

原代培养和分离纯化小鼠星形胶质细胞是研究其生物学特性和相关疾病发生机制的重要实验方法。

以下是一种常用的小鼠星形胶质细胞原代培养及分离纯化实验方案。

实验材料和仪器：1.小鼠（新生仔小鼠）2.离心管、培养皿、显微镜3.无菌生理盐水、套管、吸头4. DMEM/F12培养基、FBS、胰蛋白酶、DNase I5.离心机、试管摇床、显微镜、离心管架6.显微针、细胞计数板、加热振荡器实验步骤：1.小鼠的准备：a.使用新生仔小鼠，从母鼠的子宫中取出。

b.将小鼠头部朝下放在无菌生理盐水中，用套管轻轻吸出小鼠颅内的脑组织。

c.将脑组织转移到含有DMEM/F12培养基的离心管中，并用离心管摇床低速振荡15-20分钟使细胞均匀分散。

2.细胞分离：a.将离心管架放在显微镜下，用显微针将脑组织均匀挫碎。

b.将脑组织转移到含有DMEM/F12培养基的培养皿中。

c. 添加0.25%胰蛋白酶和10 U/ml DNase I，37°C孵育30分钟。

d.轻轻吸入含有酶切的脑组织，并用吸头轻轻洗涤脑组织，收集上清液。

e.将上清液通过0.22μm的滤网过滤，除去大颗粒的细胞。

3.细胞培养：a. 将滤过后的细胞悬液计数，计算细胞密度并将其稀释至10^6细胞/ml。

b.取DMEM/F12培养基，添加10%FBS，将稀释后的细胞悬液转移到培养皿中。

c.在培养皿中加入5%CO2，37°C孵育。

d.每两天更换一次培养基，直到细胞至80%～90%的密度。

4.纯化小鼠星形胶质细胞：a.将培养皿中的细胞收集到离心管中，进行离心。

b.用无菌生理盐水洗涤细胞，去除不附着的细胞和残留的培养基。

c.将洗涤后的细胞用DMEM/F12培养基重新悬浮，计数并计算细胞密度。

d.用磁层细胞分选仪，通过细胞表面标记的抗体对细胞进行阳性选择，分离纯化小鼠星形胶质细胞。

收稿日期：2009－12－24基金项目：广西自然科学基金项目（桂科自0991045）；广西大学创新课题计划项目（T32011）作者简介：姚玲（1984－），女，广西来宾人，硕士研究生，研究方向为动物解剖与组织胚胎学。

*为通信作者，E－mail ：0334130320＠163．com 。

睾丸支持细胞（Sertoli cell ，SC ）是生精细胞的支架，为生精细胞提供必需的营养物质，能合成与分泌雄激素结合蛋白（Androgen binding protein ，ABP ），为生精细胞提供高浓度的雄激素环境等。

近年来，关于睾丸支持细胞的研究越来越多，在国内已有不少学者对啮齿动物大鼠［1］、小鼠［2］以及家畜犊牛［3］、仔猪［4］、兔子［5］，甚至家禽鸡［6］的睾丸支持细胞进行详细研究，但目前有关支持细胞分离、纯化等体外培养条件多种多样，其鉴定方法也各不相同。

为此，本研究在现有基础上，简化并优化了实验步骤，为支持细胞的培养及鉴定提供更合适的参考。

1材料与方法1．1试验动物试验动物为21日龄断奶SD 雄性大鼠，由广西中医学院实验动物中心提供，其睾丸未下降至阴囊，个体尚未达性成熟。

SD 大鼠睾丸支持细胞的分离、培养、纯化及鉴定姚玲1，李春艳1，李晓剑1，黎宗强1*，谢丽萍2，张留光1，靖蓓蓓1（1广西大学动物科学技术学院，南宁530005；2广西玮美生物科技有限公司，南宁530023）摘要：为进一步简化、优化SD 大鼠睾丸支持细胞的体外培养条件及鉴定方法，采用三酶两步消化法和差异贴壁法分离、培养、纯化SD 大鼠支持细胞，并用HE 染色、油红染色、Feulgen 染色及透射电镜扫描其超微结构予以鉴定。

结果表明：平均0．10g 睾丸组织可获得2．5×106个支持细胞，细胞存活率90％以上，体外培养5h 后开始贴壁，96h 后细胞生长速率下降，其对数生长期为3～7d ，整个体外生长周期约为10～15d 。

SD大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养方法的研究刘树辉;曹中伟;秦书俭;马云胜;郑德宇【期刊名称】《辽宁医学院学报》【年(卷),期】2006(027)002【摘要】目的探讨大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)分离培养的适宜条件.方法取1、2、4个月大鼠各6只,分离MSCs,以0.5×105/ml、1×105/ml、2×105/ml密度接种,通过倒置显微镜观察MSCs增殖情况,绘制生长曲线.流式细胞仪观察细胞周期并绘制细胞周期图.结果利用贴壁法成功培养出MSCs并能使之分裂增殖,但随着传代次数的增加,增殖能力有所下降.在培养过程中大鼠年龄要控制在2月以内,接种密度以1×105/ml适宜.结论贴壁培养法是一种简便易行的培养MSCs方法,操作简单,成功率高,可以作为培养SD大鼠MSCs常规方法.【总页数】3页(P35-37)【作者】刘树辉;曹中伟;秦书俭;马云胜;郑德宇【作者单位】锦州医学院解剖教研室,辽宁,锦州,121000;锦州医学院解剖教研室,辽宁,锦州,121000;锦州医学院解剖教研室,辽宁,锦州,121000;锦州医学院解剖教研室,辽宁,锦州,121000;锦州医学院解剖教研室,辽宁,锦州,121000【正文语种】中文【中图分类】R3【相关文献】1.大鼠骨髓间充质干细胞分离和培养方法的研究 [J], 谭琦;黄政德;王立凤2.SD大鼠骨髓间充质干细胞体外分离培养的实验研究 [J], 李静;苏一鸣;蔡鹏;朱绍兴3.人骨髓间充质干细胞体外分离培养方法的比较研究 [J], 丁伟荣;吴晓牧;饶燕飞;杨志刚;柳喆;张水生4.大鼠骨髓间充质干细胞分离培养方法的实验研究 [J], 张本斯;陈红;王松;邓世山;王凡5.采用1.068g/ml分离液对犬骨髓间充质干细胞的分离纯化与体外培养方法的探讨 [J], 牛国栋;任晓庆;王方正;浦介麟;杨国胜;孟亮;张澍因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

2．1小胶质细胞的原代细胞培养2．1．1混合胶质细胞培养自中山大学北校区动物中心购买刚出生1天内的SD乳鼠，用75％酒精消毒后固定四肢，剪开皮肤、颅骨，取出脑组织放入PBS液中洗涤一次，分离脑干取出，脑膜及血管尽量剥离，将组织放入盛有DMEM／F12无血清培养基的培养皿中，移至离心管中剪碎，加入浓度为0．125％的胰蛋白酶，37。

C水浴箱中消化15分钟，血清终止消化，待组织沉淀后收集上液，余下组织可通过反复吹打进行再次消化，经过709m细胞滤网过滤，收集滤液，1500r ／min离心5分钟，去上清，加入完全培养基悬浮细胞后进行细胞计数，以1*106接种至预先用多聚．L．赖氨酸铺被的75cm2培养瓶中。

24d'时后稍微轻摇下未贴壁及贴壁不稳的细胞碎片，全量更换培养基，随后4天／次换液，约至10天左右可见明显的细胞分层，上层为半贴壁，呈圆形，透光性较好，主要为小胶质细胞及少量的少突胶质细胞，下层细胞主要为星形胶质细胞、神经元。

第一章原代小胶质细胞的培养、纯化及鉴定2．1．2小胶质细胞分离及纯化：机械振摇法：将铺满胶质细胞／神经元的培养瓶置于摇床振摇，180r／min，15rain，将培养基吸出，并用PBS冲洗1遍，收集脱落的细胞，1500r／s 5min离心，去除上清液，加入完全培养基，吹打混匀，计数，(34+39+30+33)／4×104／ml，以3×105／孔的浓度将细胞种入6#L板(已放置盖玻片)，37。

C 5％C02温箱培养15．30分钟，更换培养基，即去除延迟贴壁的少突胶质细胞，贴壁细胞即为纯化的小胶质细胞。

分离后的底层混合细胞继续加入15％FBSDMEM／F12培养基，4．5天后可以再次收获小胶质细胞。

2．1．3免疫荧光鉴定步骤1)小胶质细胞接种第2—3天后，待细胞在盖玻片上伸出伪足时，自培养箱中取出。

2)用预温的PBS洗3次，每次5分钟3)4％多聚甲醛室温固定20分钟左右4)PBS洗3次，每次5分钟5) 5％BSA室温封闭30分钟6)加抗Iba抗体(用1％BSA稀释)放在湿盒里，4V过夜7)PBS洗3次，每次5分钟8)DIIFITC．山羊抗小鼠IgG(用1％BSA稀释)避光孵育1小时9)PBS洗3次，每次5分钟10)DIIDAPI(用1％BSA稀释)避光孵育5分钟11)1xPBS洗3次，每次5分钟12)95％甘油封片。

实验材料：
? 6~8 周龄雄性SD大鼠，体质量 80~100 g ，清 洁级，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司 [许可证号为SC-XK(沪)20192-005] 。胎牛血清 (美国Hyclone 公司)，L-DMEM 培养基(美国 Gibco公司)，胰酶( 美国Gibco 公司)，CD34FITC 抗体、CD45-FITC 抗体、CD90-FITC 抗 体(英国AbD Serotec 公司)，CD29-FITC抗体 (美国Biolegend 公司)
2、大鼠 BMSCs 的传代与纯化
? 传代细胞呈圆形，很快开始贴壁， 3~6h后基 本完成贴壁。贴壁细胞初期伸出伪足呈梭形或 多角形，少部分圆形细胞悬浮，折光性差，随 换液除去。传代 1~2d后贴壁细胞分布均匀， 细胞形态逐渐趋于一致，以梭形为主，胞体饱 满，增殖迅速， 3~4d后即可长满培养瓶底。 多次传代的 BMSCs达融合生长时，细胞形态 更趋一致，形成更均匀有序的放射状或漩涡状 排列，说明 BMSCs得到进一步纯化。
2、大鼠BMSCs P4 细胞成骨、成脂诱导分化鉴定
? (1)向成骨细胞诱导分化：待培养的BMSCs P3细胞生长至80%~90%的 融合，加入0.25íTA- 胰酶消化后，以2×104/孔的密度接种于6孔培 养板，常规培养1d后，诱导分化培养组(实验组)加入2 ml成骨诱导分化 培养液，基础培养组(对照组)加入等量基础培养液，每3d换液1次。成骨 诱导21d后，进行茜素红染色检测，确定细胞外基质的矿化。
试验方法：
? 全骨髓贴壁培养法分离大鼠 BMSCs，体外培 养和连续传代，在倒置相差显微镜下连续观察 细胞的形态变化，利用 MTT法测定其生长曲线， 流式细胞仪鉴定其表面抗原，成骨、成脂肪诱 导分化鉴定其多向分化潜能。

5、0.01% L-多聚赖氨酸溶液的配制：称量 10mg L-多聚赖氨酸，溶于 100ml 灭菌去离子水，0.22µm 正压滤器过滤分装，-20保存。
6、0.4%台盼蓝溶液的配制 台盼蓝 4 g PBS 少许（研磨） PBS 定容至 100ml，滤纸过滤，室温保存。
7、4%多聚甲醛的配制： 多聚甲醛 4 g PBS 溶液 100ml 加热至 60，边滴加 1mol/L NaOH 边搅拌，至液体澄清。
2、小鼠小胶质细胞的混合培养
（1） 75%（体积分数）酒精消毒新生 24h 内的清洁级小鼠，在无菌条件下断头，剪开头皮及颅骨，取出脑组织，置于盛冷的pH7.2,无 钙、镁的D-Hank's液的平皿中（下置冰袋）。
（2） 无菌剥离脑组织，除去小脑、海马、大脑髓质,分离大脑皮层，仔细剥离脑膜及血管。 （3）用虹膜剪将组织剪切成 1mm3左右的组织块，0.125%胰蛋白酶消化，37作用 20min，期间振摇 2～3 次。 （4）弃去上清液，加入完全接种液终止消化，漂洗两次。巴斯德吸管轻轻吹打至肉眼观察无明显的脑组织团块，静置 2min。 （5）悬液收集于新的离心管，离心（1000r/min，10 min，4），弃去上清液。加入完全培养液重悬，200 目不锈钢网过滤。根据实验需要 接种于若干个25cm细胞培养瓶或培养皿中。 （6）置 37、5%CO2培养箱培养24h后更换一次培养基，以后每3d换一次液，并在镜下观察细胞的生长和存活情况。
（3）离心管配平,1000r/min, 离心5min, 弃上清；加定量完全培养再次吹打成细胞悬液,接种于预先包被的置有盖玻片的24孔培养板,置于 CO2恒温细胞培养箱(37度)培养。
生长24h后吸掉培养液,以去除未贴壁的少突胶质细胞,加完全培养液继续培养。