全外显子组测序在肺癌的发病机制研究和诊治中的临床意义

２０１９年　２月第３９卷　第２期基础医学与临床Ｂａｓｉｃ＆ＣｌｉｎｉｃａｌＭｅｄｉｃｉｎｅＦｅｂｒｕａｒｙ２０１９Ｖｏｌ.３９　Ｎｏ.２

收稿日期:２０１７￣１１￣０９ 修回日期:２０１８￣０３￣２７基金项目:湖北省教育厅重点项目(Ｄ２０１７１２０５)ꎻ湖北省自然科学基金(２０１７ＣＦＢ４５５)∗通信作者(ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ):ｚｒｔ０１１６＠１２６.ｃｏｍ

文章编号:１００１￣６３２５(２０１９)０２￣０２７２￣０５短篇综述　全外显子组测序在肺癌的发病机制研究和诊治中的临床意义唐永莉ꎬ张瑞涛∗(三峡大学医学院ꎬ湖北宜昌４４３０００)

摘要:全外显子组测序(ＷＥＳ)是利用序列捕获技术将全外显子区域ＤＮＡ捕捉并富集后进行高通量测序的基因分

析方法ꎮ外显子组测序较全基因组序列测序更简便、经济和高效ꎬ其目标区域覆盖度也更高ꎬ便于变异检测ꎮ外显子组测序技术已经应用到寻找与各种复杂疾病相关的致病基因和易感基因的研究中ꎮ肺癌是常见的恶性肿瘤之一ꎬ基于国内外对全外显子测序在肺癌中的研究成果ꎬ现就全外显子测序在肺癌的诊治以及肺癌的发生机制的研究进行综述ꎮ关键词:全外显子组测序ꎻ肺癌ꎻ易感基因ꎻ基因突变

中图分类号:Ｒ７３４􀆰２ 文献标志码:Ａ

Ｃｌｉｎｉｃａｌｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅｏｆｗｈｏｌｅｅｘｏｍｅｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｉｎｍｅｃｈａｎｉｓｍｒｅｓｅａｒｃｈａｎｄｔｒｅａｍｅｎｔｉｎｌｕｎｇｃａｎｃｅｒ

ＴＡＮＧＹｏｎｇ￣ｌｉꎬＺＨＡＮＧＲｕｉ￣ｔａｏ∗

(ＭｅｄｉｃａｌＣｏｌｌｅｇｅｏｆＣｈｉｎａＴｈｒｅｅＧｏｒｇｅｓＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬＹｉｃｈａｎｇ４４３０００ꎬＣｈｉｎａ)

Ａｂｓｔｒａｃｔ:Ｗｈｏｌｅｅｘｏｍｅｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ(ＷＥＳ)ｉｓａｇｅｎｅａｎａｌｙｓｉｓｍｅｔｈｏｄｔｈａｔｕｓｅｓｔｈｅｓｅｑｕｅｎｃｅｃａｐｔｕｒｅｔｅｃｈ￣ｎｉｑｕｅｔｏｃａｐｔｕｒｅａｎｄｅｎｒｉｃｈｔｈｅｗｈｏｌｅｅｘｏｎｒｅｇｉｏｎＤＮＡａｎｄｔｏｐｅｒｆｏｒｍｈｉｇｈ￣ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ.ＷＥＳｃａｎｂｅｕｓｅｄｔｏｄｅｔｅｃｔｇｅｎｅｔｉｃｍｕｔａｔｉｏｎｓａｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈｐｒｏｔｅｉｎｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙｄｉｒｅｃｔｌｙ.ＳｉｎｃｅｔｈｅＷＥＳｉｓｓｅ￣ｑｕｅｎｃｅｄｏｎｌｙｆｏｒｔｈｅＤＮＡｏｆｔｈｅｅｘｏｎｒｅｇｉｏｎꎬｉｔｉｓｍｕｃｈｓｉｍｐｌｅꎬｍｏｒｅｅｃｏｎｏｍｉｃａｌａｎｄｅｆｆｉｃｉｅｎｔｔｈａｎｔｈｅｗｈｏｌｅｇｅｎｏｍｅｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇꎬａｎｄｉｔｓｔａｒｇｅｔａｒｅａｃｏｖｅｒａｇｅｉｓｈｉｇｈｅｒꎬｗｈｉｃｈｉｓｅａｓｙｔｏｄｅｔｅｃｔ.ＡｔｐｒｅｓｅｎｔꎬＷＥＳｈａｓｂｅｅｎａｐｐｌｉｅｄｔｏｔｈｅｓｔｕｄｙｏｆｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｇｅｎｅｓａｎｄｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙｇｅｎｅｓａｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈｖａｒｉｏｕｓｃｏｍｐｌｅｘｄｉｓｅａｓｅｓｓｕｃｈａｓｌｕｎｇｃａｎｃｅｒ.ＩｎｔｈｉｓｐａｐｅｒꎬＴｈｅｃｌｉｎｉｃａｌｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅｏｆＷＥＳｉｎｍｅｃｈａｎｉｓｍｒｅｓｅａｒｃｈａｎｄｔｒｅａｍｅｎｔｉｎｌｕｎｇｃａｎｃｅｒｗａｓｂｅｅｎｒｅｖｉｅｗｅｄ.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ:ｗｈｏｌｅｅｘｏｍｅｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇꎻｌｕｎｇｃａｎｃｅｒꎻｐｒｅｄｉｓｐｏｓｉｎｇｇｅｎｅｓꎻｇｅｎｅｍｕｔａｔｉｏｎ

外显子组是一个物种基因组中全部外显子区域的总和ꎬ它是基因行使其功能最直接的体现ꎮ人类外显子组序列约占人类全部基因组序列的１％ꎬ但大约包含８５％的致病突变ꎮ全外显子组测序(ｗｈｏｌｅｅｘｏｍｅｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇꎬＷＥＳ)是一种高效的基因组分析法ꎬ基于捕获技术的准确性和测序技术的高通量性ꎬ将基因组中全部的外显子区域捕获富集并进行测序ꎮ外显子组测序是一种特异性测序ꎬ单纯针对基因组编码区域及其侧翼序列ꎮ其基本流程包括外显子区域序列的富集、高通量测序及测序数据唐永莉　全外显子组测序在肺癌的发病机制研究和诊治中的临床意义的生物信息学分析ꎮ２００９年科学家利用全外显子测序ꎬ找到了弗里曼谢尔登综合征患者的ＭＹＨ３突变ꎬ为全外显子作为遗传学研究的工具奠定了基础[１]ꎬ２０１３年ꎬ对于外显子测序可用于临床诊断以及外显子测序的操作流程和生物信息学分析有了具体介绍ꎬ并提示外显子组测序可用于遗传病的临床诊断[２]ꎮ２０１４年制定了人类疾病遗传变异研究指南和高通量测序临床应用指南ꎬ对于全外显子测序有了更深的认识[３￣４]ꎮ近几年利用外显子测序诊断出相应遗传疾病已经较为普遍[５￣６]ꎮ在２０１５年的肿瘤统计中ꎬ新发生癌是４􀆰２９２×１０６例ꎬ因癌的死亡有２８􀆰１４１×１０６例ꎬ其中肺癌是主要的导致肿瘤相关性死亡的原因[７]ꎮ对于肺癌的治疗主要是手术治疗辅以化疗ꎬ对于肺癌早期的诊断均不理想ꎮ本文就全外显子测序在肺癌的诊治以及肺癌的发生机制的研究进行综述ꎬ以期了解肺癌在基因水平的研究进展ꎮ１　全外显子测序在肺癌中的应用１􀆰１　利用全外显子测序探索肺癌的起源与克隆演化肿瘤的发生发展是一个涉及多基因、多因素的复杂过程ꎬ癌的形成的演化过程称为克隆演化(ｃｌｏｎａｌｅｖｏｌｕｔｉｏｎꎬＣＥ)ꎮ肿瘤基因组较正常组织具有更高度的复杂性ꎬ表现为基因的变异呈现时空分布的差异性、基因表达调控和表观遗传模式上多样性ꎮ全外显子测序技术的兴起使人们对于肿瘤的起源以及演化有了更多的认识ꎮ利用全外显子组测序发现耐酪氨酸激酶抑制剂的ＥＧＦＲ突变肺腺癌和小细胞肺癌有相同的克隆起源ꎬＲＢ１和ＴＰ５３基因双重失活ꎬ肺腺癌转化小细胞肺癌的风险高达４２􀆰８倍[８]ꎮ对于小细胞肺癌的肿瘤性和非小细胞肺癌的内异质研究表明ꎬ在不同区域的肿瘤组织中有不同的肿瘤内异质性[９￣１０]ꎮ利用全外显子组测序ꎬ结合显微切割激素多时空和多区域的取样ꎬ肿瘤的克隆演化的研究有了更多的进展ꎬ大量的研究已证明肿瘤内异质性普遍存在ꎮ这些研究更准确的认识肿瘤的转化状态ꎬ但是单次活检有４２％的概率漏掉驱动突变ꎬ提示分期越高的队列中单次活检漏掉驱动基因的风险越大[１０]ꎮ肿瘤的驱动基因常常是药物标靶以及预后评估指标ꎬ因此提示驱动基因的临床意义还需要考虑肿瘤内异质性ꎬ从而得到更精确的靶向治疗ꎮ对于引起肿瘤内质性相关的生物学研究还不明确ꎬ还需要更一步研究ꎮ１􀆰２　全外显子测序研究肺癌高危因素

肺癌的高危因素多基于大数据的统计研究ꎬ利用数据的相关性缺少进一步的机制研究ꎬ利用全外显子组测序研究肺癌与其暴露因素的关系ꎬ从而可以从基因水平寻找确切证据ꎮ一份关于多源癌(原发肺腺癌、肺鳞癌和６年后再发现腹部恶性间皮瘤)的病例ꎬ对这３种肿瘤组织进行全外显子测序来探讨致病基因及易感基因ꎬ结果显示３种肿瘤是单独起源的ꎬ对于间皮瘤的发生很可能与ＢＡＰ１和ＥＴＤ２突变有关ꎬ新发现的基因ＷＴ１突变可以解释

与石棉的暴露无关[１１]ꎮ一直以来研究者认为吸烟

与ＣＯＰＤ和肺癌有很大的关系ꎬ利用全基因组关联分析ꎬ现已知与肺癌易感有关的基因突变位点２８个ꎬ与吸烟有关的基因突变３２个ꎬ与ＣＯＰＤ有关的基因突变１０个ꎬ与肺功能有关的６３个ꎬ没有重复的１０７个ꎮ为了研究这些因素和肺癌的关系ꎬ研究者

利用４８例散发的肺癌和５３例肺癌家系的肿瘤组织进行全外显子测序ꎬ结果找到了２个少见的突变(ＣＣＤＣ１４７、ＢＨ)可能与肺癌的发生有关[１２]ꎮ对于

与ＣＯＰＤ、吸烟和肺功能损伤引起肺癌的机制还不明确ꎬ综合的利用外显子测序研究还需要大量的样本ꎮ１􀆰３　利用ＷＥＳ寻找肺癌早期诊断标准物及分子

靶点肺癌诊断方法现有肺部ＣＴ、各种支气管镜、分子生物学以及经皮肺穿刺痰液、胸腔积液等细胞学检查ꎬ这些检查由于检查的灵敏性以及特异性ꎬ往往诊断为肺癌的时候已经是晚期ꎬ肺癌的早期诊断仍不理想ꎮ全外显子测序寻找肺癌易感基因以及驱动基因可以作为肺癌早期诊断的生物标志物及早期预防ꎮ早期研究表明ＨＹＡＬ和ＦＨＩＴ缺失可以作为有吸烟史的ＮＳＣＬＣ患者的早期诊断标志物ꎬＸＲＣＣ４Ｇ￣１３９４Ｔ的Ｇ位点可作为早期肺癌的诊断和预测靶

点ꎬ异柠檬酸脱氢酶(ＩＤＨ１)在ＮＳＣＬＣ中高表达ꎬ可作为ＮＳＣＬＣＤ的分子标志物ꎮ近期研究者对非小细胞肺癌组织进行全外显子组测序ꎬ发现了组蛋白甲

３７２基础医学与临床 Ｂａｓｉｃ＆ＣｌｉｎｉｃａｌＭｅｄｉｃｉｎｅ２０１９􀆰３９(２)基转移酶基因ＭＬＬ２突变ꎬ表明ＭＬＬ２突变可能与肺癌的发生有关[１３]ꎮ同时对小细胞肺癌(ＳＣＬＣ)运用外显子测序发现ꎬＳＯＸ２基因作为致癌基因在ＳＣＬＣ中扮演重要角色[１４]ꎬ相继利用外显子组测序研究肺癌家族发现ＮＢＮ基因突变[１５]ꎬＢＰＩＦＢ１研究表明在肺癌中有不同的表达[１６]ꎮ液体活检主要是以患者的体液为标本捕捉体液中的循环肿瘤细胞(ＣＴＣ)、循环肿瘤ＤＮＡ(ｃｔＤＮＡ)和外泌体(ｅｘｏｓｏｍｅ)ꎮ相对于ＣＴＣꎬｃｔＤＮＡ还可以用于微小残留病变的检测、肿瘤的进化、耐药监测以及肿瘤的实时监测ꎬ全外显子测序是实现这些的理想工具ꎮ有研究认为在外周循环物中查找肿瘤标志物是可行的[１７￣１９]ꎬ但是还没有应用于临床ꎮ对非小细胞肺癌患者的癌组织和血液样品进行对比测序显示样本中ＮＳＣＬＣ外显子组的突变ꎬ在相应的血清样品中也发现相应的突变[２０]ꎮ对于血液里已经找到的突变ꎬ以前有研究表明ꎬ在同一个人的不同组织中有相应的突变ꎬ这说明可能来自于正常的组织[２１￣２４]ꎬ对于在外周血内游离ＤＮＡ中寻找肿瘤标志物ꎬ应用于临床还需要更进一步的研究ꎮ对于复杂疾病而言ꎬ散发病例的易感基因多来源于新生突变(ｄｅｎｏｖｏｍｕｔａｔｉｏｎｓ)ꎬ而家系的易感基因则多来自于遗传突变ꎬ肺癌家族的基因突变报道有ＡＴＭ、ＴＰ５３、ＢＲＣＡ２、ＥＧＦＲ和ＰＡＲＫ２[２５]ꎬ它们分别来自不同的家族ꎬ既有吸烟患者也有不吸烟的患者ꎮ在外显子测序技术出现以后ꎬ对于肺癌的致病基因以及易感基因的筛查越来越多ꎬ多种遗传突变的基因(ＭＡＳＴ１、ＣＥＮＰＥ、ＬＣＴ)被发现ꎬ这些基因很可能与肺癌患者的癌症发展有关[２６￣２８]ꎬ为癌家族的易感基因研究以及家族的癌症预防提供靶点ꎮ二代测序的兴起使相关的驱动基因及相关的分子靶点也越来越多的被发现ꎬ结合信号通路及相关的分析生物活性的研究将会为肿瘤的治疗提供重要的基础ꎮ１􀆰４　全外显子测序在肺癌免疫治疗中的应用全外显子测序可以检测肿瘤突变负荷(ｔｕｍｏｒ￣ｍｕｔａｔｉｏｎｂｕｒｄｅｎꎬＴＭＢ)ꎬ肿瘤突变的负荷不同ꎬ点抑制剂的作用也不同ꎬ这为肿瘤的精准治疗和个体化治疗进一步提供依据ꎬＴＭＢ可以预测ＰＤ￣１抑制剂纳武单抗(ｎｉｖｏｌｕｍａｂ)的疗效ꎮ美国癌症基因组研究计划(ＴｈｅＣａｎｃｅｒＧｅｎｏｍｅＡｌｔａｓꎬＴＣＧＡ)为肿瘤的研究提供了大量的资源ꎮ利用此资源ꎬ研究者用统计学的方法确定了几个预测的肺腺癌和肺鳞癌新表位ꎬ４７％的肺腺癌和５３％的肺鳞状细胞癌样本具有至少５个预测的新表位[２９]ꎬ利用全外显子测序的方