全外显子组测序的具体方法及步骤

全外显子捕获测序的杂交和封闭原理
做外显子捕获测序实验时，会用到Cot DNA，blocker(封闭接头序列)，探针（DNA/RNA均可），链霉素磁珠等，它们具体起什么作用呢？下面，我们就来聊聊这个问题。

就实验原理来讲，外显子捕获测序的基本流程是：1.先对各个样品独立构建常规测序文库；2：等摩尔比例混合各个待杂交的文库；3：在杂交缓冲液体系内加入文库、杂交探针、Cot DNA、Blocker等；4.加入链霉素磁珠抓取杂交复合状态DNA；5：在洗脱缓冲液中洗脱目标文库，并扩增。

下图是正常建好的文库示意图。

大家都知道，DNA是双链互补配对的。

当加热打开DNA双链变性为单链DNA之后，慢慢降低温度，单链DNA会根据互补配对原则自然还原回双链状态（也就是退火过程）。

那么，可以想象一下，当很多不同的DNA文库混合在一起的时候，进行退火操作，可能会产生什么样子的DNA结合状态呢？下图说明了其中可能存在的3种情况。

由上图可知，不论哪种状态，都不可能捕获到目标DNA。

其实，情况2、3的杂交状中，P5或者P7端还可以杂交第三个、第四个等等分子。

所以，加入Blocker就是为了阻止P5、P7端的杂交，从而阻止非特异性杂交。

Cot DNA则是为了阻止原来互补配对的单链杂交回来。

带Biotin修饰的探针是为了杂交靶序列，链霉素磁珠是为了吸附Biotin修饰的杂交复合物。

全外显子测序报告解读原则与技巧全外显子测序是利用高通量测序技术对生物体全基因组外显子区域进行测序，从而揭示人类个体及群体基因组中与疾病相关的基因变异，是现代个性化医学的重要技术手段之一。

下面我们将介绍全外显子测序报告的解读原则和技巧。

解读原则：1.全面性：全外显子测序提供了全面、高通量的大量数据，必须对其进行全面、深入的解读。

同时需要结合临床资料，以全面、系统性的方式进行解读。

2.多参考性：全外显子测序可能会检测到一些变异，但并不一定与致病性相关。

因此，需要根据多个参考数据库、文献资料以及基于家系检测的疾病遗传性等多方面的数据进行判断和筛选。

3.个体化：全外显子测序报告需要与具体个体相关的临床资料、家族病史等进行结合，重点考虑与之相关的变异是否致病、临床意义何在等方面。

4.实用性：全外显子测序报告应当具有实用性，得出的结论应当能指导个体的诊断、治疗与遗传咨询。

解读技巧：1.对阳性结果进行验证：全外显子测序可能会检测到大量的单核苷酸多态性（SNP）、小的结构变异等，为了保证结果的精确性，最好对阳性结果进行验证，可以使用参考文献、数据库或其他现代检验技术进行检验。

2.避免过度解读：全外显子测序结果的解读需要考虑基因本身的复杂性，并非所有的变异都与疾病相关。

因此不应过度解读，需要根据科学方法进行分析和评价。

3.结合病史、家族史等临床资料：全外显子测序结果需要结合实际临床背景进行解读，包括基因检测的目的、临床表现、影响家庭、遗传风险等因素。

4.遵循实践指南：目前许多学会和机构都制定了全外显子测序报告解读的指南，如美国基因组医学协会（ACMG）和全球基因组联盟（GA4GH）等，解读应该遵循指南的原则和标准。

总之，全外显子测序是一项高复杂性的技术，其结果的解读需要谨慎，需要全面、深入地理解和分析，以确保结果的准确性和实用性。

同时，我们需要结合个体的临床信息和基因组数据来指导临床医生的决策和个体的诊断治疗方案，为个性化医学做出贡献。

全外显⼦组测序常见问题（上）1全外显⼦组测序必须要有参考基因组吗？必须有，如果没有参考因组，要提供近缘物种的序列，但不能保证捕获结果的可靠性。

因为捕获探针是根据提供的参考序列来设计的，如果已知⽬标区域与参考基因组⽐有较⼤出⼊，例如⼤⽚段的插⼊缺失，是不推荐的。

2为什么外显⼦测序在分析时需要跟全基因组⽐对，⽽不是直接与⽬标区域⽐对？第⼀，⽬标区域相对于全基因组⼀般较短，⽽且可能不连续，如果将⽬标区域单独提取出来，会影响区域边缘的序列⽐对效果；第⼆，⽆法评估捕获质量，例如脱靶率、on target⽐例等。

3全外显⼦组测序⼀般建议做多少倍的覆盖？⼀般做100×或150×。

较⾼的覆盖倍数，对于测异质性的遗传变质，可以发现⼩⽐例的突变。

另外，外显⼦测序的覆盖是随机的，这样较⾼的平均覆盖率有利于保证⼤部分的区域有⾜够的覆盖倍数。

4全外显⼦组测序深度的意义是什么？测序深度如何换算？测序深度代表了序列被探针组覆盖的次数，次数越⾼，测序结果的识别就越精确，后续的统计分析也就越准确。

如果做肿瘤、低频突变研究，建议测序深度⾄少应达到150×以上。

如果只看经典SNP、⾮低频突变，测序深度也⾄少应该在30×以上。

测序深度换算⽅法：⼀般⽬标区域的捕获效率在60-70%，安捷伦和罗⽒等外显⼦捕获试剂盒的⽬标区域⼤⼩在60Mb左右，即测序深度=10G*60%/60Mb=100×。

5全外显⼦组测序能够测出多⼤的⽚段缺失？⼤致能测出50bp的⽚段缺失。

由于外显⼦测序的覆盖很不平均，所以如果有⼤段的缺失，⽆法判断是因为杂交没有捕获到，还是因为缺失。

⽬前能够测到的，就是在⼀个read中发现的缺失。

⼀个read的长度也就是150bp，所以50bp以下的⽚段缺失可以从外显⼦测序中测出来。

6全外显⼦组测序可以做CNV分析吗？检测CNV的⽅法还有哪些？全外显⼦测序因为有⼀个杂交捕获的过程，这样就会有⼀个杂交捕获效率的问题。

针对外显子设计PCR测序引物教程在园子搜索后，没有看到长基因（大与1000base)最简洁方法，而我现在欧洲实验室里从事这方面工作，作了大量这方面的工作。

自乐不如同乐，愿将我们设计引物技巧与大家分享，敲字很辛苦，请斑竹给点分。

可能有战友说了，我们的长基因都是交给测序公司用鸟枪法来测全基因的。

当然，您有钱当然可以这样做。

我们的方法适用于基因测序筛查突变，步骤相对简便，比较经济。

另外，本实验室最近的一偏文章采用该法发在了NEMJ上，可见该法已经是经典成熟的。

（1）基础知识我们知道gDNA由非编码区，外显子，内含子构成。

我们关心的基因是否突变在非编码区，外显字以及临近外显子的一小段内含子上。

至于其他的内含子（gDNA中的大头），发生突变与否并不是我们关心的，其临床意义也相当小。

因此我们只要设计引物来PCR上面三个重点区域就可以了。

（2）设计软件在线设计软件exon primerhttp://ihg2.helmholtz-muenchen.de/ihg/ExonPrimer.html大家从上图可以看到，网页提示我们现在需要输入两个序列，一个是cDNA，一个是gDNA。

由于我们还要考虑非编码区，而CDNA是没有非编码区UTR的。

因此，我们必须要用mRNA 输入网页中的cDNA栏。

否则我们得到的引物不会包含UTR。

要是有看官还看不懂的话，建议看下分子生物学教材关于cDNA和mRNA的区别。

下面我们以smurf2基因来说明如何设计针对外显子的测序引物。

（2）找到smurf2 mRNA打开gene bank/,注意要在database中选nucleotide如下图蹦出一大串序列。

找到我们要的人类的smurf2Homo sapiens SMAD specific E3 ubiquitin protein ligase 2 (SMURF2), mRNA直接点我们要的序列名字，就得到了mRNA了，Format:GenBank FASTA Graphics More Formats选项中当然要求点选FASTA形式了把mRNA序列拖选，拷贝下来再拷贝入在线设计软件exon primer （见第一贴）http://ihg2.helmholtz-muenchen.de/ihg/ExonPrimer.html好了。

全外显子组测序的具体方法及步骤全外显子组测序（Whole Exome Sequencing，简称WES）是一种高通量测序技术，用于测定一个个体的所有外显子区域的DNA序列。

外显子是编码蛋白质的基因组区域，占据了人类基因组的约1-2%。

WES可以用于寻找致病基因突变，特别是在遗传性疾病的分子诊断中有广泛的应用。

下面将详细介绍WES的具体方法及步骤。

1.样品准备：-提取DNA：从待测个体的外周血或组织样品中提取总DNA。

-细胞裂解：使用特定组织裂解缓冲液将细胞或组织样品裂解，释放DNA。

-纯化DNA：通过离心等步骤，去除杂质，纯化DNA。

2.外显子库建立：- 靶向捕获：使用外显子组富集探针（baits）将DNA中的外显子区域进行加权，并去除非外显子区域的DNA片段。

-杂交反应：将靶向探针与DNA样品进行杂交反应，使探针与待测DNA的外显子区域发生特异性结合。

-洗涤：将未结合的探针洗掉，保留结合的外显子区域DNA片段。

-PCR扩增：对靶向捕获得到的DNA片段进行PCR扩增，以增加样品中外显子区域的DNA原料。

3.高通量测序：-数据库构建：将PCR扩增得到的外显子DNA片段建立一个DNA文库，用于测序。

- 测序反应：使用高通量测序平台（如Illumina HiSeq X）进行DNA文库的测序，得到大量的短序列片段（reads）。

- 数据处理：通过对这些reads进行去除低质量序列、比对到参考基因组等处理，获得高质量的测序数据。

4.数据分析：- 变异检测：使用专门的变异检测软件对样品中的变异进行分析，包括单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphisms，简称SNPs）和小片段插入缺失等。

-数据解读：将检测到的变异与公开的数据库进行对比，筛选出可能与疾病相关的变异。

-功能注释：对筛选出的变异进行功能注释，评估其潜在影响，进一步缩小候选基因的范围。

- 候选基因验证：对最终候选基因进行进一步的实验验证，如Sanger测序。

全外显子测序结题报告客户项目编号上海祥音生物科技有限公司目录1.项目概述 (3)2.建库测序流程 (3)2.1.DNA样本检测 (3)2.2.建库捕获 (3)2.3.库检及上机测序 (3)3.数据分析 (4)3.1.分析流程 (4)3.2.数据库信息 (4)3.3数据分析软件 (5)4.分析结果 (5)4.1.原始数据 (5)4.2.质量控制 (7)4.3.质量评估 (9)4.4.重要指标统计 (15)4.5变异检测结果 (21)5.参考文献 (28)1.项目概述2.建库测序流程2.1.DNA样本检测对DNA样品的检测主要包括3种方法：(1)琼脂糖凝胶电泳分析DNA降解程度以及是否有RNA及蛋白等污染。

(2)Nanodrop检测DNA的纯度（OD260/280比值）。

(3)Qubit对DNA浓度进行精确定量。

一般OD值在1.8~2.0之间，含量在1.5ug以上的DNA样品用来建库结果更好。

2.2.建库捕获Agilent SureSelect Human All Exon V6是 Agilent自主研发的全外显子捕获芯片，该产品汲取多个权威数据库（如RefSeq，OMIM_cds）的核心内容，具有更大的捕获区间，更高的捕获效率，保证外显子编码区的高覆盖率及SNP检出率。

将全外显子区域进行捕获并富集后，使用主流的 illumina、Life Technology 等测序平台进行高通量测序。

实验严格按照生产流程进行操作。

2.3.库检及上机测序1)取1μl文库使用Qubit dsDNA HS Assay Kit进行定量，记录文库浓度，文库浓度约在1-10ng/μl；2)取1μl样品使用Agilent2100Bioanalyzer system（Agilent DNA1000Kit）进行文库片段长度测定，文库长度约在220-320bp之间；3)使用高通量测序平台进行测序。

3.数据分析3.1.分析流程获得原始测序序列(Sequenced Reads)后，在有参考序列或参考基因组(GRCh37/hg19)的情况下，进行信息分析流程，大致包括以下两个部分：1)测序数据质量评估：主要对数据量、碱基质量、比对率、覆盖率、捕获率、均一性等指标进行统计，评估建库测序是否达到了标准，符合标准则进行后续分析。

ACMG全外显子测序指南摘要：美国医学遗传学与基因组学学会（ACMG）以前为序列突变的解释提供了指导.1在过去十年中，随着高通量测序的出现，测序技术迅速发展。

通过采用和利用下一代测序，临床实验室正在进行基因分型，单基因，基因组，外显子，基因组，转录组和遗传疾病表观遗传学检测的不断增加的遗传检测目录。

由于复杂性增加，基因检测的这种转变伴随着序列解释的新挑战。

在这方面，ACMG于2013年召集了一个由ACMG，分子病理学协会（AMP）和美国病理学家学会的代表组成的工作组，重新审视和修订了序列突变解释的标准和准则。

该组由临床实验室主任和临床医生组成。

本报告代表ACMG，AMP和美国病理学家利益相关者联盟组成的工作组的专家意见。

这些建议主要适用于临床实验室使用的遗传检测的范围，包括基因分型，单基因，panel，外显子和基因组。

本报告建议使用具体的标准术语- “致病性”，“可能致病性”，“不确定性意义”，“可能良性”和“良性”来描述在导致孟德尔病症的基因中鉴定的突变。

此外，该建议描述了基于使用典型类型的突变证据（例如，群体数据，计算数据，功能数据，分离数据）的标准将突变分类为这五个类别的过程。

由于本报告中描述的临床基因检测的分析和解释的复杂性增加，ACMG强烈建议临床分子遗传学检测应在经过临床实验室改进修订批准的实验室进行，结果由相关职业认证的临床分子遗传学家或分子遗传病理学家或同等学科专家进行解释。

关键词：ACMG实验室指导; 临床遗传检测; 解释；报告; 序列变异术语；突变报告前言临床分子实验室正在不断增加检测的新的序列突变，因为在检测患者标本时不断发现大量与基因疾病相关的基因。

虽然一些表型与单个基因相关，但许多与多个基因相关。

我们对任何给定序列突变的临床意义的理解是循序渐进的，其范围从那些几乎肯定是疾病致病性突变到几乎肯定是良性的突变。

虽然以前的美国医学遗传学和基因组学会（ACMG）的建议提供了序列突变的解释类别和解释算法，但是这些建议没有提供定义的术语或详细的突变分类指南.1。