一、实验目的1. 了解细胞培养的基本原理和方法。
2. 掌握哺乳动物细胞原代培养和传代培养的操作步骤。
3. 学习细胞培养过程中无菌操作的重要性。
二、实验原理细胞培养是指从生物体中取出某种组织或细胞，模拟体内生理条件，在人工培养条件下使其生存、生长、繁殖或传代的过程。
细胞培养技术具有直接观察活细胞、避免体内实验的复杂因素、提供大量生物性状相同的细胞等优点，在生物学研究、医学等领域中得到广泛应用。
细胞培养可分为原代培养和传代培养。
原代培养是指直接从体内获取的组织细胞进行首次培养；传代培养是指原代培养的细胞增殖达到一定密度后，将其分散后转移到另一个或几个容器中扩大培养。
传代培养的累积次数即为细胞的代数。
三、实验用品1. 仪器：显微镜、载玻片、盖玻片、培养皿、移液器、离心机、恒温培养箱、超净工作台等。
2. 器材：胰蛋白酶、胎牛血清、DMEM培养基、双抗、无菌水、75%酒精、无菌滤纸等。
3. 试剂：细胞培养液、胰蛋白酶消化液、细胞计数板、染色液等。
四、实验步骤1. 原代培养（1）取动物组织样本，用胰蛋白酶消化处理，得到细胞悬液。
（2）将细胞悬液加入培养皿，放入37℃恒温培养箱中培养。
（3）观察细胞生长情况，待细胞贴壁生长后，用移液器将细胞分散，转移至另一个培养皿中。
（4）重复步骤（3），直至细胞增殖到一定密度。
2. 传代培养（1）取培养皿中的细胞，用胰蛋白酶消化处理，得到细胞悬液。
（2）将细胞悬液加入培养皿，放入37℃恒温培养箱中培养。
（3）观察细胞生长情况，待细胞贴壁生长后，用移液器将细胞分散，转移至另一个培养皿中。
（4）重复步骤（3），直至细胞增殖到一定密度。
3. 细胞计数（1）取一定量的细胞悬液，加入细胞计数板。
（2）在显微镜下观察细胞，计算细胞数量。
（3）根据细胞数量和体积，计算细胞密度。
4. 细胞染色（1）取一定量的细胞悬液，加入染色液。
（2）在显微镜下观察细胞，观察细胞形态和染色情况。
五、实验结果与分析1. 原代培养（1）细胞在培养皿中贴壁生长，呈梭形。
实验5 细胞的传代培养一、实验目的熟练掌握动物细胞的传代培养法。
二、实验原理哺乳动物细胞的传代培养是几乎所有细胞生物学实验的基础。
当细胞在培养瓶中长满后就需要将其稀释分种成多瓶，细胞才能继续生长,这一过程就叫传代。
传代培养可获得大量细胞供实验所需。
三、仪器、材料与试剂1仪器CO2培养箱，倒置显微镜，超净台2材料培养瓶，试管，移液管，巴斯德吸管，废液缸，75%酒精棉球，酒精灯，细胞。
3试剂完全培养基（RPMLl640或DMEM），0.25%胰蛋白酶，D-Hanks液。
四、实验步骤1.入无菌室之前用肥皂洗手，用75%酒精擦拭消毒双手。
2.倒置显微镜下观察细胞形态，确定细胞是否需要传代及细胞需要稀释的倍数。
将培养用液置37℃下预热。
3.超净台台面应整洁，用75%酒精溶液擦净。
4.打开超净台的紫外灯照射台面20min左右，关闭超净台的紫外灯，打开抽风机清洁空气。
5.点燃酒精灯,取出无菌试管，刻度吸管；安上橡皮头；插在无菌试管内。
6.打开细胞培养瓶，过酒精灯火焰后斜置于酒精灯旁的架子上。
7.倒掉培养细胞的旧培养基。
酌情可用2-3mL Hanks液洗去残留的旧培养基，或用少量胰酶涮洗一下。
8.加入胰酶消化液，盖好瓶盖后在倒置显微镜下观察，当细胞收回突起变圆时立即翻转培养瓶，使细胞脱离胰酶，然后将胰酶倒掉。
注意勿使细胞提早脱落入消化液。
9.加入少量的新鲜培养基，反复吹打消化好的细胞使其脱壁并分散，再根据分传瓶数补加一定量的含血清的新鲜培养基（7-10mL/大瓶，3-5mL/小瓶）制成细胞悬液，分装到新培养瓶中。
盖上瓶盖，适度拧紧后再稍回转，以利于CO2气体的进入，将培养瓶放回CO2培养箱。
10.对悬浮培养细胞，步骤7-9不做。
可将细胞悬液进行离心去除旧培养基上清，加入新鲜培养基，然后分装到各瓶中。
五、注意事项1.传代培养时要注意无菌操作并防止细胞之间的交叉污染。
所有操作要尽量靠近酒精灯火焰。
每次最好只进行一种细胞的操作。
1. 掌握动物细胞融合的基本原理和方法。
2. 了解细胞融合技术在生物科学领域的应用。
3. 通过实验观察细胞融合现象，验证细胞融合技术的可行性。
二、实验原理动物细胞融合是指两个或多个动物细胞在特定条件下，通过细胞膜的相互接触、融合，形成一个新的细胞。
细胞融合技术广泛应用于基因工程、细胞工程、生物制药等领域。
本实验采用电穿孔法诱导动物细胞融合。
三、实验材料1. 实验动物：小鼠成纤维细胞（小鼠胚胎成纤维细胞或小鼠胚胎成纤维细胞系）。
2. 试剂与仪器：胰蛋白酶、DMEM培养液、Hanks平衡盐溶液、FCS（胎牛血清）、Hepes缓冲液、电穿孔仪、显微镜、细胞培养皿、移液枪、超净工作台等。
四、实验方法1. 细胞培养：将小鼠成纤维细胞接种于培养皿中，在37℃、5%CO2的培养箱中培养至对数生长期。
2. 细胞收集：用胰蛋白酶消化细胞，收集细胞悬液。
3. 细胞洗涤：用Hanks平衡盐溶液洗涤细胞两次，去除未贴壁细胞。
4. 电穿孔：将细胞悬液加入电穿孔仪的电极室中，调整电穿孔参数，进行电穿孔处理。
5. 融合细胞培养：将电穿孔后的细胞悬液加入含FCS的DMEM培养液中，在37℃、5%CO2的培养箱中培养。
6. 观察融合细胞：在显微镜下观察融合细胞的形态变化，记录融合细胞的数量和形态。
五、实验结果1. 细胞融合现象：电穿孔处理后，部分细胞膜发生融合，形成融合细胞。
2. 融合细胞形态：融合细胞呈多核、多倍体状态，细胞质丰富，核膜模糊。
1. 电穿孔法诱导细胞融合的原理：电穿孔法是通过高电压脉冲在细胞膜上形成瞬时孔道，使细胞膜发生融合。
实验结果表明，电穿孔法能够有效诱导动物细胞融合。
2. 细胞融合技术的应用：细胞融合技术在生物科学领域具有广泛的应用，如制备杂交瘤细胞、生产单克隆抗体、基因工程等。
3. 影响细胞融合的因素：电穿孔参数、细胞浓度、培养条件等都会影响细胞融合效果。
本实验中，通过调整电穿孔参数和细胞浓度，获得了较好的融合效果。
