纯度鉴定
- 格式:doc
- 大小:695.50 KB
- 文档页数:7
DNA纯度检测中的紫外吸收原理及应用注意事项
紫外吸收检测的原理是基于物质对紫外光的吸收特性来进行分析和检测的方法。
在紫外光谱区(一般为200-400纳米),许多有机分子和某些无机离子具有吸收紫外光的特性,其吸收强度与分子结构、浓度和光程长度等因素相关。
对于DNA而言,其吸收紫外光的特性主要来自于其共轭双键和芳香环结构。
当紫外光照射到DNA样品时,这些结构会吸收特定波长的紫外光,导致光能的减少。
通过测量紫外光通过样品前后的强度变化,可以确定样品对紫外光的吸收程度,从而得到吸光度(OD值)。
紫外吸收检测通常使用分光光度计进行测量。
分光光度计可以测定不同波长下的吸光度值,从而得到样品的吸收光谱。
在DNA纯度鉴定中,常用的波长是260nm和280nm。
260nm波长下的吸光度值与DNA的浓度成正比,因此可以用于定量测定DNA的浓度。
而280nm波长下的吸光度值则可以用于评估DNA的纯度,因为纯的DNA在260nm和280nm波长下的吸光度比值(A260/A280)应为1.8左右。
除了用于DNA纯度鉴定外,紫外吸收检测还可以用于其他生物分子的定量分析,如蛋白质、RNA等。
其原理与DNA检测类似,都是基于物质对紫外光的吸收特性进行分析和检测。
需要注意的是,紫外吸收检测虽然是一种常用的分析方法,但其结果可能受到多种因素的影响,如样品组成、浓度、紫外光谱特性、实验条件以及仪器误差等。
因此,在进行紫外吸收检测时,需要注意控制各种潜在的误差来源,以提高测量结果的准确性。
蜂蜜纯度的鉴定方法蜂蜜是一种常见的天然食品,具有多种营养价值和药用价值。
然而,市场上的蜂蜜质量良莠不齐,有些甚至掺杂了其他物质。
为了保证蜂蜜的纯度和质量,我们需要了解蜂蜜纯度的鉴定方法。
可以通过观察蜂蜜的外观来初步判断其纯度。
纯正的蜂蜜呈黄色或琥珀色,质地黏稠,光泽度较高。
而掺假的蜂蜜往往颜色较浅,质地较稀,光泽度不够。
此外,纯蜂蜜在阳光下会呈现出微弱的蓝色光晕,而掺假的蜂蜜则没有这种现象。
可以通过闻气味来判断蜂蜜的纯度。
纯正蜂蜜具有独特的芳香味道,通常有淡淡的花香。
而掺杂了其他物质的蜂蜜可能有异味或没有明显的芳香味。
可以通过尝味道来判断蜂蜜的纯度。
纯正的蜂蜜味道甜美,口感细腻,不会有任何的酸、苦或异味。
而掺杂了糖水、糖浆等物质的蜂蜜可能味道不纯,甚至有杂味。
除了主观感官判断外,还可以借助一些科学的方法来鉴定蜂蜜的纯度。
例如,可以通过测定蜂蜜的含水量来判断其纯度。
纯正的蜂蜜含水量一般在17%以下,而掺假的蜂蜜含水量可能超过20%。
还可以通过测定蜂蜜的溶解度来鉴定其纯度。
纯正的蜂蜜在常温下溶解于水,而掺杂了其他物质的蜂蜜溶解度较差,或者需要较长时间才能完全溶解。
另一种常用的鉴定方法是测定蜂蜜的电导率。
纯正的蜂蜜中含有丰富的矿物质和离子,因此其电导率较高。
而掺杂了糖水等物质的蜂蜜电导率较低。
除了以上方法,还可以通过测定蜂蜜的酸度来判断其纯度。
纯正的蜂蜜酸度一般在3.2-4.5之间,而掺假的蜂蜜酸度可能偏高或偏低。
判断蜂蜜纯度的方法有很多种,可以通过观察外观、闻气味、尝味道等主观感官判断,也可以借助科学的方法测定含水量、溶解度、电导率和酸度等指标。
在购买蜂蜜时,消费者可以结合多种方法进行鉴定,以确保购买到纯正的蜂蜜,享受其丰富的营养和药用价值。
银的纯度一般有三种:一种是足银;另一种是纹银;还有一种是镀银。
这三种银的纯度不同,材质和用途也略有差异。
1、925银是指含银量不低于92.5%的银质品,纯度在此之上即认定为纯银。
因为纯度过高的银柔软并且容易氧化,925银加入了7.5%的其他金属,使其具有了理想的硬度,能更好的塑形,镶嵌各种宝石,制作出造型多样的银制品。
2、999银首饰里面的足银,可以叫纯银。
含量就是金属符号后面那些数字,999银就是含银量为99.9%。
3、千足银是指银含量99.9%的银,用于制作千足银首饰银含量不得低于99.9%,也是目前国家标准《首饰贵金属纯度的规定及命名方法》里规定的银制品最高纯度标准。
4、足银含银量千分数不小于990的称足银。
一般加工成手镯,吊坠,长命锁之类的银饰,足银饰通常有几种标志,一种是S99,一种为S990,S是英文单词silver(银)的首字母,代表银。
含量有999,990和925之分。
5、纯银即含量接近100%的金属银。
但由于银是一种活跃的金属,容易与空气中的硫起化学反应,生成硫化银而使其变黑,因此生活中的“纯银”一般指含量99.99%的白银或者含量92.5%的925纯银。
白银纯度鉴定方法:1、印记银首饰一般应打上银的英文缩写(“S”或“Sterling”)的印记。
标准银的印记是S925,足银的印记是S990,但也有许多国家在银首饰上不打印记。
2、色泽银首饰多呈微带黄的银白色,呈柔和的金属光泽。
因易氧化,时间久了,色泽会变成暗的黄白色。
3、掂重银的密度为10.53克/立方厘米。
比铂金、黄金小,用手掂无坠手感。
钢针可以划出痕迹,也可以折弯。
用这种方法可以和铂金、K白金或仿银的德银首饰相区别。
4、酸试银遇任何酸都会变色,甚至溶解。
如果在银首饰的内侧滴上一滴浓盐酸,会立即生成白色苔藓状的氯化银沉淀。
而其它贵金属则无此现象。
5、声韵标准银首饰落地后声音沉闷,不弹跳,不滚动。
钜丰金业友情提示:投资有风险,入市需谨慎!。
抗体纯度鉴定的常用方法抗体(antibody)是一种对抗外来物质(如细菌、病毒等)的特殊蛋白质。
抗体的高纯度是保证其抗原结合特异性和生物活性的重要保证。
因此,抗体纯度鉴定是评价抗体质量的必要步骤。
目前,常用的抗体纯度鉴定方法有几种,下面将一一进行介绍。
一、蛋白质凝胶电泳(SDS-PAGE)SDS-PAGE是抗体纯度鉴定中最常见的方法之一。
通过将抗体样品进行电泳分离,分析样品中各种分子量的蛋白质,从而确定抗体的纯度。
与电泳产生的带宽比较,可以判断是否存在杂质以及杂质的含量。
二、Western blotting(免疫印迹)Western blotting是一种常用的抗体纯度鉴定方法。
它通过将蛋白质分子进行电泳分离,并转移到PVDF或NC膜上,然后用某种特定的抗体进行探测,根据抗体的结合情况,来判断目标抗体的纯度。
Western blotting还可以用于鉴别抗体所结合的亚型。
三、ELISAELISA是一种受欢迎的纯度检验方法。
它利用固相酶标法,将抗体捕捉在特制的酶标板上,然后通过添加特定的抗体来检测目标蛋白质的存在。
ELISA还可以测定抗体的浓度和比活性。
四、高效液相色谱(HPLC)HPLC是一种常用的检测蛋白质纯度的方法,用于检测抗体的还原子单元和聚集程度。
它可以分离并分析化合物,从而确定纯度和组分。
HPLC可以分为不同类型的分离技术,包括离子交换、分子筛和反相色谱。
根据抗体的理化性质,选择合适的HPLC分离技术,对其进行分离检测。
五、光谱法光谱法是评估抗体纯度和稳定性的一种方法。
它通常用于表征蛋白质的次级结构,如α-螺旋和β-折叠的含量。
光谱法可以包括原子吸收光谱、荧光光谱和紫外-可见光谱。
其中,紫外-可见光谱常用于测定蛋白质的含量、浓度和纯度。
总之,抗体纯度鉴定是确保抗体质量和稳定性的基本步骤。
选择适当的抗体纯度鉴定方法,不仅可以证明抗体的高质量,而且可以为其在生物医学研究和临床治疗中的应用提供重要保障。
蛋白质纯度鉴定的方法
蛋白质纯度鉴定是确定蛋白质样品中目标蛋白质所占比例的过程。
以下是几种常见的蛋白质纯度鉴定方法:
1. SDS-PAGE:SDS-PAGE是一种分离蛋白质的电泳方法,可以根据蛋白质分子量的差异将不同蛋白质分离开来。
通过对样品中不同带的强度进行分析,可以初步了解到目标蛋白质的纯度。
2. Western Blotting:Western Blotting是一种检测蛋白质的方法,通过使用特异性抗体与目标蛋白结合,再用发光剂或染色剂检测,可以检测并定量目标蛋白质在样品中的含量。
玉米种子纯度盐溶蛋白电泳鉴定方法NY/T 449-20011范围本标准规定了玉米单交种及亲本的真实性和品种纯度的室内检测方法。
本标准适用于玉米单交种及亲本的真实性和品种纯度鉴定。
2引用标准下列标准所包含的条文,通过在本标准中引用而构成为本标准的条文。
本标准出版时,所示版本均为有效。
所有标准都会被修订,使用本标准的各方应探讨使用下列标准最新版本的可能性。
GB/T 3543.2-1995农作物种子检验规程扦样GB/T 3543.5—1995农作物种子检验规程真实性和品种纯度鉴定GB 4404.1-1996粮食作物种子禾谷类3定义本标准采用下列定义3.1种子真实性供检品种与文件记录(如标签等)是否相符。
3.2品种纯度品种在特征特性方面典型一致的程度,用本品种的种子数占供检本作物样品种子数的百分率表示。
[GB/T 3543.5]3.3育种家种子育种家育成的遗传性状稳定的品种或亲本种子的最初一批种子,用于进一步繁殖原种的种子。
4原理从玉米种子中提取的盐溶蛋白在聚丙烯酸胺凝胶的浓缩效应、分子筛效应和电泳分离的电荷效应作用下进行分离,通过染色显示蛋白质谱带类型。
不同玉米品种由于遗传组成的不同,种子内所含的蛋白质种类有差异,这种差异可利用电泳图谱加以鉴别,从而对种子真实性和品种纯度进行鉴定。
5仪器设备及试剂5.1仪器设备电泳仪(500 V士5 V连续可调、0~400 mA连续可调、额定输出功率200 W)、垂直板夹心式电泳槽、单籽粒粉碎器、天平(感量 0. 01g、0. 001g、0. 0001g 各一台)、酸度计、磁力搅拌器、高速离心机(5 000 r/min以上)、电冰箱、电炉、离心管( 1. 5 mL)、离心管架、移液管( 10 mL、5mL、2 mL各两支)、微量进样器( 5~IOO μL)、恒温箱、观片灯等。
5.2试剂丙烯酸胶、N,N’一亚甲基双丙烯酸胺、乳酸、乳酸钠、甘氨酸、抗坏血酸、硫酸亚铁、氯化钠、蔗糖、甲基绿、基绿、三氯乙酸、过氧化氢、考马斯亮蓝R25O、无水乙醇、正丁醇等(所用试剂均为分析纯,所用水均为去离子水)。
食品酶纯度的鉴定方法食品酶纯度的鉴定方法食品酶是指在食品加工过程中起到催化作用的酶类物质。
酶的纯度是指酶中所含的目标蛋白质在总蛋白质中所占的比例。
酶的纯度对于食品加工的效果和品质有着重要的影响。
因此,鉴定食品酶的纯度是食品加工过程中必不可少的一环。
鉴定食品酶纯度的方法有很多种,下面介绍几种常用的方法。
1. SDS-PAGE法SDS-PAGE法是一种常用的蛋白质分离方法,可以将蛋白质按照分子量大小进行分离。
该方法需要将酶样品加入SDS-PAGE胶液中,经过电泳分离后,用银染法或共染法染色,然后通过比较目标蛋白质与总蛋白质的带强度,计算出酶的纯度。
2. 酶活测定法酶活测定法是通过测定酶的催化活性来计算酶的纯度。
该方法需要将酶样品加入含有底物的反应体系中,测定反应速率,然后通过比较目标酶与总酶的催化活性,计算出酶的纯度。
3. 免疫印迹法免疫印迹法是一种常用的蛋白质检测方法,可以检测出特定的蛋白质。
该方法需要将酶样品经过SDS-PAGE分离后,将蛋白质转移到膜上,然后用特异性抗体与目标蛋白质结合,最后用酶标记的二抗或化学发光法检测出目标蛋白质的存在情况,从而计算出酶的纯度。
4. 质谱法质谱法是一种高灵敏度的蛋白质分析方法,可以直接测定蛋白质的分子量和氨基酸序列。
该方法需要将酶样品经过SDS-PAGE分离后,将目标蛋白质从凝胶中提取出来,然后进行质谱分析,从而计算出酶的纯度。
总之,鉴定食品酶纯度的方法有很多种,每种方法都有其优缺点。
在实际应用中,需要根据具体情况选择合适的方法进行鉴定。
同时,为了保证鉴定结果的准确性,需要严格控制实验条件,避免误差的产生。
蛋白质纯度鉴定蛋白质是生命体中必不可少的大分子有机化合物,其结构和功能各不相同,因此在研究生物学、制药学等领域中,对蛋白质的纯度鉴定十分关键。
蛋白质的纯度指的是蛋白质分子在样品中占有的总比例,它不仅关系到后续的实验和理论研究,也影响到药品的安全性和有效性。
下面,我们将针对蛋白质纯度鉴定的方法和技术展开讨论。
一、理化方法1. 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)SDS-PAGE是一种广泛应用于蛋白质纯度鉴定的方法,该方法将样品中的蛋白质分子加入一定量的阴离子表面活性剂(SDS)并使之电泳,通过分子量大小的差别将蛋白质分离出来,并用Coomassie蓝染色或银染色进行可视化。
该方法有较高的分辨率和可重复性,但需要较高的设备和试剂成本,并且只能检测到存在亚精度的杂质。
2. 高效液相色谱(HPLC)HPLC是一种高效、高精度、高灵敏度的液相色谱检测技术,能够对蛋白质样品中的杂质进行分离和检测,从而判定蛋白质的纯度。
根据不同的分离模式,HPLC可以分为离子交换、逆相、凝胶过滤、亲和层析等几种,应用范围广泛。
该方法需要专业的仪器设备和专业操作技术,但是其结果具有准确性高和可重复性强的特点。
二、免疫学方法1. ELISA法ELISA(酶联免疫吸附试验)常被应用于纯度较高的蛋白质样品的鉴定,该方法通过特异性抗体的识别并与抗原结合,从而判断蛋白质在样品中的含量。
当然,根据样品中抗原含量的不同,可以将该方法分为直接ELISA、间接ELISA、Sandwich ELISA等类型。
该法操作简便,对较小分子量蛋白质也有很好的检测效果,但是需要一定的抗体或者蛋白质结构信息。
2. Western Blotting法Western Blotting是一种通过蛋白质电泳分离,将成像膜上的蛋白质与蛋白质特异性抗体结合并进行检测的方法。
该方法常被用于验证蛋白质纯度和鉴定蛋白质的蛋白质伴侣分子等应用。
在实验操作过程中,需要较高的专业熟练程度和精准操作技巧,且耗时较长,但是其结果准确性高,能够监测低含量的蛋白质。
化学实验中的物质纯度测定化学实验中,物质纯度的测定是一个重要的步骤。
它可以帮助我们了解实验样品的纯净程度,从而确保实验结果的准确性和重复性。
本文将介绍几种常用的物质纯度测定方法及其原理。
一、物质的物理性质测定物质的物理性质可以通过测定其密度、熔点、沸点等来判断其纯度。
其中,密度是比较常用的测定指标之一。
通过比较实验样品与已知纯品的密度,可以得出样品的纯度。
另外,熔点和沸点也可以用来鉴定物质的纯度。
纯品的熔点或沸点具有一定的范围,而杂质的存在会导致熔点或沸点的升高或降低。
二、滴定法测定物质的纯度滴定法是一种常用的测定物质纯度的方法,它可以通过溶液之间的化学反应进行测定。
滴定法需要一种已知浓度的试剂与待测物质反应,通过滴定液的用量来判断待测物质的纯度。
例如,测定硫酸铜溶液的纯度时,可以使用已知浓度的硫酸钠溶液与之滴定,通过观察溶液的颜色变化或终点指示剂的变色来确定滴定终点,进而计算出硫酸铜溶液的纯度。
三、色谱法测定物质的纯度色谱法是一种通过物质在固定相与流动相间的相互作用来分离和测定物质纯度的方法。
常见的色谱法包括气相色谱法和液相色谱法。
在气相色谱法中,样品通过一定温度下的蒸发,进入色谱柱进行分离;在液相色谱法中,溶解样品的流动相通过固定相进行分离。
色谱法可以根据不同物质在色谱柱中的保留时间和色谱峰的形状,判断样品中杂质的存在及纯度等。
四、质谱法测定物质的纯度质谱法是一种通过检测物质的质荷比、碎片谱图等信息来分析和测定物质纯度的方法。
通过将样品分离并离子化,然后使用质谱仪器进行检测和分析,可以获得物质的质谱图。
质谱图可以提供物质的分子量、分子结构以及可能的杂质信息等。
通过对质谱图的分析,可以判断物质的纯度。
综上所述,化学实验中的物质纯度测定是确保实验结果准确性的重要步骤。
通过物理性质测定、滴定法、色谱法和质谱法等多种方法,我们可以准确地判断实验样品的纯度。
这些方法的应用使得化学研究和应用领域中的实验结果更加可靠和科学可信。
蛋⽩SDS-PAGE纯度鉴定与分⼦量测定蛋⽩SDS-PAGE纯度鉴定与分⼦量测定⼀、原理:(1)SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳⼗⼆烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulphate - polyacrylamide gel electrophoresis, SDS- PAGE)简称SDS - PAGE。
⽤于蛋⽩纯度及蛋⽩质亚基相对分⼦量(relative molecular mass, Mr)测定。
SDS是⼀种阴离⼦去污剂,带有⼤量负电荷,与蛋⽩质结合后使蛋⽩质所带负电荷⼤⼤超过了天然蛋⽩质原有的负电荷,因⽽消除或掩盖了不同种类蛋⽩质间原有电荷的差异。
SDS 破坏蛋⽩质氢键、疏⽔键,引起蛋⽩质构象改变,使蛋⽩质-SDS 复合物形状近似椭圆形,短轴相同(1.8nm),长轴与蛋⽩质分⼦量成正⽐。
因此,蛋⽩质—SDS复合物(SDS-denatured protein)在凝胶中的迁移率不受蛋⽩质原有电荷和形状的影响,只与椭圆棒长度(蛋⽩质分⼦量)有关。
蛋⽩质的迁移率与分⼦量的对数呈线性关系,符合下式:logMW=K-bXMW:分⼦量;X:迁移率;k、b均为常数将已知分⼦量的标准蛋⽩质的迁移率对分⼦量对数作图,可获得⼀条标准曲线,未知蛋⽩质在相同条件下进⾏电泳,根据其相对迁移率即可在标准曲线上求得分⼦量。
(2)分离效应:PAGE根据其有⽆浓缩效应,分为:连续电泳(continuous electrophoresis):采⽤相同孔径的凝胶和相同的缓冲系统不连续电泳(discontinuous electrophoresis):采⽤不同孔径的凝胶和不同缓冲体系连续PAGE:电荷效应;分⼦筛效应不连续PAGE:电荷效应;分⼦筛效应;浓缩效应不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳:凝胶由上、下两层凝胶组成,两层凝胶的孔径不同,上层为⼤孔径的浓缩胶,下层为⼩孔径的分离胶。
①浓缩效应:使样品在浓缩胶中被浓缩成⼀条窄带,然后再进⼊分离胶进⾏分离。
茶叶多糖纯度鉴定及结构分析的研究进展 1茶叶多糖的纯度鉴定和相对分子量的测定 1.1茶叶多糖的纯度鉴定 多糖类复合物等生物大分子的理化性质、生物活性与其相对分子质量有很大关系,因此,在多糖类复合物的研究及其产品质量控制中,相对分子质量是一个重要指标。要测定多糖类复合物的相对分子质量,首先要求鉴定其纯度,但是与小分子化合物的判断标准不同,茶叶多糖是高分子化合物,它的纯品实质上是一定相对分子质量范围的相对均一组分,只代表相似链长的平均分布。目前,国内外多糖类复合物纯度的鉴定方法主要有:比旋度法、超离心法、电泳法和凝胶色谱法。一般来说,纯度必须经过两种方法以上鉴定,结果才能肯定。 这几种方法的主要应用如表1所示。
在大多数文献中,茶叶多糖的纯度鉴定一般都是采用高效凝胶液相色谱和示差检测器检测的方法。也有利用茶叶多糖蛋白在280 nm处有吸收,通过紫外检测器来检测茶叶多糖的纯度。 红毛菜多糖的分离 纯化及纯度鉴定 2.4 纯度鉴定 2.4.1 紫外光谱鉴定 将洗脱的多糖用Du640蛋白核酸分析仪(美国贝克曼库尔特公司)在190-450nm范围的测定其紫外光谱 2.4.2 多糖的纸色谱 在滤纸上距底端1cm处以PY1 PY21的水溶液点样,展开剂为正丁醇、浓氨水、水的混合物40 :50:5 混合后放置2小时以上 。室温展开6 小时 取出后吹干置于碘蒸汽中吸附约14 小时后观察其结果 2.4.3 红外光谱测定 将过柱后的糖旋转蒸干后取1-2mg用KBr压片用Nicolet AVATAR FT-IR360型红外光谱仪测定红外光谱。 3 结果与讨论 3.3 纯度的鉴定 3.3.1 紫外光谱 洗脱后组分的紫外光谱如图3 4所示PY1和PY2只有在190nm有最大吸收在280nm吸收很小说明蛋白质的含量很少且没有别的杂峰说明杂质含量较少。 从 PY1 PY2 的红外光谱图 如图 5 6 可以看 出 在 3400 2800cm-1、1400 1200cm-1处有多糖的特征性吸收峰存在 此外 还有一些特殊基团吸收峰1076cm- 1和 930cm-1处的峰提示 3,6 内醚桥的存在表明此多糖中含有 3, 6 内醚 半乳糖 1234cm- 1处的吸收峰表明该多糖含有硫酸基 且并无杂峰存在 说明都是单一组分 荔枝多糖分离纯化及纯度鉴定 荔枝多糖纯度鉴定:经 sephadex G-25层析柱分级纯化后用以下3种方法分别对A2组分的多糖进行纯度鉴定 聚丙烯酰胺凝胶柱P-100鉴定:柱参数:柱体积:直径0.4cm*100cm;柱床体积:直径0.4*60cm;平衡流速:0.1ml\min,洗脱液为0.2mol\L 氯化钠溶液与醋酸的混合液.从其洗脱图谱图(3)可知,为一个单峰,说明A2具有较高纯度. 聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定:缓冲液pH=8.9的为硼砂-KOH缓冲液显色剂80%为硫酸和20%乙醇混合液对A2进行电 泳,电泳时间3h,结果如图4所示为单一色斑,说明所得多糖A2为纯品 醋酸纤维薄膜电泳鉴定:缓冲液为pH=9.2的硼砂-KOH缓冲液显色剂为碘-氯仿,电泳时间为1h电泳后的色带为一斑点,说明所得多糖A2为单一成分. 乳酸菌胞外多糖的研究 2.3 EPs的纯度鉴定 多糖的纯度只代表相似链长的多糖分子的平均分布。通常所谓的多糖纯品实际上是一定分子量范围的多糖的均一组分。目前常用于多糖纯度鉴定的方法有凝胶层析法、高压电泳法、超速离心法、旋光测定法和毛细管电泳法等。多糖纯度鉴定中应用最多的是凝胶层析法。凝胶层析得到一对称洗脱峰,则证明该多糖是均一组分,它的优点是准确度高。高压电泳法电泳结果显色后,如皇单一色斑,则表示该活性多糖为均一组分。高压电泳法鉴定多糖纯度早期用的较多,现在大多不再使用,原因是灵敏度不高。超速离心法是将多糖溶液进行密度梯度离心,待转速达到60 000r\min以上后,问隔照相,如得到的结果是单一峰,则证明该活性多糖为均一组分。旋光鉴定法利用不同分子量的多糖在不同浓度低级醇中溶解度差别进行的,如果在不同浓度低级醇中得到的多糖的比旋光度相同,则证明多糖为均~组分. 天然植物多糖及复合多糖的研究进展 2.2植物多糖的纯度鉴定 多糖的纯度与普通化合物的纯度标准不同,因为即便是多糖纯度品,其微观也并非均一的,仅代表相似链长的多糖分子的平均分布。通常所渭的多糖纯品也只是一定相对分子量范围的均一组分.目前纯度鉴定的常用方法有:比旋度法、超离心法、色谱法、高压电泳法、凝胶过滤法等.杨娟等将水提醇沉后脱完蛋白的粗多糖,经DEAE一纤维素柱及纤维素凝胶柱层析分离纯化后得到三个级分,经聚丙烯酰胺凝胶电泳和Sepharose CL一6B柱层析鉴定为分子量分布均一的鬣白多糖.杨晓彤等瞄将香菇藩丝体热求没提、乙醇沉淀,在经DEAE一纾维素柱及Sepharose G一100柱层析纯化后,经醋酸纤维薄膜电泳和HPLC检测得均一成分多糖. 制何首乌多糖的纯度鉴定和理化性质研究 2.1 制首乌多糖PRPM—l,PRPM-2和PRPM-3的纯度鉴定笔者从制何首乌中用水提醇沉法提取得到制何首乌粗多糖,经精制后得到制何首乌多糖各亚组分PRPM一1;PRPM-2和PRPM-3的干燥粉末,为了确定纯度,进行以下研究。目前常用于多糖纯度鉴定的方法有:凝胶过滤法、高压电泳法、超离心法、旋光测定法、毛细管电泳法和高效液相色谱(HPLC)法等。要确定某一多糖的均一性,通常必须采用2种以上的鉴定方法。本实验采用凝胶过滤法和紫外光谱检测法鉴定其纯度。 2.1.1 紫外光谱检测法鉴定纯度 将多糖各亚组分PRPM一1,PRPM.2,PRPM.3配成1 ms/ml的水溶液在紫外分光光度计200~400 nm波长处扫描。结果见下图。
由图1~图3紫外光谱图可见,PRPMB一1,PRPMB-2,PRPMB-3在280nm和260nm处基本无吸收,表明它不含蛋白、多肽及核酸。 2.1.2凝胶柱SephadexG.100鉴定将溶胀好的Sephadex G.100装柱,用蒸馏水平衡一夜。称取经过纤维素和凝胶柱层析纯化后的多糖亚组分M-l,PRPM-2,PRPM-3适量分别配制成多糖水溶液,上样,上样量为柱体积的2%一3%。以蒸馏水溶液洗脱,洗脱液流速为0.4 ml/min,每4 ml收集1管,采用苯酚-硫酸法在490 nm处测定吸光度,以试管号为横坐标,吸光度为纵坐标,分别绘制洗脱曲线,结果见图。
PRPM—l,PRPM-2,PRPM一3经葡聚糖凝胶G一100柱层析,洗脱曲线均呈单一对称峰形,结合其紫外扫描图,可证明各多糖亚组分为均一多糖。 香 菇 多 糖 的 分 离 纯 化 方 法 研 究 进 展 3 香菇多糖的纯度鉴定 对 纯化后的香菇多糖进行纯度鉴定可以采用: 凝胶柱层析法: 根据多糖分子量范围, 选择所用凝胶型, 通过 检测洗脱液是否存在单一对称峰来判断; 聚丙烯酰胺电泳法: 多糖纯度鉴定较为直观, 纯多糖为单一带, 则为 纯多糖; 高效液相色谱法; 超离心法; 比旋度法 ; 醋酸纤维薄膜 电泳[ 8]。 缪 建等人用比旋度法和 Se pha r ose 4B 柱层析进行纯 度鉴定, 将分离得到的 2 种多糖分别用水溶解, 加乙醇 至醇体积分数为 40% 析 出沉淀, 继续加乙醇至醇体积分 数为 7 0% 时析出沉淀, 将 2 次沉淀干燥后测定其相同条 件下水溶液的比旋度, 如比旋度相同, 证明该多糖为均 一组分。结果显示: 多糖组分 Le n1- A、 Le n2- A 溶于水后 分别在乙醇体积分数为 30% 、 6 0% 的溶液中沉淀, 将两 次沉淀干燥后测定其相同条件下水溶液的比旋度分别 为+ 5. 6 度、 + 1 1. 2 度 , 证明该多糖为均一组分。Le n1- A 、Le n2- A 的 Se phar ose 4 B 柱层 析洗脱峰为单峰, 且峰形较为 狭窄对称, 证明 Len 1 -A、 Le n2 -A 的相对分子质量分布较 为均一[ 11 ]。 杨娟 等人 用 聚丙 烯酰 胺凝 胶电 泳 和 Se phar oseCL -6B 凝胶柱层析进行纯度鉴定, 结果表明阿利新蓝和考马斯亮蓝 R 2 50 染色方法均只出现一条电泳带, 而且多糖区带与蛋白质区 带出现位置一致, 而单纯的牛血清蛋白不能被阿利新蓝染色, 表明香菇多糖组分 Le-Ⅲ既含有多糖又含有蛋白质, 二者以结合态存在。Se phar oseCL- 6B 凝胶柱层析, 香菇多糖组分Le-Ⅲ出现单一对称峰, 洗脱液 在 49 0 nm 处 ( 先经硫酸 苯酚 显色) 的吸光值变化趋势与 28 0 nm 处的一致, 表明Le-Ⅲ 含有结合蛋白 。以上两种纯度鉴定结果表明, 香菇多糖组分Le-Ⅲ为多糖- 蛋白复合的分子 量分布均一组分[ 12] 燕麦 β- 葡聚糖的分离纯化及分子量范围 1 . 2 燕麦β- 葡聚糖的纯度鉴定 同分离植物多糖一样, 燕麦β - 葡聚糖的分离纯化应该尽可能的保持其结构和生物活性, 并且注意其得率和纯度。由于β - 葡聚糖的纯度直接影响β- 葡聚糖理化性质的研究准确性, 因此确保β - 葡聚糖的纯度就成为分离提纯的关键7- 8 。由于燕麦β- 葡聚糖结构的复杂性和分离提取方法的差异, 要获得单一分子量的多糖组分在目前是不可能的。因此即使是β- 葡聚糖的纯品, 也存 在微观的不均一问题。纯度概念是随着分离分析手段的改进而不断发展的, 当一种方法已不能将某一样品进一步分离时, 即称样品为该方法下的纯品。通常所说的多糖纯品, 实质上是一定分子量范围年内的均一组分6。 目前国内外常用的多糖纯度鉴定方法很多, 主要有比旋度法、 超速离心法、 高压电泳法和凝胶 层析法。在多糖的纯度鉴定中, 要求必须用两种以上方法进行纯度鉴定, 否则所得的结果是不可靠的7 。燕麦β- 葡聚糖的纯 度鉴定中, 应用最多的 是凝胶层析法, 它是根据多糖分子的大小和形状的不同, 在层析柱中的移动速度也不同, 从分部收集中出现的峰的多少和形状判断该多糖的纯度的方法。在凝胶层析分析中, 使用葡萄糖凝胶和琼脂糖凝胶是两种应用较为广泛的方法6 对 于 生物 大分 子进 行 纯 度 鉴定 有十分 重 要的意 义。 如 对蛋 白质顺 序 的测 定,蛋 白质的纯度必需 达 到百分 之 九十 以 上。传 统 的纯度 鉴 定方法 较 为复杂,且 精确度 不高。光谱 分析 法虽 然是 一 种 较 为 精 确 的 方 法,但 该 方 法 的 应 用 价值较差,和 9 0 年 代 初开 发 出来 的 高效 毛 细管 电泳一样,大 多作 为一 种较 为 精确 分析 的手段。 运 用 991 型 和 99 6 型 H P L C 一 紫 外 光 谱 法对 物 质 进 行 纯 度分 析, 简 单、快 速 而 较 为 精 确,有 较 大 的实 用 价值。具高 分 辨 率 的高 效 毛 细 管电泳 和 电喷雾 质 谱 证 明,这 种 方 法 十分 可 靠。另外,这 种方 法 不 但 可 以 进 行 定性 分 析,还 可 以进行 定量分 析。 这 种方 法 在 利 用 99 1 型和 99 6 型 高效 液相色 谱 分 离 纯 化 生 物 大 分 子 十 分 有 用,它 可 使 我们 在 分 离 纯 化 时 一 步 就 能 找 到 目 的分 子,工作量 大 为 减 轻,同时 也 减 少 纯 化 步 骤 过 多而 造成的 损 失。在高效 液相 色谱 的分 离 效果较 好时,有时 甚 至 可 以 不测 活,直接 读光 谱 库,通过 目的物的 光 谱 相 比 较即 可 找到 目 的分 子。如 我们 曾经用 这 种方 法 一 步就 找 到 了我 们所 合成 的 目 的肤HWT X 一I。我们现在 正 利 用这种 方法来 快速 和微 量地 查找 某些病 人 血液 中的 内毒素。 对一 些 在 19 0 一 3 80nm 之 间 没有 紫外 吸收或 紫外 吸 收 较 少 的生 物 大 分 子,我 们可 以 把 它们 与带 有 苯 环 结构 的 物 质 反 应,生成 有 较 强 紫外 吸 收 的 物 质,这 样 就 同样 可 以 对 它 们进 行紫外 光谱分 析 了。