蛋白组分测定

蛋白组分绝对含量计算公式在食品科学和营养学领域，蛋白质是一种重要的营养物质，它是人体生长和维持生命所必需的。

蛋白质的含量和质量是衡量食品营养价值的重要指标之一。

因此，准确计算蛋白质的含量对于评价食品的营养价值至关重要。

本文将介绍蛋白组分绝对含量的计算公式，并探讨其在食品科学中的应用。

蛋白质是由氨基酸组成的大分子有机化合物，它是构成细胞和组织的重要成分，对维持人体正常的新陈代谢和生理功能起着重要作用。

蛋白质的含量可以通过多种方法进行测定，其中蛋白组分绝对含量的计算公式是一种常用的方法之一。

蛋白组分绝对含量的计算公式如下：蛋白组分绝对含量（g/100g）=氨基酸含量（g/100g）×氨基酸的蛋白质转化因子。

其中，氨基酸含量是指食品中各种氨基酸的含量，通常通过氨基酸分析仪进行测定；氨基酸的蛋白质转化因子是指不同氨基酸的蛋白质转化率，它反映了不同氨基酸对蛋白质含量的贡献程度。

蛋白组分绝对含量的计算公式可以帮助我们准确地计算食品中蛋白质的含量，从而评价其营养价值。

在实际应用中，我们可以通过以下步骤来计算蛋白组分绝对含量：1. 测定食品中各种氨基酸的含量。

这一步通常通过氨基酸分析仪进行测定，得到各种氨基酸的含量数据。

2. 计算氨基酸的蛋白质转化因子。

不同氨基酸对蛋白质含量的贡献程度不同，因此需要根据氨基酸的生理功能和蛋白质转化率来计算其转化因子。

3. 根据上述公式计算蛋白组分绝对含量。

将测定得到的各种氨基酸的含量数据代入公式中，再乘以相应的氨基酸的蛋白质转化因子，即可得到蛋白组分绝对含量。

蛋白组分绝对含量的计算公式在食品科学中具有重要的应用价值。

它可以帮助我们准确地评价食品中蛋白质的含量，从而指导人们合理膳食，保障人体对蛋白质的需求。

此外，蛋白组分绝对含量的计算公式还可以用于食品加工和生产中的质量控制，帮助生产者控制食品中蛋白质的含量，提高产品的营养价值。

除了在食品科学中的应用，蛋白组分绝对含量的计算公式还可以在营养学研究中发挥重要作用。

蛋白质含量的测定方法及原理蛋白质是生物体内一种重要的有机化合物，具有构建细胞结构、调节生理功能等重要作用。

因此，准确测定蛋白质的含量对于生物科学研究和临床诊断具有重要意义。

本文将介绍几种常用的蛋白质含量测定方法及其原理。

一、比色法比色法是一种常用的蛋白质含量测定方法，其原理是利用蛋白质与某些特定试剂形成显色物，根据显色物的光吸收特性来测定蛋白质的含量。

1. 低里氏法低里氏法是一种经典的蛋白质含量测定方法，其原理是利用试剂双硫苏三唑酮（DTNB）与蛋白质中的半胱氨酸残基反应产生黄色的二硫苏三唑，然后通过分光光度计测定其在412nm处的吸光度，根据标准曲线计算出蛋白质的含量。

2. 伯杰法伯杰法是一种基于酪蛋白与浊度试剂金霉素的显色反应来测定蛋白质含量的方法。

酪蛋白与金霉素结合形成沉淀，通过比色法测定沉淀的光吸收度，再根据标准曲线计算出蛋白质的含量。

3. 白蛋白-酷伊斯基（BCA）法BCA法是一种常用的高灵敏度蛋白质测定方法，其原理是在碱性条件下，蛋白质与BCA试剂中的铜离子络合生成紫色的离子螯合物，通过比色法测定在562nm处的光吸收度，再根据标准曲线计算出蛋白质的含量。

二、光谱法光谱法是一种基于蛋白质在特定波长下的吸收特性来测定蛋白质含量的方法。

1. 紫外吸收法紫外吸收法根据蛋白质中的芳香族氨基酸（如酪氨酸、酪氨酸和色氨酸）在紫外光区域（200-400nm）的吸收特性来测定蛋白质含量。

通过分光光度计测定蛋白质溶液在280nm处的吸光度，再根据标准曲线计算出蛋白质的含量。

2. 近红外光谱法近红外光谱法是一种无损、非破坏性的蛋白质含量测定方法，其原理是利用蛋白质溶液在近红外光区域（700-2500nm）的吸收特性与其含量之间的关系。

通过近红外光谱仪获取蛋白质溶液的光谱图像，然后利用化学计量学方法建立标准模型，通过光谱图像预测蛋白质的含量。

三、生化分析法生化分析法是一种利用生化技术和仪器设备来测定蛋白质含量的方法。

α1α2球蛋白是人体内重要的蛋白质组分，主要由肝脏合成。

它们在血液中的含量可以反映肝功能的状况。

对于α1α2球蛋白的标准值，不同实验室和
地区可能会有所差异，但一般来说，成年人的参考范围如下：
1. α1球蛋白：正常值范围为0.7-1.8g/L。

2. α2球蛋白：正常值范围为0.4-1.4g/L。

如果α1α2球蛋白的测定值超出正常范围，可能表明肝功能存在异常。

需要注意的是，单独的α1α2球蛋白测定值异常并不足以确诊肝病，需要结合其他肝功能指标和临床症状综合判断。

在检测肝功能时，最好进行全面的肝功能检查，包括转氨酶、碱性磷酸酶、γ-谷氨酰转移酶等多种指标，以获得更准确的诊断结果。

一、实验目的1. 了解组分蛋白测定的原理和方法。

2. 掌握组分蛋白测定实验的步骤和注意事项。

3. 培养实验操作技能，提高对蛋白质组分分析的认识。

二、实验原理组分蛋白测定是利用特定的方法将蛋白质样品中的各种组分分离，并对各组分进行定量分析。

本实验采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）技术，对蛋白质样品进行分离，并通过比色法测定各组分蛋白的相对含量。

SDS-PAGE是一种常用的蛋白质分离技术，其原理是在样品中加入一定浓度的SDS （十二烷基硫酸钠）和还原剂（如β-巯基乙醇），使蛋白质发生变性、解离，形成SDS-蛋白质复合物。

SDS-蛋白质复合物在电场作用下，根据分子量大小进行分离。

由于SDS对蛋白质的变性作用，蛋白质的分子量与其迁移率呈线性关系，因此可以通过测定各组分蛋白的迁移率来推算其分子量。

比色法是一种快速、简便的定量分析方法，其原理是利用蛋白质与特定试剂反应产生的颜色变化与蛋白质含量成正比，通过比色计测定吸光度，从而计算蛋白质含量。

三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 蛋白质样品- SDS-PAGE凝胶- 电泳缓冲液- 还原剂- 标准蛋白溶液- 比色试剂- 比色计2. 实验仪器：- 电泳仪- 离心机- 研钵- 移液器- 烧杯- 移液管- 比色杯四、实验步骤1. 准备SDS-PAGE凝胶：按照说明书配制SDS-PAGE凝胶，加入蛋白质样品、还原剂和上样缓冲液。

2. 电泳：将SDS-PAGE凝胶置于电泳仪中，加入电泳缓冲液，设置电压和电泳时间。

3. 取出凝胶：电泳结束后，取出凝胶，用考马斯亮蓝G250染色。

4. 洗脱：将染色后的凝胶置于脱色液中，脱色至背景清晰。

5. 定量分析：将凝胶置于比色杯中，加入比色试剂，用比色计测定吸光度。

6. 结果分析：根据标准蛋白溶液的吸光度值和蛋白质含量，绘制标准曲线。

根据实验样品的吸光度值，从标准曲线上查找相应的蛋白质含量。

五、实验结果与分析1. 实验结果：通过SDS-PAGE分离，蛋白质样品被成功分离成多个组分。

蛋白质分子量测定方法目前，蛋白质分子量测定的常用方法主要有四种：年度法、凝胶过滤层析法、凝胶电泳法和凝胶渗透色谱(GPC)法。

一、粘度法一定温度条件下，高聚物稀溶液的粘度与其分子量之间呈正相关性，随着分子量的增大，聚合物溶液的粘度增大。

通过测定高聚物稀溶液粘度随浓度的变化，即可计算出其平均分子量(粘均分子量)。

该方法操作简单、设备价格较低，通常不需要标准样品，但无法测定聚合物的分子量分布。

粘度法所需设备：恒温槽、乌倍路德粘度计。

二、凝胶过滤层析法在凝胶色谱柱中，分子量不同的聚合物分子，由于其渗入凝胶微孔的能力不同而在柱中得以分离。

分子量较大的分子，渗入凝胶微孔较浅，随洗脱液流动速度较快，因而先流出色谱柱；相反，分子量较小的聚合物分子后流出。

通过测定从进样到聚合物分子流出色谱柱期间流过凝胶柱的洗脱液的体积，并与标准样品比较，即可计算聚合物的分子量，并估算其分子量分布。

凝胶层析技术操作方便，设备简单，样品用量少，而且有时不需要纯物质，用一粗制品即可，目前已得到相当广泛的应用。

凝胶层析法测定分子量也有一定的局限性，在pH6—8的范围内，线性关系比较好，但在极端pH时，一般蛋白质有可能因变性而偏离。

糖蛋白在含糖量超过5%时，测得分子量比真实的要大，铁蛋白则与此相反，测得的分子量比真实的要小。

凝胶过滤层析法所需设备：层析柱、紫外分光光度计。

三、SDS-凝胶电泳法SDS是十二烷基硫酸钠的简称，它是一种阴离子表面活性剂，加入到电泳系统中能使蛋白质的氢键和疏水键打开，并结合到蛋白质分子上（在一定条件下，大多数蛋白质与SDS的结合比为1.4gSDS/1g蛋白质），使各种蛋白质-SDS复合物都带上相同密度的负电荷，其数量远远超过了蛋白质分子原有的电荷量，从而使其电泳迁移率只取决于分子大小这一因素，于是根据标准蛋白质分子量的对数和迁移率所作的标准曲线，可求得未知物的分子量。

SDS-凝胶电泳法是目前蛋白质分子量测定中使用最广泛的方法，实验成本较低，仪器设备也相对很简单，一套电泳装置即可。

实验一蛋白质分子的测定─凝胶层析法一、实验原理凝胶层析法（即凝胶过滤法，gel filtration）是利用凝胶把分子大小不同的物质分离开的一种方法。

将凝胶颗粒在适宜溶剂中浸泡，使充分吸液膨胀，然后装入层析柱中，加入欲分离的混合物，再以同一溶剂洗脱，在洗脱过程中大分子不能进入凝胶内部而沿凝胶颗粒间的空隙最先流出柱外，小分子可以进入凝胶内部，流苏缓慢，一直最后流出柱外，从而使样品中分子大小不同的物质得以分离。

凝胶是由胶体溶液凝结而成的固体物质，不论是天然凝胶还是人工合成凝胶，其内部都具有很微细的多空网状结构。

凝胶层析法常用的天然凝胶是琼脂糖凝胶（Sepharose），人工合成的凝胶是聚丙烯酰胺凝胶（Bio-gel-P）和葡聚糖凝胶（Sephadex G）。

其中葡聚糖凝胶是具有不同孔隙度的立体网状结构的凝胶，不溶于水。

将凝胶装柱后，柱床体积称为“总体积”，以Vt表示。

Vt由V o，Vi与Vg三部分组成，即Vt=Vi+Vg+V o。

V o为“孔隙体积”、“外水体积”，即存在于柱床内凝胶颗粒外面空隙之间的水相体积；Vi为内体积，即凝胶颗粒内部所含水相的体积；Vg为凝胶本身体积；Ve为洗脱体积，即自加入样品时算起到组分最大浓度（峰）出现时所流出的体积，Ve与V o及Vi之间的关系为：Ve=V o+K d Vi，；K d为样品组分在二相间的分配系数，Kd=(Ve-V o)/Vi，有效分配系数为Kav，Kav=(Ve-V o)/(Vt-V o)。

在一般情况下，凝胶对组分没有吸附作用时，当流动相流过Vt体积后，所有的组分都应该被洗出来，这一点为凝胶层析的特点，与一般层析方法不同。

Ve与分子量的关系：对同一类型的化合物，洗脱特性与组分的分子量有关，流过凝胶柱时，按分子量大小顺序流出，分子量大的走在前面。

Ve与分子量的关系为：Ve=K1-K2logM，K1与K2为常数，M为分子量，通常用Kav代替V e，建立标准蛋白质分子式量LgM与Kav的标准曲线，称为“选择曲线”。

蛋白质组学三大基本技术
1、质谱技术：质谱技术是蛋白质组学中最常用的和最基本的技术，它可以检测和识
别各种生物样品中的蛋白质和其他大分子有机物，从而可以提高研究的准确性，特别是在
研究动态蛋白信号转导及表观遗传因子的时候，质谱技术的应用更加广泛。

质谱技术包括
两种：基于气相法的高级数据库技术，和基于液相法的maldi技术。

质谱技术主要是利用
质谱仪来获取受体上蛋白质结构的数据，然后利用数据库搜索，来识别出蛋白质结构特征
及在受体上的结合状态。

2、SDS-PAGE技术：SDS-PAGE技术是一种蛋白电泳分析技术，它可以分离组成复合蛋
白的每个蛋白质组分，并对蛋白质的组成成分及其特有的分子量进行测定，是一种蛋白质
分类及检测的基础性技术。

SDS-PAGE技术利用聚丙烯酰胺亚胺(SDS)作为为分子内部量均
分剂，可将蛋白链折叠、聚集形成单个分子，然后进行电泳分离操作，在膜隔开一定距离，然后再对所获取到的蛋白分子特征进行识别，以得出它的结构和分子量的信息，进而得出
受体上分子的特征及其功能。

3、免疫淋巴细胞技术：免疫淋巴细胞技术是实验可能性较好、分离效果更好。

它以
电泳分离技术作为分离介质，从新鲜样品中分离出完整的肽盐化药物，可有效地检测及克
隆受体上的蛋白片段及肩膀，进而得出蛋白质组学上受体特征及其功能。

小麦籽粒蛋白组分测定
小麦是一种广泛种植的农作物，其籽粒中含有丰富的蛋白质。

对小麦籽粒蛋白组分的测定对于了解小麦的品质和营养价值具有重要意义。

小麦籽粒蛋白组分测定是通过一系列的实验方法和技术来进行的。

首先，需要将小麦籽粒样品进行研磨，得到细粉末。

然后，利用溶液进行提取，将蛋白质从其他组分中分离出来。

接下来，通过离心等操作，将提取的蛋白质进一步纯化和分离。

最后，利用色谱技术或质谱技术等方法，对蛋白质进行定性和定量分析。

小麦籽粒蛋白组分的测定可以得到多个指标，例如总蛋白质含量、谷蛋白含量、球蛋白含量等。

这些指标可以反映小麦的营养价值和品质。

总蛋白质含量是评价小麦蛋白质丰富程度的重要指标，谷蛋白含量是衡量小麦蛋白质营养价值的关键指标，而球蛋白含量则与小麦面筋质地和加工性能有关。

小麦籽粒蛋白组分的测定对于小麦品种改良和农产品质量控制具有重要意义。

通过了解小麦蛋白质的组成和含量，可以选择适合特定用途的小麦品种。

同时，对于小麦加工工业来说，了解小麦蛋白质的特性可以优化加工工艺，提高产品质量。

小麦籽粒蛋白组分测定是一项重要的研究工作，对于了解小麦的品质和营养价值具有重要意义。

通过科学准确的实验方法和技术，可
以获取关于小麦蛋白质组分的详细信息，为小麦品种改良和农产品质量控制提供科学依据。

我们相信，随着科技的不断进步，小麦籽粒蛋白组分测定将在农业领域发挥越来越重要的作用。

江苏农业学报(ＪｉａｎｇｓｕＪ.ｏｆＡｇｒ.Ｓｃｉ.)ꎬ２０２３ꎬ３９(１):３０￣３６ｈｔｔｐ://ｊｓｎｙｘｂ.ｊａａｓ.ａｃ.ｃｎ戚良轩ꎬ徐晴玉ꎬ李㊀晶ꎬ等.灰飞虱唾液鞘形态及其蛋白质组分鉴定[Ｊ].江苏农业学报ꎬ２０２３ꎬ３９(１):３０￣３６.ｄｏｉ:１０.３９６９/ｊ.ｉｓｓｎ.１０００￣４４４０.２０２３.０１.００４灰飞虱唾液鞘形态及其蛋白质组分鉴定戚良轩１ꎬ㊀徐晴玉１ꎬ㊀李㊀晶１ꎬ㊀鞠佳菲１ꎬ㊀孙㊀洋２ꎬ㊀方继朝１ꎬ３ꎬ㊀纪㊀锐１ꎬ２ꎬ３(１.江苏省农业科学院植物保护研究所ꎬ江苏南京２１００１４ꎻ２.安徽师范大学生命科学学院/安徽省重要生物资源保护与利用研究重点实验室ꎬ安徽芜湖２４１０００ꎻ３.淮阴师范学院/江苏省区域现代农业与环境保护协同创新中心ꎬ江苏淮安２２３３００)收稿日期:２０２２￣０９￣２６基金项目:国家自然科学基金面上项目(３１８７１９６５)ꎻ 十四五 国家重点研发计划项目(２０２１ＹＦＤ１４０１１００)ꎻ江苏省农业科技自主创新基金项目[ＣＸ(２２)３０１８]作者简介:戚良轩(１９９３－)ꎬ男ꎬ安徽铜陵人ꎬ博士ꎬ助理研究员ꎬ主要从事作物与害虫互作研究ꎬ(Ｅ￣ｍａｉｌ)４７０７２４５６４＠ｑｑ.ｃｏｍꎮ徐晴玉为共同第一作者ꎮ通讯作者:纪㊀锐ꎬ(Ｅ￣ｍａｉｌ)ｊｉｒｕｉ＠ｊａａｓ.ａｃ.ｃｎꎻ方继朝ꎬ(Ｅ￣ｍａｉｌ)ｆａｎｇｊｃ＠ｊａａｓ.ａｃ.ｃｎ㊀㊀摘要:㊀灰飞虱是一种小型的刺吸式口器昆虫ꎬ是危害水稻的主要害虫之一ꎮ灰飞虱刺吸取食时分泌的胶状唾液可形成唾液鞘ꎬ保护口针并帮助取食ꎬ同时其中的蛋白质效应子在调控作物免疫中扮演重要角色ꎮ本研究利用扫描电子显微镜观察了灰飞虱唾液鞘的形态:多呈树枝状ꎬ表面为较为光滑的珠状结构ꎮ应用双层膜装置收集了若虫的唾液鞘ꎬ经液相色谱与串联质谱联用检测鉴定得到４２种灰飞虱唾液鞘蛋白质ꎬ其中１９种蛋白质检测到２个及以上的唯一肽段ꎮ进一步分析了编码这１９种蛋白质的基因在各个组织中的表达模式ꎬ发现其中８个基因在唾液腺中明显高表达ꎬ推测其可能参与了唾液鞘的形成以及害虫￣作物的互作ꎮ唾液鞘蛋白质组分鉴定为后续筛选和研究灰飞虱效应子功能提供了基础ꎬ有助于明确灰飞虱￣水稻互作的分子机制ꎬ为开发害虫绿色防控新策略提供思路ꎮ关键词:㊀灰飞虱ꎻ唾液鞘ꎻ蛋白质组分中图分类号:㊀Ｓ４３５.１１２㊀㊀㊀文献标识码:㊀Ａ㊀㊀㊀文章编号:㊀１０００￣４４４０(２０２３)０１￣００３０￣０７ＭｏｒｐｈｏｌｏｇｙａｎｄｐｒｏｔｅｉｎｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｓａｌｉｖａｒｙｓｈｅａｔｈｆｒｏｍＬａｏｄｅｌｐｈａｘｓｔｒｉａｔｅｌｌｕｓＱＩＬｉａｎｇ￣ｘｕａｎ１ꎬ㊀ＸＵＱｉｎｇ￣ｙｕ１ꎬ㊀ＬＩＪｉｎｇ１ꎬ㊀ＪＵＪｉａ￣ｆｅｉ１ꎬ㊀ＳＵＮＹａｎｇ２ꎬ㊀ＦＡＮＧＪｉ￣ｃｈａｏ１ꎬ３ꎬ㊀ＪＩＲｕｉ１ꎬ２ꎬ３(１.ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＰｌａｎｔＰｒｏｔｅｃｔｉｏｎꎬＪｉａｎｇｓｕＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓꎬＮａｎｊｉｎｇ２１００１４ꎬＣｈｉｎａꎻ２.ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｆｏｒＣｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎａｎｄＵｓｅｏｆＩｍｐｏｒ￣ｔａｎｔＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＲｅｓｏｕｒｃｅｓｏｆＡｎｈｕｉＰｒｏｖｉｎｃｅ/ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓꎬＡｎｈｕｉＮｏｒｍａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬＷｕｈｕ２４１０００ꎬＣｈｉｎａꎻ３.ＪｉａｎｇｓｕＣｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅＩｎｎｏｖａｔｉｏｎＣｅｎｔｅｒｏｆＲｅｇｉｏｎａｌＭｏｄｅｒｎＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ＆ＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＰｒｏｔｅｃｔｉｏｎ/ＨｕａｉｙｉｎＮｏｒｍａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬＨｕａｉᶄａｎ２２３３００ꎬＣｈｉｎａ)㊀㊀Ａｂｓｔｒａｃｔ:㊀Ｓｍａｌｌｂｒｏｗｎｐｌａｎｔｈｏｐｐｅｒ(ＳＢＰＨ)Ｌａｏｄｅｌｐｈａｘｓｔｒｉａｔｅｌｌｕｓꎬｔｈｅｔｉｎｎｙｓａｐ￣ｓｕｃｋｉｎｇｉｎｓｅｃｔｓꎬｉｓｏｎｅｏｆｔｈｅｍｏｓｔｄｅｓｔｒｕｃｔｉｖｅｈｅｒｂｉｖｏｒｅｓｄａｍａｇｉｎｇｒｉｃｅｉｎＣｈｉｎａ.ＤｕｒｉｎｇｔｈｅｆｅｅｄｉｎｇｐｒｏｃｅｓｓꎬｇｅｌｓａｌｉｖａｓｅｃｒｅｔｅｄｂｙＳＢＰＨｓｃａｎｆｏｒｍｔｈｅｓａｌｉｖａｒｙｓｈｅａｔｈｔｏｐｒｏｔｅｃｔｓｔｙｌｅｔａｎｄｈｅｌｐｆｅｅｄｉｎｇ.Ｓｏｍｅｐｒｏｔｅｉｎｅｆｆｅｃｔｏｒｓｉｎｔｈｅｓａｌｉｖａｒｙｓｈｅａｔｈｐｌａｙｉｍｐｏｒｔａｎｔｒｏｌｅｓｉｎｒｅｇｕｌａ￣ｔｉｎｇｐｌａｎｔｉｍｍｕｎｉｔｙ.ＨｅｒｅꎬｗｅｏｂｓｅｒｖｅｄｔｈｅｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙｏｆＳＢＰＨｓａｌｉｖａｒｙｓｈｅａｔｈｓｕｎｄｅｒｓｃａｎｎｉｎｇｅｌｅｃｔｒｏｎｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ:ｍｏｓｔｓａｌｉｖａｒｙｓｈｅａｔｈｓｗｅｒｅｄｅｎｄｒｉｔｉｃａｎｄｈａｄｓｍｏｏｔｈｂｅａｄｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓｉｎｔｈｅｓｕｒｆａｃｅ.ＴｈｅｓａｌｉｖａｒｙｓｈｅａｔｈｓｏｆＳＢＰＨｎｙｍｐｈｓｗｅｒｅｃｏｌｌｅｃｔｅｄｕｓｉｎｇｄｏｕｂｌｅｍｅｍｂｒａｎｅｄｅｖｉｃｅ.Ａｆｔｅｒｔｈｅｌｉｑｕｉｄｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ￣ｔａｎｄｅｍｍａｓｓｓｐｅｃ￣ｔｒｏｍｅｔｅｒ(ＬＣ￣ＭＳ/ＭＳ)ａｎａｌｙｓｉｓꎬ４２ｐｒｏｔｅｉｎｓｗｅｒｅｆｉｎａｌｌｙｉ￣ｄｅｎｔｉｆｉｅｄｉｎｔｈｅｓａｌｉｖａｒｙｓｈｅａｔｈｓꎬａｎｄａｍｏｎｇｔｈｅｍꎬ１９ｐｒｏ￣ｔｅｉｎｓｗｉｔｈｔｗｏｏｒｍｏｒｅｕｎｉｑｕｅｐｅｐｔｉｄｅｓｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄ.Ｕ￣ｓｉｎｇｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎꎬｗｅａｎａｌｙｚｅｄ０３ｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｐａｔｔｅｒｎｓｏｆｇｅｎｅｓｅｎｃｏｄｉｎｇｔｈｅｓｅ１９ｐｒｏｔｅｉｎｓｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｔｉｓｓｕｅｓｏｆＳＢＰＨꎬａｎｄｆｏｕｎｄｅｉｇｈｔｇｅｎｅｓｗｉｔｈｄｒａｍａｔ￣ｉｃａｌｌｙｈｉｇｈｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｓｉｎｔｈｅｓａｌｉｖａｒｙｇｌａｎｄꎬｓｕｇｇｅｓｔｉｎｇｔｈｅｉｒｉｍｐｏｒｔａｎｃｅｉｎｔｈｅｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆｓａｌｉｖａｒｙｓｈｅａｔｈｓａｎｄｉｎ￣ｔｅｒａｃｔｉｏｎｏｆｉｎｓｅｃｔａｎｄｐｌａｎｔ.ＴｈｅｓｅｒｅｓｕｌｔｓｌａｙａｓｏｌｉｄｆｏｕｎｄａｔｉｏｎｆｏｒｓｔｕｄｙｉｎｇｔｈｅｆｕｎｃｔｉｏｎｏｆＳＢＰＨｓａｌｉｖａｒｙｓｈｅａｔｈꎬｒｅｖｅａ￣ｌｉｎｇｔｈｅｄｅｔａｉｌｅｄｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆＳＢＰＨ￣ｒｉｃｅｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎꎬａｎｄｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇｇｒｅｅｎｐｅｓｔｍａｎａｇｅｍｅｎｔｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ:㊀Ｌａｏｄｅｌｐｈａｘｓｔｒｉａｔｅｌｌｕｓꎻｓａｌｉｖａｒｙｓｈｅａｔｈꎻｐｒｏｔｅｉｎｃｏｍｐｏｎｅｎｔ㊀㊀作物与害虫之间一直存在共同进化的 军备 竞赛ꎮ作物通过受体识别与感知害虫的相关分子信号激活一系列的免疫反应ꎬ比如:诱发钙离子内流ꎬ激活丝裂原活化蛋白激酶途径ꎬ诱导活性氧爆发和抗虫激素积累ꎬ进而产生有毒物质影响昆虫的取食㊁发育ꎬ或产生挥发物来吸引害虫天敌ꎮ相应地ꎬ害虫也进化出各种对抗策略来逃避与破解植物的防御反应ꎬ分泌效应子至宿主作物体内就是其中的重要策略之一[１]ꎮ灰飞虱(Ｌａｏｄｅｌｐｈａｘｓｔｒｉａｔｅｌｌｕｓ)等刺吸式口器害虫在取食过程中ꎬ向作物体内不断地分泌２种类型的唾液 水状唾液与胶状唾液ꎬ调控植物免疫ꎬ帮助昆虫取食[２]ꎮ水状唾液中的酶类可以将植物的营养物质初步降解ꎬ有利于消化吸收ꎬ部分效应子还能以多种形式与植物抗虫因子相互作用ꎬ比如ꎬ(１)酶解宿主植物中的抗虫物质:褐飞虱(Ｎｉｌａｐａｒｖａｔａｌｕｇｅｎｓ)唾液中的内切β￣１ꎬ４￣葡聚糖酶能分解水稻中的纤维素ꎬ便于口针在水稻细胞间和向细胞内穿刺时突破细胞壁屏障ꎬ帮助其顺利取食[３]ꎮ灰飞虱唾液中的ＤＮａｓｅＩＩ能够降解刺吸损伤时植物产生的胞外ＤＮＡꎬ进而抑制刺吸损伤诱导的防御反应[４]ꎻ(２)与植物细胞内的金属离子结合:褐飞虱和灰飞虱唾液中的钙结合蛋白通过结合水稻细胞质中的Ｃａ２＋ꎬ阻断钙信号通道ꎬ抑制取食所诱导的水稻胼胝质沉积以及抗虫信号分子的积累[５￣７]ꎻ(３)与植物中的关键抗虫蛋白质互作:灰飞虱效应子卵黄原蛋白在细胞核中与免疫调控转录因子ＯＷＲＫＹ７１互作ꎬ并抑制其转录活性ꎬ进而抑制ＯｓＷＲＫＹ７１介导的防御反应[８]ꎻ烟粉虱(Ｂｅｍｉｓｉａｔａｂａｃｉ)效应子Ｂｔ５６㊁Ｂｓｐ９㊁Ａｒ￣ｍｅｔ分别和寄主植物中的转录因子ＮＴＨ２０２和ＷＲＫＹ３３以及半胱氨酸蛋白酶抑制子ＣＹＳ６互作ꎬ抑制植物免疫[９￣１１]ꎮ然而ꎬ胶状唾液的成分鉴定和功能分析的报道相对较少ꎬ目前仅在褐飞虱中鉴定到１６种蛋白质[１２]ꎮ胶状唾液分泌进入植物体内后凝结成唾液鞘ꎬ包裹㊁润滑和保护口针[１３]ꎬ还能隔绝口针和植物细胞结构的接触ꎬ封闭针刺产生的细胞伤口ꎬ防止植物细胞内容物外流所引发的免疫反应ꎮ飞虱唾液鞘中的主要蛋白质(Ｓａｌｉｖａｒｙｓｈｅａｔｈｐｒｏｔｅｉｎ和Ｍｕｃｉｎ)对于唾液鞘的形成和取食至关重要[１４￣１５]ꎬ沉默Ｍｕｃｉｎ能影响飞虱的取食行为ꎬ不利于植物病毒的水平传播[１６]ꎬ而且Ｍｕｃｉｎ还可以被作物识别ꎬ激发强烈的防御反应[１５]ꎮ灰飞虱属半翅目飞虱科害虫ꎬ由其直接取食㊁产卵和传播病毒病所引起的粮食减产损失极其严重ꎮ唾液是植物￣病毒￣昆虫三者互作的关键因素ꎬ鉴定灰飞虱的唾液鞘蛋白效应子ꎬ设计相应策略阻断这些唾液效应子的功能ꎬ一方面可以有效地控制灰飞虱的直接危害ꎬ另一方面通过抑制其取食来阻断作物病毒的水平传播ꎬ起到 一石二鸟 的作用ꎮ本研究拟在电子显微镜下观察灰飞虱唾液鞘的形态ꎬ利用液相色谱与串联质谱联用(Ｌｉｑｕｉｄｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ￣ｔａｎｄｅｍｍａｓｓｓｐｅｃ￣ｔｒｏｍｅｔｅｒꎬＬＣ￣ＭＳ/ＭＳ)等方法鉴定灰飞虱唾液鞘蛋白质组分ꎬ并采用定量ＰＣＲ技术对唾液鞘基因的组织表达模式进行分析ꎬ为后续效应子筛选积累重要的蛋白质资源ꎮ１㊀材料与方法１.１㊀供试昆虫灰飞虱在人工气候室内[温度:(２８ʃ１)ħꎻ光周期:１４ｈ光照㊁１０ｈ黑暗]以南粳９１０８稻苗为寄主进行饲养ꎮ１.２㊀双层膜夹蔗糖溶液用高压灭菌后的超纯水溶解蔗糖ꎬ配置成２.５％的蔗糖溶液ꎬ经针孔式过滤器(滤膜孔径０ ２２μｍ)除菌ꎮ将Ｐａｒａｆｉｌｍ膜裁成小方块ꎬ置于紫外灯下灭菌１ｈꎮ将充分拉伸过的膜覆盖在双通玻璃管的一端ꎬ另一端用纱布包住透气ꎮ将８０μｌ蔗糖溶液滴到膜的中央位置ꎬ再覆上第２层膜ꎬ压紧２层膜使蔗１３戚良轩等:灰飞虱唾液鞘形态及其蛋白质组分鉴定糖溶液在膜间充分铺展ꎮ１.３㊀唾液鞘样品处理及形态观察(１)样品收集与清洗:将约６０头４~５龄灰飞虱若虫放进双通管中ꎬ待灰飞虱在上述的Ｐａｒａｆｉｌｍ膜上取食蔗糖溶液２４ｈ后ꎬ用７５％乙醇溶液轻轻漂洗带有唾液鞘的膜ꎮ(２)固定:将４％多聚甲醛与２ ５％戊二醛(２ʒ１ꎬ体积比)混合配置成固定液ꎬ对Ｐａｒａｆｉｌｍ膜进行固定ꎬ然后去除固定液ꎬ并用ＰＢＳ溶液进行清洗ꎮ(３)脱水:用梯度浓度的乙醇溶液(３０％~１００％)对样品进行梯度脱水ꎮ(４)置换:向上述样品中倒入醋酸异戊酯和乙醇(１ʒ２ꎬ体积比)的混合液ꎬ适当摇动１０ｍｉｎꎻ转移膜至醋酸异戊酯ʒ乙醇(１ʒ１ꎬ体积比)的混合液中ꎬ摇动１０ｍｉｎꎻ最后转移膜至醋酸异戊酯中ꎬ缓慢摇动１０ｍｉｎꎬ从样品中充分置换出乙醇ꎮ(５)干燥:用滤纸吸除样品表面残留的醋酸异戊酯ꎬ将样品膜在室温下干燥２４ｈꎬ然后转移至５０ħ的烘箱中ꎬ干燥２ｈꎻ(６)粘样㊁镀膜:采用导电双面胶将膜粘到样品台上ꎬ利用离子溅射法镀膜ꎻ(７)样品观察:在扫描电镜观察室进行观察ꎬ拍摄获得唾液鞘的清晰图片ꎮ涉及的具体方法参照文献[１７]ꎮ１.４㊀唾液鞘收集在体视显微镜下观察ꎬ用镊子从Ｐａｒａｆｉｌｍ膜上取下完整的唾液鞘ꎬ放入ＳＤＴ蛋白裂解液中ꎬ－８０ħ保存ꎮ取约６０００头若虫的唾液鞘ꎬ超声波破碎处理(１００Ｗ工作１０ｓꎬ间歇１０ｓꎬ循环１０次)ꎬ沸水浴１０ｍｉｎꎮ离心后取上清液ꎬ利用胰蛋白酶进行充分酶解ꎬ获得肽段ꎮ１.５㊀ＬＣ￣ＭＳ/ＭＳ测定上述酶解后的肽段上样到经０ １％甲酸溶液平衡过的色谱柱ꎬ再经分析柱分离ꎬＨＰＬＣ系统流速设定为０ ３μｌ/ｍｉｎꎮ色谱分离后的产物进一步用Ｑ￣Ｅｘａｃｔｉｖｅ质谱仪检测２ｈꎮ１.６㊀质谱数据分析和蛋白质鉴定将获得的质谱数据利用ＭＡＳＣＯＴ软件比对灰飞虱基因组预测的蛋白质数据库(ｈｔｔｐｓ://ｗｗｗ.ｎｃｂｉ.ｎｌｍ.ｎｉｈ.ｇｏｖ/ｄａｔａ￣ｈｕｂ/ｇｅｎｏｍｅ/?ｔａｘｏｎ＝１９５８８３＆ａｎｎｏｔａｔｅｄ＿ｏｎｌｙ＝ｔｒｕｅ＆ｒｅｆｓｅｑ＿ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ＝ｔｒｕｅ＆ｇｅｎｂａｎｋ＿ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ＝ｔｒｕｅ)ꎮ参数设定如下:ｅｎｚｙｍｅ为ｔｒｙｐｓｉｎꎻｍｉｓｓｅｄｃｌｅａｖ￣ａｇｅｓｉｔｅｓ为２ꎻｆｉｘｅｄｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ为ｃａｒｂａｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌꎻｖａｒ￣ｉａｌｂｅｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ为ｏｘｉｄａｔｉｏｎ(Ｍ)和Ａｃｅｔｙｌ(ＰｒｏｔｅｉｎＮ￣ｔｅｒｍ)ꎻ过滤参数ＦＤＲɤ０ ０１ꎮ１.７㊀灰飞虱各组织总ＲＮＡ提取和荧光定量ＰＣＲ分析㊀㊀灰飞虱各组织总ＲＮＡ的提取参照普洛麦格生物技术有限公司的总ＲＮＡ提取试剂盒说明书进行ꎬ提取的总ＲＮＡ用琼脂糖凝胶电泳和艾本德有限公司的微量分光光度计检测其质量和浓度ꎮｃＤＮＡ合成参照宝生物工程有限公司的反转录试剂盒说明书进行ꎮ定量ＰＣＲ配置体系和方法参照宝生物工程有限公司的染料法荧光定量试剂盒(ＴＢＧｒｅｅｎＴＭＰｒｅｍｉｘＥｘＴａｑＴＭｋｉｔ)说明书进行ꎬ在罗氏的ＬｉｇｈｔＣｙ￣ｃｌｅｒ４８０ＩＩ实时荧光定量ＰＣＲ仪上进行反应ꎮ灰飞虱延伸因子基因(ＥＦ￣１)为内参基因ꎬ唾液鞘基因相对表达量的计算采用２－әＣｔ方法[８]ꎮ２㊀结果与分析２.１㊀灰飞虱唾液鞘形态利用扫描电子显微镜观察Ｐａｒａｆｉｌｍ膜上的灰飞虱唾液鞘的形态ꎮ唾液鞘多为树枝状ꎬ可有多个分叉ꎬ大多数表面为较光滑的珠状结构(图１)ꎮ图１㊀扫描电子显微镜观察的灰飞虱唾液鞘的形态Ｆｉｇ.１㊀Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎｏｆｓｍａｌｌｂｒｏｗｎｐｌａｎｔｈｏｐｐｅｒｓａｌｉｖａｒｙｓｈｅａｔｈｕｎｄｅｒｓｃａｎｎｉｎｇｅｌｅｃｔｒｏｎｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ２.２㊀灰飞虱唾液鞘样品质量检测收集到６９ ７μｇ灰飞虱唾液鞘蛋白质ꎬ利用ＳＤＳ￣ＰＡＧＥ分析了唾液鞘样品的质量ꎬ蛋白质条带(考染)清晰㊁丰富(图２)ꎬ表明唾液鞘蛋白质含量较高ꎬ并且未发生明显的降解和损失ꎮ唾液鞘样品质量较好ꎬ可满足后续蛋白质组分测定的要求ꎮ２３江苏农业学报㊀２０２３年第３９卷第１期２.３㊀灰飞虱唾液鞘蛋白质鉴定与注释利用ＬＣ￣ＭＳ/ＭＳ检测了灰飞虱唾液鞘的蛋白质成分ꎬ共鉴定到４２种蛋白质ꎬ其中１９种蛋白质检测到的肽段数量较多ꎬ有２~３４个唯一肽段ꎻ其他２３种蛋白质只检测到１条唯一肽段ꎮ利用ＳｉｇｎａｌＰ￣５.０预测这些唾液鞘蛋白质的信号肽序列:仅４个含信号肽ꎬ分别是精氨酸激酶和肌动蛋白ꎬ以及２个未知功能蛋白质(ＫＡＦ７７５１９７４.１和ＲＺＦ３３３７９.１)ꎮ将鉴定到的蛋白质氨基酸序列比对到ＮＣＢＩ的Ｎｏｎ￣ＲｅｄｕｎｄａｎｔＰｒｏｔｅｉｎ(ＮＲ)数据库进行功能注释ꎬ发现其中３６个具有功能注释结果(表１)ꎮ肌球蛋白重链在唾液鞘蛋白质中含量最高ꎬ检测到３４个唯一肽段ꎮ副肌球蛋白质的含量次之ꎬ检测到１２个唯一肽段ꎮ图２㊀ＳＤＳ￣ＰＡＧＥ分析灰飞虱唾液鞘样品Ｆｉｇ.２㊀Ａｎａｌｙｓｉｓｏｆｓｍａｌｌｂｒｏｗｎｐｌａｎｔｈｏｐｐｅｒｓａｌｉｖａｒｙｓｈｅａｔｈｓｕ￣ｓｉｎｇＳＤＳ￣ＰＡＧＥ２.４㊀灰飞虱唾液鞘基因的组织表达模式检测到１９种唾液鞘蛋白质的唯一肽段数ȡ２(表１)ꎬ表明这些蛋白质的鉴定结果可信度较高ꎬ因此利用定量ＰＣＲ探究了这１９个基因在灰飞虱各组织中的表达模式ꎬ引物见表２ꎮ结果(图３)表明ꎬ编码副肌球蛋白㊁精氨酸激酶㊁原肌球蛋白￣１㊁延伸因子１￣α㊁肌球蛋白调节轻链２㊁碱性肌球蛋白轻链㊁组蛋白Ｈ２Ｂ以及微管蛋白β￣１链的８个基因在唾液腺中特异性高表达ꎬ而在脂肪体㊁肠道㊁精巢以及卵巢中表达量很低ꎮ其余基因在灰飞虱各个组织中均有不同程度的表达ꎮ表１㊀灰飞虱唾液鞘蛋白质组分Ｔａｂｌｅ１㊀Ｐｒｏｔｅｉｎｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓｏｆｓｍａｌｌｂｒｏｗｎｐｌａｎｔｈｏｐｐｅｒｓａｌｉｖａｒｙｓｈｅａｔｈ蛋白质组分㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀登录号㊀㊀唯一肽段数是否含有信号肽肌球蛋白重链ＡＰＡ３４０５４.１３４否副肌球蛋白ＲＺＦ４０８５４.１１２否肌动蛋白相关蛋白１ＲＺＦ３２７２３.１１０否ＡＴＰ合酶α亚基ＡＩＬ２６０６９.１５否精氨酸激酶ＲＺＦ４１８４６.１４是原肌球蛋白￣１ＲＺＦ３７４７７.１３否组蛋白Ｈ４ＸＰ＿０１５３７２５９６.１３否羧化酶/加氧酶大亚基ＡＳＤ３５３９２.１３否原肌球蛋白１ＲＺＦ４６５３７.１３否延伸因子１￣αＲＺＦ３５６８２.１３否ＡＴＰ合酶β亚基ＲＺＦ４１６５０.１３否钙转运ＡＴＰ酶ＲＺＦ３６５６０.１２否肌球蛋白调节轻链２ＲＺＦ４１８００.１２否碱性肌球蛋白轻链ＲＺＦ４５２４２.１２否组蛋白Ｈ２ＢＡＡＢ４８０９２.１２否α￣肌动蛋白ＲＺＦ３９１３４.１２否肌动蛋白ＧＦＴ５５０９０.１２否ＡＤＰ/ＡＴＰ易位酶ＲＺＦ３２５９４.１２否微管蛋白β￣１链ＸＰ＿０２２２０７９２１.１２否原肌球蛋白￣１ＸＰ＿０２２１８７６２３.１１否未知功能蛋白ＸＰ＿０２２１６８１６６.１１否未知功能蛋白ＲＺＦ３９７５７.１１否未知功能蛋白ＲＺＦ４７２６６.１１否黏蛋白ＪＦ５０２０３３.１１是动力蛋白β链ＲＺＦ４４４３７.１１否剪接因子１ＫＡＦ７７４２３２３.１１否光系统ＩＩＣＰ４３反应中心蛋白ＫＡＨ９７５２４９８.１１否可能的分泌蛋白ＱＭＵ２３６０４.１１否组蛋白Ｈ４ＣＡＦ９９２８７７８.１１否未知功能蛋白ＫＡＦ７７５１９７４.１１是表皮蛋白７ＸＰ＿０２２１８６６３４.１１否ＡＴＰ合酶α亚基ＫＸＮ６９５２８.１１否线粒体Ｆ１Ｆ０ＡＴＰ合酶ＲＣＩ０５４０５.１１否肌动蛋白ＡＭＺ０１５５３.１１否未知功能蛋白ＲＺＦ４０２３４.１１否热休克蛋白７０￣５ＡＱＰ３１３３８.１１否微管蛋白α￣１链ＲＺＦ４７５７８.１１否原肌球蛋白￣１ＲＺＦ４１１１９.１１否液泡蛋白分选蛋白ＸＰ＿０２２１９５４５８.１１否ＡＴＰ合酶脂质结合蛋白ＲＺＦ４６１９２.１１否包含ＢＴＢ/ＰＯＺ结构域的蛋白１ＲＺＦ３７４２１.１１否未知功能蛋白ＲＺＦ３３３７９.１１是３３戚良轩等:灰飞虱唾液鞘形态及其蛋白质组分鉴定ＳＧ:唾液鞘ꎻＧｕｔ:肠道ꎻＴｅ:精巢ꎻＯｖ:卵巢ꎻＦＢ:脂肪体ꎮ不同字母表示组织间同一基因的相对表达量具有显著性差异(Ｐ<０ ０５)ꎮ图３㊀灰飞虱唾液鞘基因的组织表达模式Ｆｉｇ.３㊀Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｐａｔｔｅｒｎｏｆｓａｌｉｖａｒｙｓｈｅａｔｈｇｅｎｅｓｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｔｉｓｓｕｅｓｏｆｓｍａｌｌｂｒｏｗｎｐｌａｎｔｈｏｐｐｅｒ３㊀讨论本研究利用扫描电子显微镜观察到灰飞虱唾液鞘呈树枝状的清晰形态ꎬ并收集了大量的灰飞虱唾液鞘样品ꎬ利用ＬＣ￣ＭＳ/ＭＳ测定了其蛋白质组分ꎬ鉴定得到４２个灰飞虱唾液鞘蛋白质ꎬ其中ＡＴＰ合成酶ꎬ肌动蛋白和Ｍｕｃｉｎ在褐飞虱唾液鞘蛋白质中也被鉴定到[１２]ꎬ其他唾液鞘蛋白质组分为首次报道ꎮ我们鉴定到的灰飞虱唾液鞘蛋白质数量虽然比褐飞虱唾液鞘中鉴定得到的蛋白质数量(１６种)要多[１２]ꎬ但是远少于水状唾液中鉴定得到的蛋白质数量(褐飞虱水状唾液中鉴定到１４９种蛋白质ꎬ灰飞虱中鉴定到２３６种)[１８]ꎬ这说明水状唾液中蛋白质比胶状唾液中蛋白质的种类和功能更丰富ꎬ这可能是因为水状唾液参与了飞虱取食㊁体外消化和降解㊁调控水稻防御等多种功能ꎬ而胶状唾液多为结构性蛋白质ꎬ其主要参与唾液鞘形成ꎮ４３江苏农业学报㊀２０２３年第３９卷第１期表２㊀灰飞虱唾液鞘基因定量ＰＣＲ检测的引物Ｔａｂｌｅ２㊀ＰｒｉｍｅｒｓｕｓｅｄｆｏｒｑＰＣＲｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｓａｌｉｖａｒｙｓｈｅａｔｈｇｅｎｅｓｉｎｓｍａｌｌｂｒｏｗｎｐｌａｎｔｈｏｐｐｅｒ检测基因㊀㊀㊀㊀引物(５ᶄң３ᶄ)肌球蛋白重链Ｆ:ＣＧＴＧＧＴＡＡＧＡＧＧＡＧＧＡＡＣＧＡＲ:ＴＴＣＴＴＴＧＡＧＣＴＧＧＣＡＣＣＡＡＣ副肌球蛋白Ｆ:ＡＡＣＴＧＧＡＡＣＴＧＧＡＣＧＡＧＧＡＧＲ:ＣＴＧＧＧＴＣＴＧＴＴＴＧＴＣＣＡＡＧＣ肌动蛋白相关蛋白１Ｆ:ＣＣＡＴＧＴＡＣＧＴＴＧＣＣＡＴＣＣＡＧＲ:ＡＧＧＴＡＧＴＣＧＧＴＣＡＡＧＴＣＡＣＧＡＴＰ合酶α亚基Ｆ:ＧＣＣＧＴＧＴＡＴＴＧＡＧＣＡＴＴＧＧＴＲ:ＣＡＡＴＧＴＣＧＣＣＣＴＣＣＴＴＧＡＴＧ精氨酸激酶Ｆ:ＡＣＣＴＴＣＣＴＣＧＴＡＴＧＧＴＧＣＡＡＲ:ＴＧＧＧＧＣＡＧＡＡＧＧＴＣＡＡＧＡＡＴ原肌球蛋白￣１Ｆ:ＣＣＡＡＣＣＡＡＣＴＧＡＡＧＧＡＡＧＣＣＲ:ＡＣＣＧＡＣＡＡＣＣＴＴＣＡＡＣＴＣＣＴ组蛋白Ｈ４Ｆ:ＴＣＣＧＧＴＴＴＧＡＴＴＴＡＣＧＡＡＧＡＡＡＣＲ:ＡＣＣＴＣＣＧＡＡＡＣＣＧＴＡＡＡＧＡＧ羧化酶/加氧酶大亚基Ｆ:ＡＴＧＡＧＴＧＴＣＴＡＣＧＴＧＧＴＧＧＡＲ:ＴＣＴＴＣＡＣＡＴＧＴＡＣＣＣＧＣＡＧＴ原肌球蛋白１Ｆ:ＴＧＡＧＧＡＧＧＣＣＧＡＣＡＡＧＡＡＡＴＲ:ＴＣＴＧＧＧＴＣＧＣＣＴＴＴＴＣＴＴＣＴ延伸因子１￣αＦ:ＡＡＧＴＧＣＧＧＡＧＧＴＡＴＣＧＡＣＡＡＲ:ＴＡＣＴＴＧＧＣＣＧＴＣＴＣＧＡＡＣＴＴＡＴＰ合酶β亚基Ｆ:ＧＡＴＣＧＧＴＣＴＧＴＴＴＧＧＴＧＧＴＧＲ:ＴＧＴＣＣＴＴＧＡＧＣＧＡＧＡＴＧＡＣＡ钙转运ＡＴＰ酶Ｆ:ＴＧＡＣＣＡＧＴＴＧＡＣＡＧＣＧＴＴＴＧＲ:ＴＣＣＴＴＧＧＣＣＣＴＧＡＴＣＴＴＣＴＧ肌球蛋白调节轻链２Ｆ:ＧＣＴＣＡＡＡＧＧＧＣＴＣＣＡＡＧＡＡＧＲ:ＣＴＴＣＡＧＣＧＡＧＣＡＴＧＴＣＡＴＣＣ碱性肌球蛋白轻链Ｆ:ＧＣＴＣＴＡＣＧＡＣＡＡＧＧＣＴＧＡＧＡＲ:ＡＧＣＣＡＧＧＡＡＴＧＧＧＡＴＧＴＡＧＧ组蛋白Ｈ２ＢＦ:ＴＣＡＣＴＡＣＡＡＣＡＡＡＣＧＣＴＣＧＡＣＲ:ＡＣＴＧＣＴＴＴＴＧＴＴＣＣＣＴＣＡＣＴα￣肌动蛋白Ｆ:ＧＡＣＧＧＣＡＡＣＣＴＧＡＡＧＡＴＧＡＣＲ:ＧＣＣＡＡＡＣＣＧＴＣＣＴＴＧＡＡＡＣＴ肌动蛋白Ｆ:ＴＧＧＡＴＴＴＧＧＣＴＧＧＡＣＧＡＧＡＴＲ:ＴＣＧＧＧＣＡＡＴＴＣＧＴＡＧＧＡＣＴＴＡＤＰ/ＡＴＰ易位酶Ｆ:ＴＣＡＣＴＣＴＧＣＴＴＣＧＴＣＴＡＣＣＣＲ:ＣＧＡＣＡＣＴＣＣＧＡＡＴＣＣＴＣＴＧＴ微管蛋白β￣１链Ｆ:ＣＧＣＣＧＡＴＣＴＧＡＧＡＡＡＡＣＴＧＧＲ:ＡＴＧＧＡＣＡＴＴＣＧＧＣＣＴＣＴＧＡＡ延伸因子Ｆ:ＴＣＧＡＧＴＣＣＴＴＣＣＡＧＧＡＧＴＴＣＲ:ＣＧＡＣＡＧＡＴＣＣＴＴＣＴＧＣＧＴＴＡ㊀㊀水状唾液中的降解酶可以帮助昆虫体外消化㊁分解植物中的营养物质和抗性因子ꎮ本研究在唾液鞘中虽然未检测到相关的降解酶ꎬ但鉴定到一些与能量代谢相关的酶ꎬ比如ＡＤＰ/ＡＴＰ转移酶和５种ＡＴＰ合成酶ꎬ这在稻飞虱水状唾液㊁胶状唾液中也被检测到[５ꎬ１２]ꎬ其可能在植物中发挥了与消耗能量相关的功能ꎮ此外ꎬ还发现了肌球蛋白㊁原肌球蛋白㊁副肌球蛋白㊁微管蛋白㊁肌动蛋白等参与维持细胞功能的一些结构蛋白质ꎬ推测这些蛋白质可能与唾液鞘的形成有关ꎬ其在昆虫￣植物互作中的功能尚需进一步研究ꎮ灰飞虱唾液鞘蛋白质组分比较丰富ꎬ但仅有４个蛋白质含有信号肽ꎬ这与其他刺吸式口器昆虫唾液中大部分蛋白质不含信号肽类似ꎬ说明除了内质网￣高尔基体这一经典的分泌途径外ꎬ唾液蛋白质还有着其他非经典的分泌方式[１２]ꎮ不同的唾液鞘基因在灰飞虱各组织中的表达模式不尽相同ꎬ测定的１９个基因中ꎬ４２％的基因在唾液腺中的表达水平显著高于在其他组织中的表达量ꎬ这些蛋白质可能在唾液腺中合成ꎬ然后被分泌到寄主作物中ꎬ主要在保持唾液腺的生理功能㊁维持正常的取食行为或调控水稻防御过程中发挥重要作用ꎬ它们是潜在的效应子ꎮ唾液鞘蛋白质除了具有参与唾液鞘形成以及介导昆虫与植物互作的功能ꎬ还可能参与植物病毒的传播ꎮ普通的非虫接种方式很难使病毒感染植物ꎬ唾液作为植物￣病毒￣昆虫三者互作的关键因素ꎬ极可能是病毒侵染作物并且传播爆发的关键因子ꎮ水稻条纹病毒(ＲｉｃｅｓｔｒｉｐｅｖｉｒｕｓꎬＲＳＶ)随着灰飞虱唾液进入到水稻中ꎬ最近研究发现唾液鞘蛋白质Ｍｕｃｉｎ与唾液鞘形成相关ꎬ通过影响灰飞虱的取食行为来干扰ＲＳＶ的水平传播ꎬ表明正常结构的唾液鞘对于刺吸式口器害虫水平传播植物病毒极为重要[１６]ꎮ由于唾液鞘蛋白质在植物￣病毒￣昆虫互作中的重要性及其功能的多样性ꎬ本研究鉴定到的４２种灰飞虱唾液鞘蛋白质是研究灰飞虱￣水稻￣病毒互作过程中的重要里程碑ꎮ深入研究这些蛋白质在帮助灰飞虱危害作物和传播病毒过程中的作用ꎬ一方面有利于明晰害虫￣病毒￣作物互作背后复杂的分子机制等基础科学问题ꎬ另一方面鉴定出的效应子以及与效应子互作的水稻抗虫因子ꎬ可以成为抗性育种㊁新型ＲＮＡｉ生物农药㊁高效防控的新靶标ꎬ这对于制定害虫可持续治理对策㊁研发新的绿色防控产品及技术ꎬ具有重要价值ꎮ参考文献:[１]㊀董玉妹ꎬ张美倩ꎬ沈㊀慧ꎬ等.植食性昆虫唾液效应子和激发子的研究进展[Ｊ].昆虫学报ꎬ２０２１ꎬ６４(８):９８２￣９９７.５３戚良轩等:灰飞虱唾液鞘形态及其蛋白质组分鉴定[２]㊀ＣＯＨＥＮＣＡ.Ｅｘｔｒａ￣ｏｒａｌｄｉｇｅｓｔｉｏｎｉｎｐｒｅｄａｃｅｏｕｓｔｅｒｒｅｓｔｒｉａｌａｒｔｈｒｏｐ￣ｏｄａ[Ｊ].ＡｎｎｕａｌＲｅｖｉｅｗｏｆＥｎｔｏｍｏｌｏｇｙꎬ１９９５ꎬ４０:８５￣１０３. [３]㊀ＪＩＲꎬＹＥＷＦꎬＣＨＥＮＨＤꎬｅｔａｌ.Ａｓａｌｉｖａｒｙｅｎｄｏ￣β￣１ꎬ４￣ｇｌｕ￣ｃａｎａｓｅａｃｔｓａｓａｎｅｆｆｅｃｔｏｒｔｈａｔｅｎａｂｌｅｓｔｈｅｂｒｏｗｎｐｌａｎｔｈｏｐｐｅｒｔｏｆｅｅｄｏｎｒｉｃｅ[Ｊ].ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙꎬ２０１７ꎬ１７３:１９２０￣１９３２. [４]㊀ＨＵＡＮＧＨＪꎬＣＵＩＪＲꎬＸＩＡＸꎬｅｔａｌ.ＳａｌｉｖａｒｙＤＮａｓｅＩＩｆｒｏｍＬａｏ￣ｄｅｌｐｈａｘｓｔｒｉａｔｅｌｌｕｓａｃｔｓａｓａｎｅｆｆｅｃｔｏｒｔｈａｔｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓｐｌａｎｔｄｅｆｅｎｃｅ[Ｊ].ＮｅｗＰｈｙｔｏｌｏｇｉｓｔꎬ２０１９ꎬ２２４(２):８６０￣８７４. [５]㊀ＦＵＪＭꎬＳＨＩＹꎬＷＡＮＧＬＨꎬｅｔａｌ.Ｐｌａｎｔｈｏｐｐｅｒ￣ｓｅｃｒｅｔｅｄｓａｌｉｖａｒｙｃａｌｍｏｄｕｌｉｎａｃｔｓａｓａｎｅｆｆｅｃｔｏｒｆｏｒｄｅｆｅｎｓｅｒｅｓｐｏｎｓｅｓｉｎｒｉｃｅ[Ｊ].ＦｒｏｎｔｉｅｒｓｉｎＰｌａｎｔＳｃｉｅｎｃｅꎬ２０２２ꎬ１３:８４１３７８.[６]㊀ＴＩＡＮＴꎬＪＩＲꎬＦＵＪＭꎬｅｔａｌ.Ａｓａｌｉｖａｒｙｃａｌｃｉｕｍ￣ｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎｆｒｏｍＬａｏｄｅｌｐｈａｘｓｔｒｉａｔｅｌｌｕｓａｃｔｓａｓａｎｅｆｆｅｃｔｏｒｔｈａｔｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓｄｅ￣ｆｅｎｓｅｉｎｒｉｃｅ[Ｊ].ＰｅｓｔＭａｎａｇｅｍｅｎｔＳｃｉｅｎｃｅꎬ２０２１ꎬ７７(５):２２７２￣２２８１.[７]㊀ＹＥＷＦꎬＹＵＨＸꎬＪＩＡＮＹＫꎬｅｔａｌ.ＡｓａｌｉｖａｒｙＥＦ￣ｈａｎｄｃａｌｃｉｕｍ￣ｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎｏｆｔｈｅｂｒｏｗｎｐｌａｎｔｈｏｐｐｅｒＮｉｌａｐａｒｖａｔａｌｕｇｅｎｓｆｕｎｃ￣ｔｉｏｎｓａｓａｎｅｆｆｅｃｔｏｒｆｏｒｄｅｆｅｎｓｅｒｅｓｐｏｎｓｅｓｉｎｒｉｃｅ[Ｊ].ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＲｅ￣ｐｏｒｔｓꎬ２０１７ꎬ７:４０４９８.[８]㊀ＪＩＲꎬＦＵＪＭꎬＳＨＩＹꎬｅｔａｌ.Ｖｉｔｅｌｌｏｇｅｎｉｎｆｒｏｍｐｌａｎｔｈｏｐｐｅｒｏｒａｌｓｅｃｒｅｔｉｏｎａｃｔｓａｓａｎｏｖｅｌｅｆｆｅｃｔｏｒｔｏｉｍｐａｉｒｐｌａｎｔｄｅｆｅｎｓｅｓ[Ｊ].ＮｅｗＰｈｙｔｏｌｏｇｉｓｔꎬ２０２１ꎬ２３２:８０２￣８１７.[９]㊀ＷＡＮＧＮꎬＺＨＡＯＰＺꎬＭＡＹＨꎬｅｔａｌ.ＡｗｈｉｔｅｆｌｙｅｆｆｅｃｔｏｒＢｓｐ９ｔａｒｇｅｔｓｈｏｓｔｉｍｍｕｎｉｔｙｒｅｇｕｌａｔｏｒＷＲＫＹ３３ｔｏｐｒｏｍｏｔｅｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ[Ｊ].ＰｈｉｌｏｓｏｐｈｉｃａｌＴｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓｏｆｔｈｅＲｏｙａｌＳｏｃｉｅｔｙＢꎬ２０１９ꎬ３７４(１７６７):２０１８０３１３[１０]ＸＵＨＸꎬＱＩＡＮＬＸꎬＷＡＮＧＸＷꎬｅｔａｌ.Ａｓａｌｉｖａｒｙｅｆｆｅｃｔｏｒｅｎａ￣ｂｌｅｓｗｈｉｔｅｆｌｙｔｏｆｅｅｄｏｎｈｏｓｔｐｌａｎｔｓｂｙｅｌｉｃｉｔｉｎｇｓａｌｉｃｙｌｉｃａｃｉｄ￣ｓｉｇｎａ￣ｌｉｎｇｐａｔｈｗａｙ[Ｊ].ＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓｏｆｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉ￣ｅｎｃｅｓꎬ２０１９ꎬ１１６(２):４９０￣４９５.[１１]ＤＵＨꎬＸＵＨＸꎬＷＡＮＧＦꎬｅｔａｌ.Ａｒｍｅｔｆｒｏｍｗｈｉｔｅｆｌｙｓａｌｉｖａａｃｔｓａｓａｎｅｆｆｅｃｔｏｒｔｏｓｕｐｐｒｅｓｓｐｌａｎｔｄｅｆｅｎｓｅｓｂｙｔａｒｇｅｔｉｎｇｔｏｂａｃｃｏｃｙｓｔａ￣ｔｉｎ[Ｊ].ＮｅｗＰｈｙｔｏｌｏｇｉｓｔꎬ２０２２ꎬ２３４(５):１８４８￣１８６２.[１２]ＨＵＡＮＧＨＪꎬＬＩＵＣＷꎬＨＵＡＮＧＸＨꎬｅｔａｌ.Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇａｎｄｆｕｎｃ￣ｔｉｏｎａｌａｎａｌｙｓｅｓｏｆＮｉｌａｐａｒｖａｔａｌｕｇｅｎｓｓａｌｉｖａｒｙｐｒｏｔｅｏｍｅ[Ｊ].ＪｏｕｒｎａｌｏｆＰｒｏｔｅｏｍｅＲｅｓｅａｒｃｈꎬ２０１６ꎬ１５:１８８３.[１３]ＳŌＧＡＷＡＫ.Ｔｈｅｒｉｃｅｂｒｏｗｎｐｌａｎｔｈｏｐｐｅｒ:ｆｅｅｄｉｎｇｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙａｎｄｈｏｓｔｐｌａｎｔｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ[Ｊ].ＡｎｎｕａｌＲｅｖｉｅｗｏｆＥｎｔｏｍｏｌｏｇｙꎬ２００３ꎬ２７(１):４９￣７３.[１４]ＨＵＡＮＧＨＪꎬＬＩＵＣＷꎬＣＡＩＹＦꎬｅｔａｌ.Ａｓａｌｉｖａｒｙｓｈｅａｔｈｐｒｏｔｅｉｎｅｓｓｅｎｔｉａｌｆｏｒｔｈｅｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｏｆｔｈｅｂｒｏｗｎｐｌａｎｔｈｏｐｐｅｒｗｉｔｈｒｉｃｅｐｌａｎｔｓ[Ｊ].ＩｎｓｅｃｔＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙꎬ２０１５ꎬ６６:７７￣８７.[１５]ＳＨＡＮＧＧＵＡＮＸＸꎬＺＨＡＮＧＪꎬＬＩＵＢＦꎬｅｔａｌ.Ａｍｕｃｉｎ￣ｌｉｋｅｐｒｏ￣ｔｅｉｎｏｆｐｌａｎｔｈｏｐｐｅｒｉｓｒｅｑｕｉｒｅｄｆｏｒｆｅｅｄｉｎｇａｎｄｉｎｄｕｃｅｓｉｍｍｕｎｉｔｙｒｅｓｐｏｎｓｅｉｎｐｌａｎｔｓ[Ｊ].ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙꎬ２０１８ꎬ１７６(１):５５２￣５６５. [１６]ＨＵＯＹꎬＺＨＡＯＪꎬＭＥＮＧＸＹꎬｅｔａｌ.Ｌａｏｄｅｌｐｈａｘｓｔｒｉａｔｅｌｌｕｓｓａｌｉｖａｍｕｃｉｎｅｎａｂｌｅｓｔｈｅｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆｓｔｙｌｅｔｓｈｅａｔｈｅｓｔｏｆａｃｉｌｉｔａｔｅｉｔｓｆｅｅｄ￣ｉｎｇａｎｄｒｉｃｅｓｔｒｉｐｅｖｉｒｕｓｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ[Ｊ].ＰｅｓｔＭａｎａｇｅｍｅｎｔＳｃｉ￣ｅｎｃｅꎬ２０２２ꎬ７８(８):３４９８￣３５０７.[１７]鞠佳菲ꎬ孙㊀洋ꎬ刘宝生ꎬ等.一种制备稻飞虱唾液鞘扫描电镜样品的方法:ＺＬ２０１８１１５１４９２０.Ｘ[Ｐ].２０２１￣０６￣０１.[１８]ＨＵＡＮＧＨＪꎬＬＵＪＢꎬＬＩＱꎬｅｔａｌ.Ｃｏｍｂｉｎｅｄｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｉｃ/ｐｒｏ￣ｔｅｏｍｉｃａｎａｌｙｓｉｓｏｆｓａｌｉｖａｒｙｇｌａｎｄａｎｄｓｅｃｒｅｔｅｄｓａｌｉｖａｉｎｔｈｒｅｅｐｌａｎ￣ｔｈｏｐｐｅｒｓｐｅｃｉｅｓ[Ｊ].ＪｏｕｒｎａｌｏｆＰｒｏｔｅｏｍｉｃｓꎬ２０１８ꎬ１７２:２５￣３５.(责任编辑:陈海霞)６３江苏农业学报㊀２０２３年第３９卷第１期。

稻米4种组分蛋白质含量的测定
1清蛋白含量测定
称取0.1 g米粉于1.5 ml离心管中，加1 ml蒸馏水，于摇床上振荡提取2h，然后在10 000 r/min条件下离心10 min，将上清液倾入10 m1刻度试管中，重复提取3次，合并提取液，加1 m10.1%考马斯亮蓝-G250比色液并定容至10 ml，然后用UV-754分光光度计于595 nm处比色。

另外配置牛血清白蛋白标准溶液作工作曲线，从工作曲线上读出清蛋
白含量。

2球蛋白含量的测定
在提取过清蛋白的米粉沉淀中加1 ml 5%氯化钠溶液以提取球蛋白，其提取及测定
过程与上述清蛋白含量测定方法相同。

3醇溶蛋白含量的测定
在提取过球蛋白的米粉沉淀中加1 ml 70%乙醇溶液，其提取及测定过程与上述清
蛋白含量测定方法相同。

4谷蛋白含量的测定
在提取过醇溶蛋白的米粉沉淀中加1 ml 0.2%氢氧化钠溶液，于摇床上振荡提取2
h，然后在12000 r/min条件下离心10 min，将上清液倾入50 ml容量瓶中，重复提取3 次，合并提取液并定容至50 ml，从定容液中吸取3 ml于10 ml刻度试管中，加1 m10.1
考马斯亮蓝-G250比色液并定容至10 ml，然后用UV-754分光光度计于595 nm处比色。

上述各供试水稻品种(系)稻米各组分蛋白质含量的测定，每样品均重复2次
结果取其平均值。