染色质免疫沉淀(ChIP)实验指南

染色质免疫沉淀技术
染色质免疫沉淀技术（ChIP）是一种常用的分子生物学实验技术，用
于研究基因表达和调控机制。

该技术利用特异性抗体识别和结合染色
质上的特定蛋白质，然后通过免疫沉淀和DNA提取等步骤分离出与目标蛋白质结合的DNA片段，从而确定该蛋白质在染色质上的结合位置和作用机制。

ChIP技术的基本步骤包括：交联、裂解、免疫沉淀、洗涤、反交联和DNA提取。

首先，通过交联剂如甲醛将细胞或组织中的染色质与蛋白质进行固定化。

然后将细胞或组织裂解并利用特定抗体选择性地捕获
目标蛋白质与其所结合的DNA片段。

接下来，通过洗涤去除非特异性结合并保留与目标蛋白质结合的DNA片段。

最后，通过反交联将DNA片段从蛋白质中释放出来，并进行PCR扩增或测序等分析。

ChIP技术可以用于研究许多生物学问题，如转录因子与DNA的结合、组蛋白修饰和染色质重塑等。

例如，可以通过ChIP技术确定某个转录因子在基因调控中的作用机制，或者确定某个组蛋白修饰对基因表达
的影响。

总之，染色质免疫沉淀技术是一种重要的分子生物学实验技术，可以
帮助我们更好地理解基因表达和调控机制。

背景：真核生物的基因组DNA以染色质的形式存在，研究蛋白质与DNA在染色质环境下的相互作用是阐明真核生物基因表达机制的基本途径。

与传统的EMSA技术相比，染色质免疫沉淀技术（CHIP）能真实完整地反映结合在DNA序列上的调控蛋白，是目前研究体内DNA与蛋白质相互作用的最佳方法。

原理：是在活细胞状态下以甲醛固定蛋白质－DNA复合物，超声将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后加入目的蛋白抗体，通过抗体沉淀靶蛋白-DNA复合物，通过洗脱的方法得到富集的靶蛋白-DNA复合物，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，通过对目的片断的纯化与检测（PCR分析），从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。

应用：1.组蛋白修饰研究 2.转录调控分析 3.药物开发研究 4.有丝分裂研究 5.DNA损伤与凋亡分析。

步骤：1）甲醛处理细胞2）收集细胞，超声破碎3）加入目的蛋白的抗体，与靶蛋白-DNA复合物相互结合4）加入ProteinA，结合抗体-靶蛋白-DNA复合物，沉淀5）对沉淀下来的复合物进行清洗，除去一些非特异性结合6）洗脱，得到富集的靶蛋白-DNA复合物7）解交联，纯化富集的DNA-片断8）PCR或基因芯片分析。

实验案例证明C/EBP与Tmub1启动子或增强子序列的结合实验背景：在IL－6诱导条件下,利用CHiP技术提取C/EBP－DNA复合物，以Tmub1基因的碱基序列设计引物，以提取的DNA为底物，进行扩增，从而证明C/EBP结合的DNA含有Tmub1基因，进一步确认C/EBP与Tmub1启动子或增强子序列的相互作用。

实验分组：分2个组进行实验普通PCR检测和WB检测（检测Tmub1蛋白表达水平，抗体嘉美生物实验室提供。

注：嘉美生物实验室提供绝大多数常用国外原装进口抗体，为实验委托者节约大量实验经费。

）第一组：A组第二组：B组转染3天后收集细胞做CHIP-PCR以及WB检测实验对照：设定的对照有1、阳性对照（系统阳性对照，Anti-RNA Polymerase II）2、INPUT对照（DNA片段在沉淀以前，收集下来的对照）3、阴性对照（非免疫IgG血清吸附，Normal Mouse IgG）细胞转染流程:略EZ-ChIP™染色质免疫共沉淀实验检测流程（Upstste Catalog # 17-371)1、Kit Description：试剂盒内含的RNA聚合酶II阳性对照抗体2、试剂盒组分：A. Provided Kit ComponentsStore at 4℃:ChIP Blocked Protein G Agarose 1.5 mlChIP Dilution Buffer, One vial containing 24 mlLow Salt Immune Complex Wash Buffer 24 mlHigh Salt Immune Complex Wash Buffer 24 mlLiCl Immune Complex Wash Buffer 24 mlTE Buffer 24 ml0.5 M EDTA 250 ul5 M NaCl 500 ulSDS Lysis Buffer 10 ml1 M Tris-HCl, pH 6.5 500 ul10X Glycine 11 ml10X PBS 24 mlStore at -20℃:Protease Inhibitor Cocktail II（蛋白酶抑制剂） 2×110 ulRNase A 600 ug of RNase A in 60 ul sterile water.Proteinase K 600 ug of Proteinase K in 60 ul 1M NaHCO3 600 ulAnti-RNA Polymerase II 25ug clone CTD4H8.Normal rat IgGStore at Room Temperature:20% SDS 242 ul of 20% SDS.Spin Filters One bag containing 22 Spin Filters with Collection TubesCollection Tubes 22 Collection Tubes.Bind Reagent A 25 ml of Bind Reagent A.Wash Reagent B 12.5 ml of Wash Reagent B.Elution Reagent C 1.5 ml of Elution Reagent C.B. 抗体及血清特异性抗体：Anti-CEBP Beta antibody [E299] (ab32358,嘉美生物提供)Normal rat IgGC. 仪器设备微量混匀器Vortex mixer,震摇器Rotating wheel/platform.计时器Timer,可调微量加样枪以及tip头，Variable volume (5-1000 ml) pipettes + tips高速离心机Microfuge,Variable temperature water bath,细胞刮子Cell scraper,Sonicator,1.5 Ml离心管Microfuge tubes,PCR管PCR tubes,D. 引物设计略4、CHIP 操作流程A. 细胞蛋白与染色质的交联及细胞裂解预先准备：1) 准备细胞，150 mm培养瓶（20ml培养液）密度为80-90%，细胞数量≥1 x 10-7个；2) 准备42 ml 1X PBS (4.2 ml 10X PBS +37.8 ml water),放入150 mm培养皿以冰块预冷；3) 取出SDS Lysis Buffer，放置至常温确保SDS溶解不析出；4) Protease Inhibitor Cocktail II恢复至室温。

染色体免疫共沉淀(chip)步骤
染色体免疫共沉淀（ChIP）是一种常用的实验技术，用于研究染色体上特定蛋白质与DNA的相互作用。

以下是染色体免疫共沉淀的基本步骤：
1. 交联：将细胞或组织与形成蛋白质-DNA复合物的交联剂（如甲醛）处理，使蛋白质与DNA之间形成致密的交联。

这一步骤有助于保持蛋白质与DNA的相互作用并固定其在细胞或组织中的位置。

2. 细胞破碎和核裂解：将交联后的细胞或组织进行破碎和核裂解，以释放细胞内的染色质。

这可以通过机械方法（如超声波处理）或化学方法（如利用细胞裂解缓冲液和蛋白酶进行破碎）完成。

3. 免疫共沉淀：在破碎的细胞或组织提取物中，加入特异性抗体，该抗体可以与目标蛋白质结合。

免疫抗体与目标蛋白质形成免疫复合物，并与形成蛋白质-DNA复合物的目标区结合。

4. 洗涤：通过一系列洗涤步骤，去除非特异性和非特定结合的蛋白质和核酸，以减少背景信号的干扰。

5. 解交联：通过加热或酶处理等方法，解除细胞或组织中的蛋白质-DNA交联，并将DNA释放出来。

6. DNA提取：通过加入DNA提取缓冲液和有机溶剂，从溶液中沉淀出DNA，并用适当的方法进行纯化和浓缩。

7. 分析：对提取的DNA进行进一步的分析，可使用PCR、测序等技术，以检测免疫共沉淀的蛋白质与目标DNA的相互作用。

这些步骤旨在允许研究人员从细胞或组织中获得特定蛋白质与DNA的结合信息，并进一步了解基因调控、表观遗传学等相关的生物学过程。

实际操作时，具体的步骤和条件可能会因实验目的和样本类型而有所不同。

因此，在进行染色体免疫共沉淀实验时，建议参考相关文献和实验室经验，以确保实验的准确性和
可重复性。

Chip步骤组织裂解：1.新鲜组织。

切成1-3 mm3小块。

2.转移组织到50ML试管里。

加入10 ml of 1X PBS.3.加甲醛至终浓度为1%。

室温下转动15—20mins。

（10ul）4.加2.5 M Glycine至终浓度为0.125 M(终止交联)。

4°C下转动10mins。

（0.5ml）5.100 g, 4°C 离心样本5mins。

6.弃上清，取沉淀。

用45 ml 冰冻1X PBS和25 ml 冰冻1X PBS各洗一次。

离心弃上清。

7.再加入2 ml 冰冻1X PBS。

匀浆机裂解组织。

1000 rpm，4°C ，离心5 min。

弃上清。

8.细胞裂解液重悬细胞。

加入蛋白酶抑制剂PMSF (10 ul per ml), aprotinin (1 ul per ml) andleupeptin (1 ul per ml).冰上孵育10-15mins9.5,000 rpm ，4°C离心5分钟。

取沉淀10.细胞核裂解液重悬细胞加入（8）中的蛋白酶抑制剂。

冰上孵育10-20mins。

11.接下来就进去超声过程了。

（接下来第一天的5）第一天1.细胞中加入1%的甲醛，8ml的培养液加入216 ul的甲醛，37度十分钟。

2.配制含有蛋白酶抑制剂的PBS 20 ml和含有蛋白酶抑制剂的SDS溶液1ml3.将细胞拿出来，迅速的移除含甲醛的培养基，加入含蛋白酶抑制剂的PBS洗两遍。

胰酶消化20秒，加入含蛋白酶抑制剂的PBS 1ml。

用细胞刮刀把细胞刮下，收集到1.5ml的离心管里面。

4.4度2000rpm离心10min，弃上清液，加入200ul含蛋白酶抑制剂的ＳＤＳ溶液。

吹打重悬细胞，冰上孵育１０分钟。

5.超声切割ＤＮＡ，总切割时间４min30sec，超声10sec,间隙10sec。

6.4度13000rpm离心10min，转移上清液到一个新的2ml的离心管，弃沉淀。

ChIP原理及实验方法ChIP（Chromatin Immunoprecipitation）是一种用于研究蛋白质与DNA相互作用的实验方法。

该方法主要用于探究转录因子与染色质的相互作用、蛋白质修饰与基因表达调控之间的关系等。

下面将详细介绍ChIP的原理和实验步骤。

ChIP的原理：ChIP的基本原理是通过特异性抗体结合到目标蛋白质上，然后通过交联、裂解、免疫沉淀和DNA提取等步骤分离出与目标蛋白质结合的DNA片段。

通过对这些DNA片段的分析，可以了解目标蛋白质在染色质上的分布情况，从而揭示蛋白质与DNA相互作用的生物学功能。

ChIP的实验步骤：1.交联：将细胞或组织与甲醛交联，使蛋白质与DNA形成稳定的结合。

2.裂解：将交联的样品进行裂解，使细胞核和染色质释放出来。

3.免疫沉淀：将特异性抗体加入裂解的样品中，使其与目标蛋白质结合。

通过免疫沉淀，可以分离出与抗体结合的蛋白质-DNA复合物。

4.洗涤：通过洗涤去除非特异性结合的蛋白质和DNA。

5.解交联：通过高温或酶解去除交联，使DNA恢复原始状态。

6.DNA提取：将解交联后的样品进行DNA提取，获取与目标蛋白质结合的DNA片段。

7.PCR扩增：使用特异性引物对提取的DNA片段进行PCR扩增，以检测目标DNA片段的存在与否。

8.数据分析：通过测定PCR产物的数量，可以推断目标蛋白质在染色质上的结合情况。

ChIP的注意事项：1.选择合适的抗体：要确保选择的抗体具有高特异性和敏感性，以避免误差和背景信号。

2.优化实验条件：包括交联时间、裂解方法、洗涤条件等，以获得清晰的信号和较低的背景噪音。

3.正负对照组：需要设置正负对照组，以验证实验结果的可靠性。

4.数据分析：可以使用定量PCR、测序等方法对ChIP的结果进行定量和定性分析。

总结：ChIP是一种用于研究蛋白质与DNA相互作用的重要实验方法。

通过ChIP，可以了解转录因子在染色质上的定位、蛋白质修饰与基因表达调控之间的关系等。

CHIP-qPCR实验步骤一、实验材料●主要试剂●主要仪器及器材二、实验步骤1. 细胞交联：a. 用1ml PBS重悬细胞；b.加28ul 37%甲醛（终浓度为1%）进行交联，室温翻转孵育10min；c.加入10×甘氨酸至终浓度为1×；室温翻转孵育5min，终止交联；d.4℃，3000g，离心3min；弃上清液；e. 用1ml预冷的1X PBS重悬细胞，用3000g，4℃，5min离心，去上清。

f．重复e步骤一遍（此步骤沉淀可冻存于-80℃）；2. 胞核制备和染色质碎裂：a. 用200ul Membrane Extraction Buffer(使用前加入2ul蛋白酶/磷酸酶抑制剂)重悬细胞；冰上静置10min；b. 4℃，3000g，离心3min；弃上清液；c. 用200ul MNase Digestion Buffer （使用前加入0.2ul DTT）重悬细胞核;d. 加入0.2ul MNase ,吹打混匀；37℃水浴30min，期间5min混匀一次；e. 加入20μL MNase Stop Solution；混匀后冰上放置5min;f. 4℃，9000g，离心5min；弃上清液；g. 用100μL of 1X IP Dilution Buffer（使用前加入1ul蛋白酶/磷酸酶抑制剂）重悬沉淀；h. 冰上超声打断5次，每次2min。

i. 4℃,9000g离心5min;转移上清到新的EP管中3. 免疫沉淀：a. 取10ul上清作为input,-20℃冻存备用；b. 取90ul上清加入410ul X IP Dilution Buffer；阳性对照组加入10ul Anti-RNA Polymerase II Antibody，IP组加入10ug目的抗体；阴性对照组加入2μL IgG 。

c. 样本管放到翻转仪4℃翻转过夜孵育；d. 震荡混匀Protein A/G磁珠，并取20ul到每个实验组中；e. 将样品置于磁力架上，静置2min进行磁性分离，弃上清；f. 加入1ml IP Wash Buffer 1，并吹打混匀；置于翻转仪上，洗涤5min；g．将样品置于磁力架上，静置2min进行磁性分离，弃上清；h. 重复步骤f~g 3次；i. 加入1ml IP Wash Buffer 2，并吹打混匀；置于翻转仪上，洗涤5min；j. 将样品置于磁力架上，静置2min进行磁性分离，弃上清；4. 洗脱：a.加入150ul 1X IP Elution Buffer重悬磁珠，37℃震荡孵育30min；b.将样品置于磁力架上，静置2min进行磁性分离，将上清转移到一个新的EP管中；c. input样本中加入150ul 1X IP Elution Buffer；d.各样本中分别加入6μL NaCl(5M) 、2μL 蛋白酶K(20mg/Ml);e. 65℃孵育2h;f. 使用DNA 纯化离心柱从样品中纯化DNA。

染色质免疫共沉淀分组（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）是一种用于研究染色质结构和功能的技术，通常用于研究特定蛋白与DNA的结合以及与转录因子相关的基因调控元件。

在进行ChIP实验时，通常会根据实验目的和需要研究的具体基因或蛋白进行分组。

以下是一个可能的ChIP分组方案，共计800字：1. 组一：研究转录因子与DNA的结合实验目的：通过ChIP分析特定转录因子与DNA的结合位点，研究转录因子在细胞内的作用机制和基因调控网络。

实验分组：（1）抗体组：使用特异性抗体针对转录因子进行免疫沉淀。

（2）对照组：使用等量未被抗体结合的DNA进行免疫沉淀作为对照。

（3）质谱分析组：对免疫沉淀后的DNA进行质谱分析，鉴定出结合转录因子的特异性DNA 序列。

2. 组二：研究组蛋白修饰与染色质结构的关系实验目的：通过ChIP分析特定组蛋白修饰与染色质结构的关系，研究基因表达的调控机制。

实验分组：（1）抗体组：使用特异性抗体针对组蛋白修饰（如H3K36me2）进行免疫沉淀。

（2）对照组：使用等量未被抗体结合的DNA进行免疫沉淀作为对照。

（3）测序分析组：对染色质免疫沉淀后解旋的DNA片段进行测序，分析染色质结构的变化。

3. 组三：研究RNA聚合酶与基因转录的关系实验目的：通过ChIP分析RNA聚合酶与基因启动子的结合，研究基因转录的起始位点。

实验分组：（1）抗体组：使用特异性抗体针对RNA聚合酶进行免疫沉淀。

（2）基因组DNA组：分析免疫沉淀后提取的DNA是否含有预期的基因启动子区域。

（3）基因表达组：在相同条件下培养细胞，分析基因表达的变化，以验证RNA聚合酶与基因转录的关系。

以上是三种可能的ChIP分组方案，可以根据实验目的和具体需求进行调整和组合。

通过ChIP 技术，我们可以深入了解基因表达调控的机制，为疾病研究和药物开发提供重要基础数据。

染色质免疫共沉淀技术原理一、前言染色质免疫共沉淀技术（ChIP）是生物学研究中常用的一种方法，它通过利用抗体特异性识别染色质上的特定蛋白质，进而从复杂的细胞核提取物中富集这些蛋白质，并对其进行鉴定和分析。

本文将详细介绍染色质免疫共沉淀技术的原理。

二、实验步骤1. 交联首先，需要对活细胞进行交联处理，以稳定染色质和蛋白质之间的相互作用。

常用的交联剂有甲醛和二氧化硅等。

2. 染色质片段化接下来，需要将交联后的细胞进行裂解，并将DNA片段化。

这可以通过超声波或者限制性内切酶等方法实现。

3. 免疫共沉淀然后，在裂解液中加入与目标蛋白特异性结合的抗体，并进行免疫共沉淀。

在共沉淀过程中，目标蛋白和与其结合的DNA片段会被富集到抗体上。

4. 分离DNA片段接下来，需要将DNA片段从抗体上分离出来。

这可以通过加入盐或者进行热处理等方法实现。

5. 鉴定和分析最后，对富集的DNA片段进行鉴定和分析。

这可以通过PCR扩增、测序或者芯片技术等方法实现，以确定目标蛋白在染色质中的作用位置和作用方式。

三、原理解析1. 抗体选择ChIP技术的核心是抗体的选择。

抗体需要特异性识别目标蛋白，并保持其活性。

通常情况下，使用多个不同来源的抗体可以提高富集效率和准确性。

2. 交联原理交联是通过甲醛或二氧化硅等化学物质与细胞核内的DNA、蛋白质发生共价结合而实现的。

交联后的染色质会更加稳定，避免了在裂解过程中DNA和蛋白质之间失去相互作用。

3. 片段化原理染色质片段化是为了将长链DNA切成适当大小的小片段，以便于后续步骤中与抗体结合并富集目标蛋白。

超声波法利用高频声波震荡使DNA分子破碎，而限制性内切酶法则利用特定的酶切割位点切割DNA分子。

4. 免疫共沉淀原理免疫共沉淀是利用抗体与目标蛋白之间的特异性结合，将目标蛋白及其相关DNA片段从裂解液中富集到抗体上。

这一步骤需要注意选择合适的抗体和免疫共沉淀条件，以提高富集效率和准确性。

5. DNA片段分离原理将DNA片段从抗体上分离出来是为了进一步进行后续鉴定和分析。