染色质免疫沉淀及其测序课件

实验染色质免疫沉淀技术（ChIP）实验操作指南全心全意就为医生服务，一心一意只为造福医生。

真核生物的基因组DNA以染色质的形式存在。

因此，研究蛋白质与DNA在染色质环境下的相互作用是阐明真核生物基因表达机制的基本途径。

染色质免疫沉淀技术（chromatin immunoprecipitation assay, CHIP）是目前最常用研究体内DNA与蛋白质相互作用的方法。

它的基本原理是在活细胞状态下固定蛋白质－DNA复合物，并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过免疫学方法沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，通过对目的片断的纯化与检测，从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。

CHIP不仅可以检测体内反式因子与DNA的动态作用，还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系。

而且，CHIP与其他方法的结合，扩大了其应用范围：CHIP与基因芯片相结合建立的CHIP-on-chip方法已广泛用于特定反式因子靶基因的高通量筛选；CHIP与体内足迹法相结合，用于寻找反式因子的体内结合位点；RNA-CHIP用于研究RNA在基因表达调控中的作用。

由此可见，随着CHIP的进一步完善，它必将会在基因表达调控研究中发挥越来越重要的作用。

实验准备实验材料：细胞样品试剂、试剂盒：甲醛、甘氨酸、PBS、SDS Lysis Buffer、洗脱液、RNaseA、蛋白酶K、omega胶回收试剂盒仪器、耗材：离心管、超声仪、电泳仪、离心机ChIP的一般流程甲醛处理细胞→ 收集细胞，超声破碎→ 加入目的蛋白的抗体，与靶蛋白-DNA复合物相互结合→ 加入ProteinA，结合抗体-靶蛋白-DNA复合物，并沉淀→ 对沉淀下来的复合物进行清洗，除去一些非特异性结合→ 洗脱，得到富集的靶蛋白-DNA复合物→ 解交联，纯化富集的DNA-片断→ PCR分析。

请ChIp具体操作流程：第一天（一）、细胞的甲醛交联与超声破碎1、取出1平皿细胞（10cm平皿），加入243 μl 37%甲醛，使得甲醛的终浓度为1%（培养基共有9ml）。

染色质免疫沉淀（ChIP）实验分析ChIP实验被用来鉴定染色质相关蛋白的定位和/或它们的翻译后修饰状态。

这种方法依赖于特异识别目的蛋白或修饰蛋白（例如组蛋白H3 Lys9甲基化）的抗体进行免疫沉淀和分析免疫共沉淀DNA。

早期实验方法依赖于使用温和的裂解条件，以保护蛋白质--DNA相互作用，但这种方法只适用于和DNA直接结合的蛋白。

甲醛交联方法的使用使得这样的分析可以扩展到与染色质关联的几乎任何蛋白。

非变性、非交联免疫沉淀实验使用直接和特定DNA结合蛋白结合的抗体从细胞中分离蛋白质--DNA复合物依赖于抽提和免疫沉淀的条件，尤其是在该条件下怎样使蛋白可溶并保持蛋白质-DNA的结合。

有几种方法已被成功使用，但是要注意到这一点，要根据蛋白质-DNA复合物所需的条件来调整实验条件。

该方法本质来说是利用低渗透压裂解细胞，分离细胞核，在低盐条件下使用核酸酶（DNaseI或微球菌核酸酶—Mnase）溶解染色质，接着使用抗体进行免疫沉淀识别目标蛋白。

使用多肽可以从免疫复合物中最先洗下蛋白质-DNA复合物，这可以减少在更严格的洗脱下来的，与DNA非特异性结合的蛋白污染。

提取的DNA可以克隆用于进一步分析、测序或用于探针阵列分析。

甲醛交联免疫沉淀实验这已成为研究染色质中动态蛋白质--DNA的强有力方法。

甲醛交联的染色质免疫沉淀的实验步骤见图二。

甲醛交联使我们能够检测到可能不直接结合DNA的蛋白质--染色质的结合。

这种交联方法产生蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA和蛋白质-RNA交联，因此适合于染色质不同成分以及瞬时关联的分析。

这也有效地被用于分析染色质翻译后修饰的存在与否。

这种方法最初在果蝇体系中是由Varshavski及其同事开发的，由Paro 修正的由两个酵母小组广泛使用和修正的。

图二该技术实验步骤适用于所有的ChIP实验，由于研究系统的不同或研究小组的偏好，在实验细节上略有不同。

此外，在新研究系统的第一次实验需要优化实验步骤。

一、染色质免疫共沉淀简介真核生物的基因组DNA以染色质的形式存在。

因此，研究蛋白质与DNA在染色质环境下的相互作用是阐明真核生物基因表达机制的基本途径。

染色质免疫沉淀技术（chromatin immunoprecipitation assay, CHIP）是目前唯一研究体内DNA与蛋白质相互作用的方法。

它的基本原理是在活细胞状态下固定蛋白质－DNA复合物，并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过免疫学方法沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，通过对目的片断的纯化与检测，从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。

CHIP不仅可以检测体内反式因子与DNA的动态作用，还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系。

而且，CHIP与其他方法的结合，扩大了其应用范围：CHIP与基因芯片相结合建立的CHIP-on-chip方法已广泛用于特定反式因子靶基因的高通量筛选；CHIP与体内足迹法相结合，用于寻找反式因子的体内结合位点；RNA-CHIP用于研究RNA在基因表达调控中的作用。

由此可见，随着CHIP的进一步完善，它必将会在基因表达调控研究中发挥越来越重要的作用。

染色质免疫共沉淀可以：（1）组蛋白修饰酶的抗体作为“生物标记”；（2）转录调控分析；（3）药物开发研究；（4）DNA损失与凋亡分析。

二、ChIP的一般流程甲醛处理细胞---收集细胞，超声破碎---加入目的蛋白的抗体，与靶蛋白-DNA复合物相互结合---加入ProteinA，结合抗体-靶蛋白-DNA复合物，并沉淀---对沉淀下来的复合物进行清洗，除去一些非特异性结合---洗脱，得到富集的靶蛋白-DNA复合物---解交联，纯化富集的DNA-片断---PCR分析。

三、PCR分析ChIP-chip技术对于大规模挖掘顺式调控信息成绩卓著，同时它可以用于胚胎干细胞和一些疾病如癌症、心血管疾病和中央神经紊乱的发生的机制。

研究人员还可以利用这项技术开发一些治疗方法。