完整的β-半乳糖苷酶 N端 C端
lacZ’
lacZ’
缺陷型大肠杆菌
2.pUC系统
蓝白斑筛选
X-gal也是β-半乳糖苷酶的 一种底物,经降解后可生成 溴氯吲哚,使大肠杆菌菌落 呈蓝色。
3.pGEM-T载体 经 Taq DNA 聚合 酶扩增后的 PCR 产物末端都带有单 个 A
六、枯草杆菌分泌表达系统
三、质粒的类型
1、抗性质粒(Resistance (R)plasmids) 2、致育因子(Fertility (F)plasmids) 3、Col质粒 4、降解质粒(degradative plasmids)
5、侵入性质粒(virulence plasmids)
四、质粒载体的改造 ①去掉不必要的DNA区域 ②减少限制性内切酶酶切位点 ③加入易于检出的选择性标记 ④关于质粒安全性的改造 ⑤改造或增加基因表达的调控序列
优点:
①非致病的土壤微生物,不像大肠杆菌那样具 有热源性脂多糖; ②遗传学特性先进,很多噬菌体和质粒适合于 用作克隆载体; ③分泌蛋白能力强,当分泌蛋白跨过细胞膜后, 就被加工和直接释放到培养基中,这使得回收 和纯化目的蛋白较为简单; ④良好的发酵基础和生产技术。枯草杆菌在 工业上长期被用于生产蛋白酶、α-淀粉酶等
常用抗生素的作用方式及抗性机理
抗生素名称
氨苄青霉素 (Amp)
作用方式
一种青霉素的衍生物,通过干扰细菌胞 壁合成之末端反应,而杀死生长细胞。
抗性机理
bla抗性基因编码的一种周质酶,即 β-内酰胺酶,可特异的切割amp的 β-内酰胺环,从而失去杀菌效力。
氯霉素(Cm) 一种抑菌剂,通过同核糖体50S亚基的结 cat抗性基因编码乙酰转移酶,特异 合作用,干扰细胞蛋白质的合成,并阻 地使氯霉素乙酰化而失活 止肽键的形成。 卡那霉素 (Kan) 一种杀菌剂,通过同70S核糖体的结合作 kan抗性基因编码氨基糖苷磷酸转移 用,导致mRNA发生错读。 酶,可对Kan进行修饰,从而阻止同 核糖体之间的相互作用。