4-氨基水杨酸对LPS诱导的RAW264.7细胞NO生成的影响

匹莫齐特对脂多糖诱导RAW264.7细胞诱导型一氧化氮合成酶表达的调控及其作用机制刘佳【期刊名称】《河南医学研究》【年(卷),期】2024(33)7【摘要】目的运用脂多糖(LPS)诱导小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞株,探究匹莫齐特(Pimozide)对一氧化氮和诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)合成的影响和作用机制。

方法用含10%胎牛血清、100 U·mL^(-1)的青链霉素DMEM培养液将RAW264.7细胞稀释为每孔2×105个接种于24孔板中进行培养,分为空白对照组(仅含DMEM培养液+RAW264.7细胞)、Pimozide组(仅含RAW264.7细胞和10μmol·L^(-1)Pimozide培养液)、LPS诱导(LPS 1 mg·L^(-1))组(LPS+RAW264.7细胞)、药物处理组[含细胞和不同浓度药物,包括Pimozide低(LPS+2.5μmol·L^(-1))、中(LPS+5μmol·L^(-1))、高(LPS+10μmol·L^(-1))组]。

各组培养上清液中一氧化氮水平测定采用Griess法进行检测。

采用实时定量聚合酶链反应(RT-PCR)法和免疫蛋白印迹法分别检测iNOS mRNA表达水平和iNOS和磷酸化的信号传导及转录激活因子通路-5的蛋白表达相对水平。

结果用含10%胎牛血清、100 U·mL^(-1)的青链霉素DMEM培养液培养RAW264.7细胞24 h 后,各组培养上清液一氧化氮表达水平差异有统计学意义(F=25.69,P<0.05);Pimozide低(LPS+2.5μmol·L^(-1))、中(LPS+5μmol·L^(-1))、高(LPS+10μmol·L^(-1))组一氧化氮释放的抑制率差异有统计学意义(F=132.49,P<0.05)。

LPS、TNF—α、IL—1β刺激RAW264.7细胞分泌NO的比较目的研究LPS、TNF-α、IL-1β刺激RAW264.7细胞分泌NO的剂量、时间依赖性关系，为建立炎症细胞模型提供实验依据。

方法以LPS（0.01、0.10、1.00、10.00 μg/mL）、TNF-α（0.10、1.00、10.00、100.00 ng/mL）或IL-1β（0.10、1.00、10.00、100.00 ng/mL）刺激RAW264.7细胞，24 h后收集细胞上清液Greiss 法测定NO的含量。

以LPS（1 μg/mL）、TNF-α（10 ng/mL）或IL-1β（10 ng/mL）分别刺激RAW264.7细胞6、12、24、48 h，收集细胞上清液Greiss法测定NO 的含量。

结果不同剂量LPS均可显著诱导RAW264.7细胞分泌大量NO，无明显的剂量依赖性，不同剂量TNF-α或IL-1β均可显著诱导RAW264.7细胞分泌NO，且有一定的剂量依赖性，LPS（1 μg/mL）或TNF-α（10 ng/mL）刺激RAW264.7细胞12～48 h时NO的分泌量显著升高，IL-1β（10 ng/mL）刺激6～48 h均可显著诱NO的分泌，均具有一定的剂量依赖性。

结论0.01～10.00 μg/mL LPS、0.10～100.00 ng/mL的TNF-α或IL-1β刺激RAW264.7细胞均可成功复制炎症细胞模型。

标签：炎症、RAW264.7细胞、LPS、TNF-α、IL-1β[Abstract] Objective To research the correlation between the LPS，TNF-α，IL-1β in stimulating NO secreted by RAW264.7 cell and time dependence and provide experimental basis for the establishment of inflammatory cell model. Methods The LPS（0.01，0.10，1.00，10.00 μg/mL），TNF-α（0.10，1.00，10.00，100.00 ng/mL）and IL-1β（0.10，1.00，10.00，100.00 ng/mL）were used to stimulate the RAW264.7 cell，after 24h，the NO content was measured by the Greiss method，and the LPS（1 μg/mL），TNF-α（10 ng/mL）or IL-1β（10 ng/mL）were used to stimulate RAW264.7 cell for 6，12，24，48 h，and the NO content was measured by collecting the cell supernatant Greiss method. Results Different doses of LPS could obviously induce the NO secreted by RAW264.7 cells without obvious dose dependency，and different doses of TNF-αor IL-1βcould cann obviously induce the NO secreted by RAW264.7 cells with a certain dose dependency，and the NO secretion volume was obviously increased after LPS （1 μg/mL）or TNF-α （10 ng/mL），and IL-1β（10 ng/mL）stimulation for 6～48 h could obviously induce the secretion of NO with a certain dose dependency. Conclusion 0.01～10.00 μg/mL LPS and 0.10～100.00 ng/mL TNF-α or IL-1β in stimulating the RAW264.7 cell can successfully duplicate inflammatory model.[Key words] Inflammation；RAW264.7 cell；LPS；TNF-α；IL-1β炎癥是多种疾病的一个重要标志特征，是机体对内外有害刺激因素做出的自我保护性反应。

doi: 10.11978/2023012 真菌Talaromyces stipitatus中具有抗炎活性oligophenalenone 二聚体朱玲, 潘超, 花思露, 姜薇扬州大学环境科学与工程学院, 江苏扬州 225127摘要: 真菌Talaromyces stipitatus的发酵产物对脂多糖诱导的RAW264.7巨噬细胞系一氧化氮(NO)生成具有抑制作用。

本实验以生物活性分析为导向, 从真菌T. stipitatus发酵产物中分离得到6个具有抗炎活性的次生代谢产物, 通过与文献比对核磁共振(nuclear magnetic resonance, NMR)和高分辨电喷雾电离质谱(high resolution electrospray ionization mass spectroscopy, HRESIMS)数据, 鉴定为oligophenalenone二聚体, 分别是bacillisporin A (1)、9a-epi-bacillisporin E (2)、bacillisporin F (3)、duclauxin (4)、bacillisporin B (5)和bacillisporin C (6)。

化合物2—5在浓度30µmol·L−1时, 显示出不同程度的NO生成抑制作用, 且对巨噬细胞无细胞毒活性, 抑制率均高于阳性对照药吲哚美辛(indomethacin, AG); 2—4的半抑制浓度(IC50)分别为11.82±1.25、11.44±1.58和23.92±2.86µmol·L−1。

首次从该种中分离得到5和6, 并首次发现duclauxin及其同系物具有显著的体外抗炎活性, 为抗炎活性研究提供了一类新的模式结构。

关键词: Talaromyces stipitatus; oligophenalenone二聚体; 抗炎活性; duclauxin同系物; 真菌中图分类号: R284 文献标识码: A 文章编号: 1009-5470(2023)06-0150-06Oligophenalenone dimers with anti-inflammatory activities from fungus Talaromyces stipitatusZHU Ling, PAN Chao, HUA Silu, JIANG WeiSchool of Environmental Science and Engineering, Yangzhou University, Yangzhou 225127, ChinaAbstract: An extract of the fungus Talaromyces stipitatus showed inhibitory activity against the nitric oxide (NO) production in the lipopolysaccharide (LPS)-activated RAW264.7 macrophage cell line, and bioassay-guided separation of the extract provided six oligophenalenone dimers, which were characterized to be bacillisporin A (1), 9a-epi-bacillisporin E (2), bacillisporin F (3), duclauxin (4), bacillisporin B (5) and bacillisporin C (6), respectively, by comparison of the nuclear magnetic resonance (NMR) and high resolution electrospray ionization mass spectroscopy (HRESIMS) data with literature data. 2-5 were noncytotoxic on macrophage cells at 30 µmol·L−1, and displayed inhibitory effects against NO production in LPS-induced RAW264.7 macrophage cells, which were all more active than the positive control indomethacin (AG). The half inhibitory concentration (IC50) values of 2-4 were 11.82±1.25, 11.44±1.58 and 23.92±2.86 µmol·L−1, respectively. 5 and 6 were isolated from T. stipitatus for the first time. Duclauxin and its homologues were firstly discovered to show significant anti-inflammatory activities in vitro, which provide a new structural model for further research of anti-inflammatory activity.Key words: Talaromyces stipitatus; oligophenalenone dimer; anti-inflammatory activity; duclauxin homologues; fungus 近年来, 从海洋真菌中发现新的海洋天然产物数量呈明显上升趋势, 到目前为止, 研究最多的是青霉属收稿日期：2023-02-03; 修订日期：2023-03-21。

lps处理时inos的含量
在生物医学研究中，LPS（脂多糖）处理通常被用来模拟细菌感染和炎症反应。

iNOS（诱导型一氧化氮合酶）是一种在细胞受到刺激（如LPS）后表达量显著增加的酶，它可以催化生成大量的一氧化氮(NO)，这种分子在免疫反应、炎症及组织损伤修复过程中起到关键作用。

实验中，在给予大鼠或细胞系LPS处理后，会通过不同的技术手段（如Western Blot、实时定量PCR等）检测iNOS蛋白及其mRNA的表达量，以评估LPS刺激对iNOS产生的影响。

具体到“LPS处理时inos的含量”，指的是在实验条件下，LPS刺激前后细胞内iNOS蛋白质或者其编码基因inos mRNA的相对或绝对含量变化。

比如在某些研究中，发现LPS可以显著上调巨噬细胞或RAW264.7细胞株中的iNOS表达，从而导致NO水平上升。

而药物干预（如洛伐他汀或其他抗氧化剂）可能能够降低由LPS引起的iNOS过度表达以及后续的·OH（羟自由基）生成、MDA（丙二醛）积累，并可能提高抗氧化防御系统中的tSOD（总超氧化物歧化酶）活性，以此减轻炎症反应和组织损伤。

高浓度LPS损伤巨噬RAW264．7线粒体功能的研究周露露;牛佳丽;陈陶陶;张宸豪;李妍【摘要】目的：研究不同浓度 LPS 对巨噬细胞线粒体功能的影响。

方法体外培养小鼠巨噬细胞RAW 264．7，不同浓度LPS（0、1、2、4、8和16μg／mL）诱导24 h后，采用流式细胞术检测线粒体功能，并分析细胞凋亡和细胞内活性氧水平。

结果低浓度的LPS促进细胞内活性氧产生，对线粒体功能无影响或具有略增强的效应；高LPS诱导下，活性氧水平较低浓度组下降，而线粒体功能受损伤、坏死和凋亡细胞比例增加。

结论高浓度LPS对RAW264．7线粒体功能有损伤作用。

%Objective To study effect of different concentration LPS on macrophages mitochondrial .Methods Mice macrophage RAW264.7 was cultured in vitro and induced by different concentration of LPS (0,1,2,4,8 and 16 μg/mL) for 24 hours.Mitochondrial function was detected by flow cytometry and cell apoptosis and active oxygen level in the cell were analyzed .Results Intracellular reactive oxygen could be promoted by low concentration of LPS and there was no or slightly effect on enhancing mitochondrial function;the level of active oxygen concentration was de-creased with high concentration of LPS and mitochondrial function was damaged ,necrosis and apoptosis cell percentage increased.Conclusion RAW264.7 mitochondrial function can be damaged by high concentration of LPS .【期刊名称】《吉林医药学院学报》【年(卷),期】2015(000)001【总页数】3页(P17-19)【关键词】脂多糖;线粒体;免疫调节【作者】周露露;牛佳丽;陈陶陶;张宸豪;李妍【作者单位】吉林医药学院 2010级药物制剂本科班，吉林吉林 132013;吉林医药学院 2010级药学本科班，吉林吉林 132013;吉林医药学院 2010级药学本科班，吉林吉林 132013;吉林医药学院检验学院，吉林吉林 132013;吉林医药学院检验学院，吉林吉林 132013【正文语种】中文【中图分类】R363巨噬细胞是哺乳动物机体内重要的免疫细胞，细菌等病原微生物感染后，巨噬细胞吞噬细菌并在细胞内产生呼吸爆发，产生一氧化氮、超氧阴离子，生成具有强氧化性的过氧化亚硝基，杀伤和裂解细菌［1］。

黑老虎为五味子科南五味子属植物[Kadsura coccinea（Lem.）A.C.Smith]的根和藤茎，别名冷饭团、绯红南五味子、过山龙腾等。

广泛分布于我国湖北、广东、广西、四川、云南、贵州等西南地区。

黑老虎为民间草药，主要用于治疗风湿骨痛、跌仆扭伤、妇女痛经、慢性胃炎等症[1]。

本课题组对黑老虎进行了化学成分研究，并考察了部分木脂素、三萜等化合物的生物活性[2-5]，为进一步研究黑老虎的抗炎活性成分，本次实验中，从黑老虎的根茎中分离得到4个倍半萜类化合物，并进行了理化鉴定和波谱分析，并且，以脂多糖（LPS）和γ干扰素（IFN-γ）诱导的单核巨噬细胞RAW264.7作为细胞炎症模型，考察化合物对一氧化氮（NO）释放的抑制作用。

1仪器与材料UV-160紫外光谱仪（岛津公司，日本）；IR A2红外光谱仪（JASCO公司，日本）；DIP-360旋光光谱仪（JASCO公司，日本）；JEOL-ECA600MHz核磁共振仪（Varian公司，美国，TMS为内标）；JEOL GC质谱仪（Varian公司，美国）；柱层析硅胶（Wako公司，日本）；薄层色谱（Merck公司，美国）；JASCO PU-2089高效液相色谱仪（JASCO公司，日本）；高效液相色谱柱（Sen-shu Scientific公司，日本）；RAW264.7细胞（ATCC公司，美国）；Ham's F12培养基（Sigma公司，美国）；胎牛血清（Gibco公司，美国）；谷氨酰胺（Sigma公司，美黑老虎中倍半萜类化合物的分离鉴定及抑制ＮＯ生成作用研究石柳柳李贺然苏州大学医学部药学院，江苏苏州215123[摘要]目的分离鉴定黑老虎中倍半萜类化合物，并考察化合物对一氧化氮（NO）释放的抑制作用。

方法采用丙酮提取，半制备高效液相色谱等方法分离化学成分，波谱方法鉴定化合物的结构；脂多糖（LPS）和γ干扰素（IFN-γ）诱导的单核巨噬细胞RAW264.7作为细胞炎症模型，考察化合物对NO释放的抑制作用。

中国卫生产业炎症是多种疾病的一个重要标志特征,是机体对内外有害刺激因素做出的自我保护性反应。

虽然炎症在一定程度上对机体是有利的,但过度或过久的炎症反应往往会加重许多疾病的发展,如自身免疫性疾病、脓毒症、癌症、动脉粥样硬化、糖尿病等[1-2]。

巨噬细胞是一类重要的免疫细胞,在机体炎症反应中发挥重要作用[3]。

小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞来源于小鼠腹腔,是可以永生化的巨噬细胞株,能够稳定进行传代培养[4]。

DOI:10.16659/ki.1672-5654.2017.14.003LPS、TNF-α、IL-1β刺激RAW264.7细胞分泌NO 的比较殷津津1,辛文妤21.山东省青岛市城阳区惜福镇街道卫生院药剂科,山东青岛266106;2.山东省滨州医学院,山东烟台264003[摘要]目的研究LPS、TNF-α、IL-1β刺激RAW264.7细胞分泌NO 的剂量、时间依赖性关系,为建立炎症细胞模型提供实验依据。

方法以LPS(0.01、0.10、1.00、10.00μg/mL)、TNF-α(0.10、1.00、10.00、100.00ng/mL)或IL-1β(0.10、1.00、10.00、100.00ng/mL)刺激RAW264.7细胞,24h 后收集细胞上清液Greiss 法测定NO 的含量。

以LPS(1μg/mL)、TNF-α(10ng/mL)或IL-1β(10ng/mL)分别刺激RAW264.7细胞6、12、24、48h,收集细胞上清液Greiss 法测定NO 的含量。

结果不同剂量LPS 均可显著诱导RAW264.7细胞分泌大量NO,无明显的剂量依赖性,不同剂量TNF-α或IL-1β均可显著诱导RAW264.7细胞分泌NO,且有一定的剂量依赖性,LPS(1μg/mL)或TNF-α(10ng/mL)刺激RAW264.7细胞12~48h 时NO 的分泌量显著升高,IL-1β(10ng/mL)刺激6~48h 均可显著诱NO 的分泌,均具有一定的剂量依赖性。

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810390167.1(22)申请日 2018.04.27(71)申请人 吉林大学地址 130012 吉林省长春市前进大街2699号(72)发明人 王依楠　刘静波　张婷　(74)专利代理机构 长春市恒誉专利代理事务所(普通合伙) 22212代理人 李荣武(51)Int.Cl.C12N 5/0786(2010.01)(54)发明名称一种LPS诱导RAW264.7细胞炎症模型的建立方法(57)摘要本发明涉及一种LPS诱导RAW264.7细胞炎症模型的建立方法，通过LPS体外处理RAW264.7细胞，LPS浓度为1-1000ng/ml，处理时间为4-24h。

本发明利用不同浓度LPS作用不同时间，通过MTS检测细胞存活率，检测细胞因子TNF-α，IL-6和IL-1β的分泌，检测NO的释放等指标，为探究LPS体外诱导RAW264.7细胞炎症与免疫之间的关系和免疫相关疾病的发生机制提供了理论基础，同时也为深入研究炎症的感染机制和开发用于炎症感染的制剂提供技术基础和理论参考。

权利要求书1页 说明书3页 附图3页CN 108486056 A 2018.09.04C N 108486056A1.一种LPS诱导RAW264.7细胞炎症模型的建立方法，其特征在于：采用LPS体外处理RAW264.7细胞，LPS浓度为1-1000ng/ml，处理时间为4-24h。

2.根据权利要求1所述的LPS诱导RAW264.7细胞炎症模型的建立方法，其特征在于：所述LPS浓度为100ng/ml，处理时间为16h。

3.根据权利要求1所述的LPS诱导RAW264.7细胞炎症模型的建立方法，其特征在于包括以下步骤：(1)设置空白组、对照组和实验组；在96孔板中空白组加入100μl培养基，实验组与对照组加入密度为5.0×104cells/ml的RAW264.7细胞，每孔90μL；在37℃，5％CO 2培养箱中孵育24h后，对照组每孔加入10μl培养基，实验组中加入10μl LPS溶液；在37℃，5％CO 2培养箱中孵育24h，每孔加20μLMTS孵育2小时，酶标仪振荡10s，在490nm处测定吸光度值；(2)设置细胞对照组和实验组，将细胞浓度调节为5×105个/ml，每孔1.8ml接种于24孔板中，对照组加入200μl细胞培养液，实验组分别加入200μl LPS溶液，在37℃，5％CO 2条件下培养24h；收集细胞上清液，用于测定炎症细胞因子的相关指标。