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龟裂链霉菌zwf2基因敲入及阻断对土霉素合成的影响廖瑜玲;刘志勇;唐振宇;郭美锦;庄英萍;张嗣良【期刊名称】《食品与药品》【年(卷),期】2009(011)001【摘要】目的考察敲入及阻断zwf2基因对6-磷酸葡糖脱氢酶(G6PDH)活性、细胞生长、土霉素合成的影响.方法构建敲入转化子M4018-(zwf2)和阻断转化子M4018-Δzwf2后,以原始菌株为对照,比较敲入转化子菌株M4018-(zwf2)和阻断转化子菌株M4018-ΔAzwf2摇瓶发酵后G6PDH活性,细胞生长、土霉素合成等生物性质的变化.结果阻断转化子菌株M4018-Δzwf2的G6PDH活性是原始菌的50%左右,敲入转化子菌株M4018-(zwf2)的G6PDH活性则略高于原始菌;阻断转化子菌株M4018-Δzwf2土霉素生物合成水平比原始菌提高27%,比敲入转化子菌株M4018-(zwf2)高约40%;发酵结束时敲入转化子菌株M4018-(zwf2)的细胞干重高于其他2株菌,其它2株菌的细胞干重差异不大.结论 zwf2阻断有利于土霉素的生物合成,zwf2增强则对细胞生长有利.【总页数】4页(P7-10)【作者】廖瑜玲;刘志勇;唐振宇;郭美锦;庄英萍;张嗣良【作者单位】江西农业大学生物工程系,江西,南昌,330045;华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室,上海,200237;华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室,上海,200237;江西农业大学生物工程系,江西,南昌,330045;华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室,上海,200237;华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室,上海,200237;华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室,上海,200237【正文语种】中文【中图分类】Q939.97【相关文献】1.透明颤菌血红蛋白基因在龟裂链霉菌中的表达及其对土霉素合成的影响 [J], 倪辉;Ali Mohsin;曹君书;张风新;郭美锦;储炬;庄英萍2.龟裂链霉菌工业菌中zwf1基因的阻断对土霉素生物合成影响 [J], 郑子静;于岚;唐振宇;郭元昕;肖慈英;郭美锦3.龟裂链霉菌zwf2基因阻断提高土霉素生物合成 [J], 刘志勇;郭美锦;钱江潮;庄英萍;张嗣良4.阿维链霉菌中aveD基因阻断对阿维菌素合成的影响 [J], 陈芝;宋渊;文莹;李季伦5.龟裂链霉菌高产土霉素菌株的诱变筛选及其发酵条件 [J], 孙金良;周坤;崔玉琦;刘磊;袁昉;杨俊青;赵宝华因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
高产土霉素菌株的诱变与筛选研究
一、预实验
实验目的：通过预实验来找出龟裂链霉菌的土霉素最低抑制量
实验原理：龟裂链霉菌在土霉素最低抑制量以后不会再生长，如果经过诱变育种后，该菌种可以在大于土霉素抑制量的土霉素浓度中可以生长，表明经诱变后的菌株是抗目的代谢产物的龟裂链霉菌，再经过复筛，挑选出高产菌株。
实验流程:根据已知的信息，一般用土霉素筛选龟裂链霉菌的土霉素量一般为400μg -2400μg，首先去购买土霉素注射液（因为土霉素注射液是无菌的，所以使用起来无需再灭菌，比较方便），如果没有土霉素注射液就用土霉素药片研碎放入生理盐水中灭菌代替。
设置土霉素梯度从400μg为起始浓度，4000μg为最高浓度，其中设梯度为600μg，则设置浓度为400μg、1000μg、1600μg、2200μg、2800μg、3400μg、4000μg。
如果第一轮实验在1600μg到2200μg之间为长与不长菌株的分界线。
下一轮的实验就在1600μg和2200μg之间设浓度梯度继续研究。
初步暂定每个梯度涂两个板，板上的菌株涂10-4的菌株，因为致死率大于百分之九十九才算抑制生长。
doi: 10.11978/2023080 海洋链霉菌Streptomyces sporoverrucosus 33510次级代谢产物研究刘颖1, 肖阳1, 朱震鑫2, 刘洪存1, 姜明国2, 朱玉章2, 林坤1, 吴金城1, 卢晓梅1, 黄小宁1, 梁海娜1, 卢文森1, 杨立芳11. 广西民族大学化学化工学院, 林产化学与工程国家民委重点实验室, 广西林产化学与工程重点实验室, 广西林产化学与工程协同创新中心, 广西高校应用分析化学重点实验室, 广西南宁 530006;2. 广西民族大学海洋与生物技术学院, 广西多糖材料与改性重点实验室, 广西南宁530008摘要: 为获得具有较好抑制植物病原菌活性的化合物, 对一株海洋链霉菌Streptomyces sporoverrucosus 33510的化学成分及活性进行了研究。
使用高效液相色谱(high performance liquid chromatography, HPLC)、半制备液相色谱(semi-pre HPLC)、柱色谱(colume chromatography, CC)、薄层色谱(thin layer chromatography, TLC)和重结晶等分析及分离技术对该菌株的发酵产物进行了分离纯化。
采用核磁共振(nuclear megnetic resonance, NMR)、质谱(mass spectra, MS)、旋光(optical rotatory dispersion, ORD)等波谱学方法对得到的化合物进行结构鉴定。
通过滤纸片法对化合物进行抑菌活性检测。
从33510菌株的发酵产物中共分离得到10个化合物, 分别为: cyclo(D-Pro-D-Leu) (1)、bisphenol A (2)、methylp-hydroxyphenylacetate (3)、N-phenethylacetamide (4)、3-indole-methylethanoate (5)、dibutyl phthalate (6)、cyclo(D-Pro-L-Leu) (7)、cyclo(D-Pro-L-Ile) (8)、cyclo(L-Pro-L-Phe) (9)和cyclo(L-Leu-L-Val) (10)。
原生质体诱变技术选育糙皮侧耳秸秆分解菌株
王谦;巩竞;杨栋慧;金黎明;王蕾
【期刊名称】《食用菌》
【年(卷),期】2009(31)1
【摘要】通过原生质体的制备,再生及紫外诱变技术对1株具有较强的秸秆降解能力的糙皮侧耳菌株金凤9301进行菌种选育工作.得到1株木质素酶、纤维索酶、半纤维素酶均高产的菌株08P217.其木质素降解率,纤维素降解率,半纤维索降解率分别为出发菌株的1.75,1.71,3.22倍.经酯酶同工酶分析表明,试验所筛选的菌株已不同程度的发生遗传物质的改变,不同于原来的出发菌株.说明采用原生质体诱变育种是获得高效秸秆分解菌株的有效方法.
【总页数】3页(P12-14)
【作者】王谦;巩竞;杨栋慧;金黎明;王蕾
【作者单位】河北大学生命科学学院食药用真菌研究所,河北保定,071002;河北大学生命科学学院食药用真菌研究所,河北保定,071002;河北大学生命科学学院食药用真菌研究所,河北保定,071002;河北大学生命科学学院食药用真菌研究所,河北保定,071002;河北大学生命科学学院食药用真菌研究所,河北保定,071002
【正文语种】中文
【中图分类】S6
【相关文献】
1.原生质体诱变技术在冬虫夏草优良菌株选育中的应用 [J], 马少丽
2.原生质体诱变技术选育糙皮侧耳秸秆分解菌株 [J], 王谦;巩竞;金黎明;杨栋慧;王蕾
3.原生质体紫外诱变技术选育烟酰胺高产菌株 [J], 李红梅
4.原生质体紫外诱变技术选育1,3-丙二醇高产菌株 [J], 卢圣国;熊骏;祝扬扬;郭凡财;孟庆雄
5.利用多功能等离子体诱变技术选育糙皮侧耳新菌株 [J], 寇博翔;杨嘉雪;杨林英;霍巧丽;高珊;王谦
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紫外诱变球毛壳霉原生质体选育木聚糖酶高产菌株杨健;姚笛;王颖;张丽媛;钱丽丽【期刊名称】《中国食品添加剂》【年(卷),期】2012(000)006【摘要】[目的]对球毛壳霉原生质体进行紫外诱变处理筛选出一株高产木聚糖酶菌株.[方法]实验在不同条件下制备球毛壳霉(Chaetomium globosum AS3.3601)原生质体,分析不同酶浓度、酶解温度和时间对原生质体生成率和再生率的影响,利用单因素实验确定了紫外线诱变剂量,经初筛和复筛后,DNS法测定木聚糖酶活性.[结果]结果表明:结合原生质体的生成率和再生率确定其最佳制备条件为酶浓度1.5％,酶解温度30℃,酶解时间4h,在紫外照射时间60s下处理过的原生质体,木聚糖酶活性可达到9980IU/mL.[结论]获得的诱变菌株YZ-8比原始菌株提高了92.6％,此菌株经多次传代,遗传性能稳定.【总页数】5页(P93-97)【作者】杨健;姚笛;王颖;张丽媛;钱丽丽【作者单位】黑龙江八一农垦大学食品学院,大庆163319;黑龙江八一农垦大学食品学院,大庆163319;黑龙江八一农垦大学食品学院,大庆163319;黑龙江八一农垦大学食品学院,大庆163319;黑龙江八一农垦大学食品学院,大庆163319【正文语种】中文【中图分类】TS201.2+5【相关文献】1.原生质体紫外诱变选育木聚糖酶高产菌株 [J], 张新峰;张华山;王伟平;陈维;阳飞2.紫外诱变球毛壳霉选育木聚糖酶高产菌株 [J], 杨健;姚色笛;王颖;王月;张丽媛3.紫外诱变原生质体选育碱性蛋白酶高产菌株的研究Ⅲ.诱变株的选育及其产酶条件的研究 [J],4.紫外线诱变原生质体己酸高产菌株的选育(Ⅱ)——原生质体的制备、诱变及选育己酸高产菌株 [J], 张国政;杨志岩;路福平;杜连祥5.原生质体紫外诱变选育白地霉GXU08脂肪酶高产菌株 [J], 谭珍连;梁静娟;庞宗文;覃晓娟因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
文章编号:1001-8689(2000)04-0260-03龟裂链霉菌原生质体诱变与筛选研究郭美锦 涂国全 曹秀香(江西农业大学生物技术研究开发中心, 南昌330045) 摘要: 采用定向推理筛选方法对龟裂链霉菌原生质体进行诱变筛选得到346#菌株,其复筛时比对照产量高7%,而在60吨大罐上连续发酵9批,发酵指数比对照高了13%。
关键词: 龟裂链霉菌; 原生质体; 定向推理诱变; 土霉素中图分类号: Q 933 文献标识码:A收稿日期:1999-07-22作者简介:郭美锦:男,生于1969年,华东理工大学在读博士生,助理研究员。
经典的诱变育种是菌种选育的基础方法,但其具有盲目性和随机性。
利用推理选育,可定向地选出某些类型的突变株,从而筛选出高产菌株。
袁丽蓉[1]、范铭琦等[2]用这种方法选育菌种取得了较好的效果。
龟裂链霉菌发酵生产土霉素时,土霉素分泌到菌丝体外,当发酵液中土霉素达到一定浓度后因菌丝体自我调控而使效价难以提高,为此,采用诱变剂通过筛选耐高浓度的土霉素的菌株作为解除选育终产物的抑制的定向推理,获得了高产菌株346#,现报道该研究结果。
1 材料与方法1.1 材料1.1.1 供试菌 S trep tomy ces r imosus (16-5#)由江西洪城制药厂提供。
1.1.2 培养基 S 生长培养基[3];R 5再生培养基[3]。
斜面麸皮培养基(%):麸皮7.5,琼脂2.2。
初筛摇瓶培养基(%):玉米淀粉7,酵母粉3,黄豆粉6,CaCO 31.4,NaCl 0.4,KH 2PO 40.15。
分离培养基、复筛摇瓶培养基及大罐发酵试验培养基与生产厂相同。
1.1.3 溶液 pH 6.0,磷酸缓冲液;P 溶液[4],NTG 诱变液[5]。
1.1.4 试剂及有关药品 T ES:M erck 公司产品(批号140F 265495);NTG :Ox oid 公司;溶菌酶:Sig ma 公司生产(进口分装);土霉素标品(OT C):卫生部药品司提供;硫酸链霉素(SM ):上海市第四制药厂生产(批号960630-2);硫酸卡那霉素(KM ):湖南岳阳制药二厂生产(批号950624);甘氨酸(Glycine )(B .R 级):中国科学院上海生化所生产(批号960826)。
1.2 方法1.2.1 龟裂链霉菌原生质体制备方法[6]1.2.2 原生质体NT G 诱变和抗药性突变株检测 将制备好的16-5#菌株原生质体5ml 置于含有NTG (2m g/L )的5m l P 溶液的100ml 三角瓶中,30℃,220r/min 摇瓶机上诱变处理30min,诱变原生质体液经P 液适当稀释,各吸0.1ml 原生质体诱变稀释液分别涂布于含有致死浓度抗生素的R5再生培养基上,34℃培养5～7d,分别计算再生菌落数。
同时各吸0.1ml 未诱变处理的原生质体稀释液分别涂布在未含药物的R 5再生培养基上和分别含OTC 、LiCl 和KM 的R5再生培养基上以分别作为CK 1,CK 2,CK 3和CK 4。
1.2.3 自然分离选育方法[7]1.2.4 筛选方法 初筛为一级摇瓶筛选,复筛为二级摇瓶筛选。
1.2.5 代谢试验方法 复筛方法,每隔12h 取二瓶发酵液测定其总糖、氨基氮、溶磷、pH 、效价。
1.2.6 大罐试验方法 采用三级发酵法。
1.2.7 测定方法 初筛化学效价为改良法即反应体系中0.27m ol/L HCl 为4.9ml,吸样0.1ml,加显色液0.5%FeCl 35ml 混匀,在室温下反应20m in 后于波长500nm 比色。
复筛化学效价为化学比色法。
总糖 斐林氏法;N H +4-N 甲醛滴定法;溶磷 钼兰比色法;组分测定HPLC 法。
2 结果与讨论2.1 16-5#菌株原生质体诱变和抗药性突变株检测16-5#菌株原生质体的诱变和抗药性突变株的检测结果见表1。
16-5#原生质体经NT G 处理后分别在OT C (2500m g/L ),LiCl (6000mg /L),OT C (2500mg /L )+LiCl (6000m g /L )和KM (120mg /L )平板上抗药突变率依次为0.008%、0.0011%、0.00033%和・260・中国抗生素杂志2000年8月第25卷第4期 表1 N T G诱变16-5#原生质体诱变效果试验处理药物浓度(mg/L)再生菌落数(个/ml)抗药突变率(%) 未经NTG处C K1 6.3×1060 理原生质体C K200(OTC2500)C K300(LiCl6000)C K400(KM120) NT G处理原OT C(2500)510.0008 生质体LiCl(6000)690.0011OT C(2500)+210.00033LiCl(6000)KM(120)420.00060.0006%。
2.2 高产菌株摇瓶筛选结果2.2.1 16-5#菌株原生质体诱变突变株初筛结果 以对照菌株平均产量为100%,初筛分析统计结果见表2。
16-5#原生质体对OTC、LiCl、LiCl+OTC、KM抗药性突变株其产抗生素能力正突变频率较大(80%以上),根据初筛结果相对产量在120%以上作为初筛入选标准。
2.2.2 高产菌株的摇瓶复筛结果 初筛入选菌株进行二级摇瓶复筛,试验结果进行方差分析(见表3)可知:各菌株之间与对照相比差异显著。
筛选得到P165-48、P165-OT C-13、P165-KM-10、NT GO-84菌株分别 表2 16-5#菌株原生质体不同诱变剂处理抗药性突变株摇瓶初筛统计结果相对产量组距90%以下90%～100%100%～110%110%～120%120%～130%130%～140%140%以上总计平均产量(X)标准方差(S)16-5#自然分离菌株数 6 26 42 74100.010.42分布频率8.1135.1456.75原生质体再生菌株数 4 8 18 1812 60129.911.74分布频率 6.6713.3330 3020 100P165-OT C菌株数 2 0 2 12 248 48131.511.32分布频率 4.170 4.1725 5016.7100P165-LiCl菌株数 4 2 6 18 8 84 50116.919.92分布频率8 4 12 36 16 168 100P165-OT C-LiCl菌株数 2 4 6 12 630120.911.16分布频率 6.6713.3320 40 20100P KM菌株数 2 2 6 8 66 30127.918.15分布频率 6.66 6.6720 26.672020 100总计菌株数 10 34 58 40 58 6230 292 表3 高产菌株摇瓶产量方差分析表变异来源自由度DF平方和S S均方M S F值F.05(13,28)F.01(13,28)处理134********.654.49** 2.09 2.85误差281861 66.5总和4148942比对照的产抗生素水平提高了19%、19%、17%和16%(数据未列)。
2.2.3 高产菌株稳定性试验和产量分布参数评价 根据刘垂于研究文献[8]认为优良的生产菌株应具有高产、稳产、不易蜕变的特征,用产势A=x(Ct/6)(1/6)(1 +Cs/8)(1/2)的数值来评价生产菌株,产势A愈大,菌株愈优。
由表4参数分析可知:P165-OXY-13,P165-KM-10和P165-OTC-83个高产菌株自然分离菌株的产势A值分别比对照16-5#菌株提高了29.72%、26.1%和19.98%,说明这3个菌株均具有比对照菌株更高的产抗生素潜力。
通过诱变突变菌株产势参数分析,以比对照提高15%为入选标准,从P165-OTC-8的自然分离株中进行复筛得到346#菌株,3次复筛平均摇瓶产量分别比・261・龟裂链霉菌原生质体诱变与筛选研究 郭美锦等 表4 高产菌株产势参数分析菌株 参数 N TGO-8P165-OXY-13P165-KM -1016-5(C k)n 67 48 89 37 x 99.0798.77101.37100 S 7.00 5.44 5.7910.27Ct 14.1418.1817.52 9.61Cs -0.38 0.31-0.46-2.13A111.54121.28117.6691.56X:相对产量的平均值;S:相对产量的标准差;Ct:产量分布的稳度(X/S );Cs :产量的偏度 (Xi-X -i)3/n/S 3;产势A =x (Ct/6)(1/6)(1+Cs/8)(1/2)对照提高了8.1%、7.3%和7.0%,因此,346#菌株比较稳定,且产量比对照平均提高了7%。
2.3 346#菌株传代试验结果346#连续六代摇瓶发酵各代产量经方差分析它们之间无显著差异,说明346#菌株有较稳定的产抗生素遗传特性。
但从试验结果看,346#一至三代产量明显高于四、五、六代菌种,因此最好用前三代菌种进行发酵。
2.4 高产菌株摇瓶发酵代谢试验结果从346#和16-5#代谢曲线看,346#起步产量比对照低3.62%,这可能主要是其糖代谢速率较慢造成的,30h 后糖耗加快,效价同时提高加快,最终放瓶产量比对照高7%左右。
2.5 346#菌株大罐发酵结果346#菌株大罐试验连续发酵9罐批(以16-5#为对照发酵),其平均放罐总亿和发酵指数比16-5#平均放罐总亿和平均发酵指数均提高了13%以上。
按1993年英国药典HPLC 条件,以甲醇为流动相测定试验产品,对照产品和OT C 标品组分,其主要组分完全一致。
3 结论与讨论通过对16-5#菌株的原生质体进行强诱变剂诱变和复合诱变处理得到了高产抗生素的346#菌株,其连续9批60T 大罐发酵指数比对照提高了13%。
抗生素产生菌的抗性基因与抗生素合成的结构基因和调控基因紧密连锁,当抗药性基因发生突变时,其抗生素合成的相关基因也相应发生突变。
因此,这种抗药性突变标记的推理性筛选土霉素高产菌株效率高且行之有效。
致谢:本试验得到本研究室叶亚建高级实验师,龚霞实习研究员和张宝实习研究员的有益帮助。
在大罐发酵期间得到江西洪城制药厂刘琪厂长和李本堂总工的大力帮助,特此向他们表示衷心的感谢。
同时,本文得到华东理工大学生物化工研究所储炬博士的指正,特此谢忱!参考文献[1]袁丽容,吴立奋,潘家林,等.头孢霉素C 产生菌顶头孢霉理性化筛选研究[J].中国抗生素杂志,1988;13(4):262[2]范铭琦,赵敏,卜华祥,等.庆大霉素C 1a 高产菌株的推理育种研究[J ].中国抗生素杂志,1998;23(6):410[3]Hopw oo d D A ,Wr ig ht H M.F actor s affecting recom bi-nant fr equency in pr oto plast fusion of S tr ep tomy ces coeli -color [J].J G en M icro biol,1979;111:137[4]Okanishi M ,Suzuki K ,Elander P .Fo rmation and r ever -sion of Str eptomy cete Pr oto plasts:cultural conditio ns and mor pho lo gica l study [J].J Gen M icr obio l,1974;80:389[5]罗鹏主编.遗传学应用[M ].北京:高等教育出版社1994:231[6]郭美锦,涂国全.龟裂链霉菌原生质体制备与再生条件研究[J].江西农业大学学报,1999;20(3):233[7]吴松刚,等主编.工业微生物育种学[J ].福州:福建科学技术出版社,1988:278[8]刘垂于.微生物菌株的参数分析[J].微生物学报,1980;20(2):166Studies on mutation and selection of protoplastsfrom Strep tom yces rimosusGuo M ei -jin , Tu Guo -quan and Cao Xiu -x iang(Resear ch &Development Center fo r Bio techno lo gy ,Jiangx i Ag ricultur al U niv er sity , N anchang 330045)ABSTRACT Strain 346#w as obtained from S .rimosus pro to plast mutants by the tar get -directed r ationalselection.Its yield is 7%higher than CK'in the re-selection ex periment,whereas its ferm entation index of con-tinuous nine batches in 60T fer mentor has been incr eased by 13%.KEY WORDS Strep tomy ces r imosus ; Pro to plast ; T arge -directed ratio nal mutation ; Ox ytetr acycline・262・中国抗生素杂志2000年8月第25卷第4期。
