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福建农林大学学报（自然科学版）Journal o f Fujian Agriculture and Forestr^^ University (Natural Science Edition)第46卷第4期2017年7月三明野生蕉和天宝蕉对Foe TR4侵染早期应答的差异程春振，马文昇，刘炜麵，张梓浩，齐全，孙雪丽，张永艳，赖钟雄(福建农林大学园艺植物生物工程研究所，福建福州350002)摘要：以G F P标记的香蕉枯萎病菌f〇c T R4作为病原菌，比较了水培条件下f〇c T R4对“天宝蕉”和三明野生蕉的早期侵 染情况.研究表明，f〇CT R4在“天宝蕉”韧皮部的定殖明显早于三明野生蕉.枯萎病菌感染香蕉后会诱发香蕉细胞内活性氧 爆发和激活寄主抗氧化系统.通过研究水培和土培条件下两种香蕉种质接种枯萎病菌后根系超氧化物歧化酶（S O D)变化情 况，发现三明野生蕉根系S O D活性髙于“天宝蕉”，三明野生蕉感染枯萎病后根系S O D活性增强，而“天宝蕉”根系S O D活 性下降，说明三明野生蕉的耐枯萎病能力可能与其根系较髙和早期上调的S O D活性有关.关键词：香蕉；枯萎病；绿色荧光蛋白；超氧化物歧化酶；早期应答中图分类号：S668.1;S436.68 文献标识码：A文章编号：1671-5470(2017)04-0397-05DOI:10.13323/ki.j.fafu( nat.sci.).2017.04.006Comparisons of early responses of ‘ Tianbaojiao ’ banana andSanming wild banana to Foe TR4 infectionC H E N G Chunzhen，M A W e n s h e n g，LIU W e i h u a，Z H A N G Zihao，QI Q u a n，S U N Xueli，Z H A N G Y o n g y a n，LAI Zhongxiong(Institute o f Horticultural Biotechnology，Fujian Agriculture and Forestry University，Fuzhou，Fujian 350002，China) Abstract：GFP-labeled Foe TR4 was used t o infect Sanming wild banana and ‘Tianbaojiao5banana，and i t s colonization was evaluated by spore and root development under laser scanning confocal microscope and superoxide dismutase (SOD) analysis o f r o o t. Colonization was f i r s t detected in the root phloem o f ‘Tianbaojiao5 banana. Higher S O D activity was found in Sanming wild banana. And opposite changing patterns of S O D activity were found between 2 banana ger^nplasms，with up-regulation being in Sanming wild banana and down-regulation in ‘Tianbaojiao banana5. I t could be concluded that the higher and up-regulated S O D activity in the early infection stage i s attributed t o Fusarium wilt tolerance of Sanming wild banana.Key words： banana； fusarium wilt； green fluorescent protein； superoxide dismutase； early response香蕉(M腫spp.)是全球重要的经济作物，是仅次于柑橘的第二大水果，同时也是仅次于水稻、小麦和 玉米的第四大粮食作物[1].我国是香蕉的重要原产地，种植面积达41.3x l04h m2,年产1 000多万吨，是世 界上第二大香蕉生产国[2].香蕉产业已成为我国华南地区重要的农业支柱产业，然而近年来香蕉正遭受香 蕉枯萎病的严重危害[3].Molina[4]研究表明，香蕉枯萎病是世界农业史上记载的分布最广、最具毁灭性的 植物病害，是香蕉产业最大的威胁.目前该病害已发生在全球几乎所有的香蕉产区，并有迅速蔓延的趋势.香蕉枯萎病是由尖孢镰刀菌古巴专化型（F^sa^wrn oxyporam f.sp.e W m s e，F o e)引起的土传真菌病害.该病原菌根据寄主范围，可分为1号（Foe race 1)，2号（Foe race 2)和4号（Foe race 4)生理小种•其中，4 号小种根据其温度适应性的不同又可分为亚热带4号小种（Subtropical race4，Foe S T R4)和热带4号小种 (Tropical race4，Foe T R4).Foe T R4的致病寄主范围最广，致病能力也最强.国际香蕉和大蕉改良网络组 织主席Emile Frison于2003年甚至发出警告:香蕉可能会因为Foe T R4的危害在十年内灭绝！2013年，以香蕉作为粮食作物的非洲首次发现了 Foe T R4,引起了国际上的强烈关注[3].收稿日期:2016-11-13 修回日期:2016-12-30基金项目：国家自然科学基金项目（31601713);福建省中青年教师教育科研项目（JAT160166);福建农林大学A类人才科研启动基金(61201400707);福建省省级扶贫重点县科技人员专项计划（K15160001A);福建农林大学博士后启动基金（ 13230097).作者简介：程春振（ 1986-),男，讲师.研究方向：园艺植物生物技术.Email:ld0532dieng@ .通讯作者赖钟雄（ 1966-),男，研究员.研究 方向：园艺植物生物技术.Email:Laizx01@ .• 398 •福建农林大学学报（自然科学版)第46卷F〇c进入土壤后，在没有香蕉寄主的情况下仍可生存长达30年之久，使得香蕉枯萎病的防治难度极 大[5,6].目前，香蕉枯萎病的防治办法主要有化学防治、农业防治、生物防治等.尽管做了很多探索,到目前 为止仍未找到有效的化学试剂和农业、生物防治方法[7].抗病品种的选育是应对香蕉枯萎病的最根本、最 有效、最持久的方法[8].栽培香蕉抗性较差，野生蕉在长期自然进化过程中保留了大量优良基因，在抗病、抗寒和抗逆等方面均表现出良好特性,为香蕉育种提供了重要的遗传资源[9,10].因此，有学者提出可以在 栽培蕉选育中适当引入野生蕉基因（主要是B基因组基因）进而提高香蕉抗逆能力.福建野生蕉资源丰富，已有研究表明，三明野生蕉在自然条件下很少出现枯萎病染病症状，枯萎病检 出率也很低,说明其可能是研究野生蕉抗/耐枯萎病机理的理想材料.本研究拟以三明野生蕉和福建地区 大量种植的“天宝蕉”为材料，比较分析枯萎病菌在二者根系中的定殖情况.枯萎病菌感染香蕉后会诱发香 蕉细胞内活性氧爆发，活性氧的清除需要抗氧化活性物质的参与，因此香蕉感染枯萎病后细胞抗氧化物质 活性可作为研究香蕉-枯萎病菌互作机制的重要指标[7，11].超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，S O D)是 普遍存在于植物中的一类抗氧化活性物质，有研究指出S O D活性越高，植物的抗逆性越强，发病程度越 低[12，13].因此进一步研究了三明野生蕉和“天宝蕉”感染枯萎病后根系S O D活性的变化情况，以期为揭示 野生蕉抗/耐病机理奠定基础.1材料与方法1.1试验材料本试验所用“天宝蕉”和三明野生蕉组培苗均由福建农林大学园艺植物生物工程研究所提供,组培苗 经生根炼苗后移栽至基质中.待香蕉苗长至四叶一心时将其分成2组，一组培养于改良Hoagland培养液 中，另一组继续种植于基质中，水培1周后用于枯萎病菌侵染.接种所用G F P标记的F〇c T R4病原菌由福 建农林大学植物保护学院云英子老师提供.1.2枯萎病菌孢子悬浮液的制备及孢子萌发情况观察取出-20丈保存于斜面培养基的G F P标记的F〇c T R4,室温复苏1〜2 h.取边缘菌丝接种于P D A培养 基中部，于28丈生化培养箱中倒置培养1周后用无菌水洗下菌体，经6层无菌纱布过滤，获得枯萎病菌孢 子悬浮液.为确保孢子活性，将部分孢子悬浮液4 000 r •mi n-1离心5 m i n，用液体P D A培养基重悬孢子.在28 T! ,150 r •mi n-1的摇床中培养.每隔4 h取1m L菌液于激光共聚焦显微镜（O l y m p u s，型号:F V1200)下观 察孢子活性及萌发能力,具体步骤参照Li et al[l4]的方法.1.3枯萎病菌侵染试验在光学显微镜下,用细胞计数器计算孢子浓度.分别向培养液和基质中倒入终浓度为5X106个•m L-1的孢子悬浮液.分别于接种病原菌后0、5、10、20和25 h取水培的“天宝蕉”和三明野生蕉根系，用无菌水 冲洗根系,然后置于激光共聚焦显微镜（O l y m p u s，型号:F V1200)下观察侵染情况.1.4 SOD活性测定接种病原菌后0、5、10、20和25 h分别取水培和土培的“天宝蕉”和三明野生蕉根系，用于S O D活性测定,具体步骤参照邓贵明的方法[7].2结果与分析2.1枯萎病菌孢子活力及萌发情况为观察早期香蕉枯萎病菌孢子的萌发情况，在制备好孢子悬浮液后0、4、8、12 h进行取样，并在激光 共聚焦显微镜下进行观察,4个不同时段孢子的形态结构如图1所示.在0 h时,孢子成圆球形，G F P荧光 较强,说明孢子活力较好;4 h时，孢子伸长，说明此时孢子已经开始萌发;8 h时，已经可以观察到较为细 长的菌丝;12 h时,在荧光共聚焦显微镜下可以观察到完整的菌丝体.通过G F P荧光的观察，说明实验室 保存的G F P标记的F〇c T R4菌株活性较高，可用于后续枯萎病菌接种试验.第4期 程春振等:三明野生蕉和天宝蕉对TR4侵染早期应答的差异 • 399 •A-D分别为在P D A液体培养基中培养了0(A)、4(B)、8(C)和12 h(D)的GFP标记的F〇c TR4孢子.图1孢子萌发及发育情况观察F i g.1S p o r e g e r m i n a t i o n and development2.2枯萎病菌侵染情况在激光共聚焦显微镜下观察香蕉枯萎病菌侵染香蕉材料过程.如图2所示，0 h时“天宝蕉”和三明野 生蕉根上均没有发现绿色荧光;5 h时“天宝蕉”和三明野生蕉根表皮层开始观察到G F P，说明已有孢子开 始附着于根部;10 h时，可以观察到有枯萎病菌入侵到“天宝蕉”根系维管束，且枯萎病菌萌发管进一步延 伸，而此时三明野生蕉根系中并没有发现枯萎病菌入侵到维管束的情况;20 h时，在“天宝蕉”根系维管束 内发现了伸长的枯萎病菌菌丝，而此时，在三明野生蕉中仅发现菌丝附着于根表皮附近;25 h时，“天宝 蕉”根系维管束内部发现了大量G F P标记的枯萎病菌菌丝，在三明野生蕉根系维管束中也开始发现枯萎 病菌定殖，但三明野生蕉维管束中发现的枯萎病菌菌丝明显短于“天宝蕉”中发现的菌丝，说明三明野生 蕉根系可能是通过分泌一些抗菌物质进而阻止枯萎病菌的入侵和抑制枯萎病菌的生长.图2枯萎病菌在“天宝蕉”（上图）和三明野生蕉（下图）根系中的侵染情况F i g.2 Root i n f e c t i o n o f ‘T i a n b a o j i a o’(upper) and Sanming w i l d banana (l o w e r) by Foe TR4• 400 •福建农林大学学报（自然科学版)第46卷150 -------------------1------------------1-------------------1---------------------'0 5 10 20 25时间/h图3水培和土培“天宝蕉”（A 和B )及三明野生蕉（C 和D )接种枯萎病菌后根系S O D 活性变化情况Fig.3 Changes in SOD activity in the roots of hydroponic and soil cultured ‘Tianbaojiao’banana (A & B) and Sanming wild banana ( C & D)3讨论耐病性是植物与其病原生物在长期的互作过程中协同进化、相互选择、相互适应的结果[5，15].植物抗 病、耐病生理生化机制复杂，防御酶在这个过程中发挥着重要的作用.病原侵入植物体后，植物会产生化学 物质，如超氧阴离子自由基、过氧化氢等来抵御病原的入侵，而这些物质的产生又会对植物细胞造成危 害[16_18].这时候植物就会提高相应清除这些有害物质的防御酶（如S O D 等）活性，使植物体免受毒害或减 轻伤害.因而，正常植株酶活性的高低、侵染后植株防御酶的活性变化可作为耐病品种筛选的指标之一[19].本试验中敏感品种“天宝蕉”在水培和土培条件下S O D 活性都是缓慢下降;而三明野生蕉S O D 活性 都是先下降后上升.说明三明野生蕉能更好地清除体内由枯萎病菌入侵产生的活性氧，减轻植株受到的毒 害[20].另外，本研究还发现:在水培条件下，枯萎病菌入侵三明野生蕉维管束的速率要慢于“天宝蕉”，且入 侵后菌丝的生长、伸长情况弱于“天宝蕉”，这说明三明野生蕉根系启动了抗逆防御机制，在病原菌侵染早 期便表现出了更强的抗病性.这种抗病性能力可能与其根系中较高的S O D 活性有关.参考文献[1] M O F F A T A S . Crop engineering goes south[J]. Science ，1999，285,5426：370.[2] 陆英.香蕉枯萎病抗性基因克隆及与抗性相关的差异蛋白分析[D ].广州:华南农业大学，2012.[3] GARCfA-BASTIDAS F ，O R D O N E Z N ，K O N K O L J ，et a l . First report of f . sp. c M e 似e tropical race 4 associated with Panama disease of banana outside Southeast Asia[J]. Plant Disease ，2014，98(5) :694-694.[4] M O L I N A A B. Banana fusarium wilt management ： towards sustainable cultivation ： proceedings of the international workshop onthe banana fusarium wilt disease ： Genting Highlands Resort ，Malaysia ，18-20 October 1999[M]. INIBAP ，2001.[5] LI C ，S H A O J ，W A N G Y ，et a l . Analysis of banana transcriptome and global gene expression profiles in banana roots in response to infection by race 1 and tropical race 4 of Fusarium oxysporum f . sp. cubense[ J ]. 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A draft Musa balbisiana genome sequence for molecular geneticsin polyploid, inter- and intra-specific Musa hybrids[J]. B M C Genomics, 2013,14(1) ：683.[11]杨舒贻，陈晓阳，惠文凯，等.逆境胁迫下植物抗氧化酶系统响应研究进展[J].福建农林大学学报（自然科学版），2016,45(5) ：481-489.[12]于威，郝天龙.几种防御性酶在植物抗病方面的研究进展[J].北京农业，2014,36:133-134.[13]曾永三，王振中.活性氧和超氧化物歧化酶在植物抗病反应中的作用[J].仲恺农业技术学院学报，1999,12(4):55-63.[14] LI C, C H E N S, Z U O C, et a l. The use of GFP-transfor^ned isolates t o study infection o f banana with Fusarium oxysporum f.sp. cubense race 4[J]. European Journal o f Plant Pathology, 2011,131(2) ：327-340.[15] LI C, D E N G G, Y A N G J, et a l. Transcriptome profiling o f resistant and susceptible Cavendish banana roots following inoculation with Fusarium oxysporum f. sp. cubense tropical race 4[J]. 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几个香蕉品种对枯萎病的抗性与主要性状比较黄素梅;韦绍龙;龙盛风;田丹丹;覃柳燕;韦弟;李朝生;韦华芳;李小泉【期刊名称】《中国南方果树》【年(卷),期】2014(43)5【摘要】通过盆栽接种香蕉枯萎病菌(Foc.4)、病穴及病区种植筛选对GK1等不同香蕉品种进行抗性评价。
结果表明,供试品种中,盆栽GK1对香蕉枯萎病的抗耐性最强,GK2次之,桂蕉6号最弱。
接种27天时,GK1病情指数仅为9,远低于GK2和桂蕉6号。
病穴种植、病区种植发现,GK1的发病率分别比目前的主栽品种桂蕉6号、巴西蕉等低46.8个百分点和43.65个百分点,表现出较强的抗耐病能力。
GK1在果实性状、单株产量及果实品质等方面与主栽品种(桂蕉6号、巴西蕉)差别不大。
【总页数】5页(P74-77)【关键词】香蕉;枯萎病;抗性;GK1【作者】黄素梅;韦绍龙;龙盛风;田丹丹;覃柳燕;韦弟;李朝生;韦华芳;李小泉【作者单位】广西农业科学院生物技术研究所;广西作物遗传改良生物技术重点开放实验室【正文语种】中文【中图分类】S668.1;S436.68【相关文献】1.广西香蕉枯萎病4号生理小种发生情况及香蕉品种抗性鉴定 [J], 黄穗萍;莫贱友;郭堂勋;李其利;潘朝勃;2.4个抗枯萎病香蕉品种在广西的抗性及主要性状比较 [J], 李小泉;苏祖祥;韦莉萍;石云平;林茜;许娟;胡一凤;桂杰;韦绍龙3.4个抗枯萎病香蕉品种果实性状和品质比较 [J], 何勤勤;黄新敏;赖丽娴;钟声;陈广全;冯声海;韩寒冰4.香蕉枯萎病菌对不同抗性香蕉品种根系抗氧化能力的影响 [J], 韦弟;韦绍龙;韦莉萍;周维;覃柳燕;黄素梅;田丹丹;李朝生;龙盛风;何章飞5.香蕉枯萎病菌对不同抗性香蕉品种根系抗氧化能力的影响 [J], 韦弟;韦莉萍;周维;覃柳燕;黄素梅;田丹丹;李朝生;龙盛风;何章飞;韦绍龙因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
农杆菌介导的香蕉枯萎病菌4号生理小种转化体系的优化高剑;肖苏生;王文华;曾涛;曾会才【期刊名称】《基因组学与应用生物学》【年(卷),期】2009()6【摘要】香蕉枯萎病是世界范围内香蕉种植区最为严重的病害之一,严重威胁和影响着香蕉产业的发展。
本文针对香蕉枯萎病病原菌的4号生理小种,建立了农杆菌介导的转化体系,确定了影响转化效率主要因子的优化体系是:农杆菌在IM培养基诱导前农杆菌OD600为0.15、农杆菌经IM液体培养基诱导的时间为7h、乙酰丁香酮(AS)浓度为150μmol/L、Focr4孢子浓度为1×106个/mL、共培养时间为48h、培养温度为25℃、诱导培养基pH值为5.5。
在此条件下,转化效率能达到700～800个转化子/106个香蕉枯萎病菌孢子。
PCR验证表明外源的T-DNA已经成功随机地整合到该病原菌基因组中。
目前,应用该转化体系已获得2300多个转化子,为后续克隆相关致病基因打下了良好基础。
【总页数】7页(P1197-1203)【关键词】香蕉枯萎病;4号生理小种;T-DNA插入;优化体系【作者】高剑;肖苏生;王文华;曾涛;曾会才【作者单位】中国热带农业科学院热带生物技术研究所,农业部热带作物生物技术重点开放实验室【正文语种】中文【中图分类】S436.68;Q93【相关文献】1.根癌农杆菌介导的香蕉枯萎病1号生理小种遗传转化体系的优化 [J], 戴青冬;毛超;郭立佳;杜和禾;汪军;潘江禹;黄俊生2.香蕉枯萎病菌4号生理小种农杆菌介导遗传转化体系的建立及T-DNA插入突变体的筛选 [J], 毛超;戴青冬;汪军;刘一贤;杨腊英;郭立佳;黄俊生3.香蕉枯萎病菌4号生理小种农杆菌介导遗传转化体系的建立及T—DNA插入突变体的筛选 [J], 毛超;戴青冬;汪军;刘一贤;杨腊英;郭立佳;黄俊生;4.香蕉枯萎病菌1号生理小种遗传转化体系的建立 [J], 林妃;曾涛;曾会才5.农杆菌介导的棉花枯萎病菌转化体系的优化 [J], 刘叶;阿依保他·托合达白;郭楠楠;柳自清;张博然;朱琦;顾爱星因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
香蕉抗枯萎病生理生化基础的研究香蕉镰刀菌枯萎病是一种由土壤真菌引起的毁灭性病害,特别是香蕉枯萎病4号生理小种目前正严重危害世界香蕉的生产,从而引起广泛关注。
本试验以金手指(抗病)、威廉斯芽变(抗病)、1282(耐病)、威廉斯(感病)、天宝(感病)5个不同抗性香蕉品种(系)为试材,研究接种枯萎病菌后各香蕉品种(系)假茎部位发生的生理生化变化,以初步探讨香蕉抗枯萎病的生理生化机制。
结果如下:1、香蕉各品种(系)在生长发育阶段4中防御酶(PPO、POD、PAL、SOD)及β-1,3葡聚糖酶的酶活性变化不大处在动态平衡之中。
2、抗病品种(系)在接菌处理后多酚氧化酶(PPO)活性普遍增强。
而感病品种(系)多酚氧化酶(PPO)变化缓慢。
被枯萎病菌感染后香蕉抗病品种(系)多酚氧化酶(PPO)活性极显著高于感病品种(系)。
多酚氧化酶(PPO)初步认为参与了香蕉抗枯萎病反应。
3、接种枯萎病菌后,香蕉各品种(系)苯丙氨酸解氨霉(PAL)和过氧化物酶(POD)活性均上升。
抗病品种(系)的苯丙氨酸解氨霉(PAL)和过氧化物酶(POD)活性增高的速度和峰值都大于感病品种。
说明香蕉品种(系)接种后PAL和POD活性变化与香蕉枯萎病菌的抗性之间有密切关系。
4、接种枯萎病菌后不同抗感品种(系)香蕉超氧化物歧化酶(SOD)活性均受影响。
在接菌处理后,抗病品种SOD活性有提高,而感病品种(系)SOD酶活性无规律。
所以SOD酶是否参与了香蕉抗枯萎病的反应还有待于进一步研究。
5、抗感品种(系)未接种处理的β-1,3葡聚糖酶活性差异不大,但在接菌处理后,β-1,3葡聚糖酶活性均发生变化。
都是先下降,后上升趋势。
但抗病品种(系)的β-1,3葡聚糖酶活性上升的速度和幅度显著高于感病品种(系)。
可以初步认为β-1,3葡聚糖酶参与香蕉对枯萎病的抗病反应。
6、香蕉各品种(系)在生长发育阶段木质素含量有明显差异,抗病品种(系)高于感病品种(系)。
枯萎病能诱导香蕉假茎中木质素的积累,但其诱导的速度和强度在抗病品种(系)和感病品种(系)间有明显差异。
54卷香蕉枯萎病拮抗菌的筛选鉴定及其防病效果测定杨迪1，杜婵娟1，张晋1，潘连富1，叶云峰2*，付岗1*（1广西农业科学院植物保护研究所/农业农村部华南果蔬绿色防控重点实验室/广西作物病虫害生物学重点实验室，广西南宁530007；2广西农业科学院园艺研究所，广西南宁530007）摘要：【目的】从不同作物的根围土壤中分离筛选香蕉枯萎病菌拮抗菌，对拮抗菌进行鉴定并测定其防病效果，以期为香蕉枯萎病的生物防治提供新的菌种资源。
【方法】以尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种（Fusarium oxysporum f.sp.cubense 4，Foc4）Foc 1402菌株为对象，采用稀释涂布法对不同作物根围土壤中的细菌进行分离，并使用平板对峙法和牛津杯法筛选其中的香蕉枯萎病拮抗菌。
根据细菌菌落形态、生理生化特征结合16S rDNA 序列分析对拮抗菌进行分类鉴定。
使用威廉斯B6香蕉杯苗测定拮抗菌对香蕉枯萎病的盆栽防治效果。
【结果】从不同作物根围分离获得345株细菌，从中筛选获得7株对香蕉枯萎病菌具有较强拮抗活性的菌株，抑菌率最高可达72.65%。
依据形态学观察、生理生化反应和16S rDNA 序列分析结果，菌株Ba02、Ba310、Ba48、Ba62和Ba63被鉴定为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens ），菌株Bc11被鉴定为洋葱伯克霍尔德氏菌（Burkholderia cepacia ），菌株Pt05被鉴定为土地类芽孢杆菌（Paenibacillus terrae ）。
盆栽试验结果显示，7株拮抗细菌对香蕉枯萎病的防治效果在20.00%~68.89%，其中以菌株Bc11的防治效果最好，为68.89%。
【结论】从不同作物的根围土壤中筛选获得7株对Foc 具有较强拮抗活性的细菌，其中，土地类芽孢杆菌为香蕉枯萎病生防菌家族的新成员。
筛选获得的不同种类拮抗菌可作为研制香蕉枯萎病生防菌剂的候选菌株资源，在后续开发抗病复合菌剂方面具有良好的应用前景。
